重组PRRS病毒HV-nsp29及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组PRRS病毒HV-nsp29，该重组PRRS病毒的基因组cDNA序列为将序列表序列1自5’末端第1474—2055位的序列替换为序列表序列2自5’末端第814—1395位的序列；将序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列替换为序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列得到的。与野生型PRRSV高致病毒株HV相比，该重组PRRS病毒在PAM上生长的速度明显下降，在猪体内的致病力明显减弱。经其免疫后的小猪再次感染不同PRRS病毒后，精神状态良好，食欲正常，且体内PRRS病毒量显著低于未经免疫的小猪，说明该重组PRRS病毒可以开发为弱毒疫苗毒株。
【专利说明】重组PRRS病毒HV-nsp29及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组PRRS病毒HV-nsp29及其应用。
【背景技术】
[0002] 在生物体中，每种氨基酸至少对应一个密码子，最多的有六种对应的密码子， 编码同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。研究表明，生物体内普遍存在同义密码子 非均衡使用的现象，例如：某一物种或某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义 密码子，这些密码子被称为最优密码子（optimal codon)，此现象被称为密码子偏好性 (codon bias)。同样的，密码子对的使用也有偏好性，但是密码子对的偏好性并不依赖于密 码子的偏好性。例如，精氨酸（arginine, Arg)可以被六种密码子编码，谷氨酸（glutamic acid, Glu)可以被两种密码子编码，所以氨基酸对Arg-Glu可以被十二种同义密码子对编 码，如果根据密码子的偏好性计算每个同义密码子对在人类基因组中的出现次数，那么理 论上密码子对CGC-GAA的出现次数为2, 397次，但实际只出现了 268次，所以CGC-GAA在人 类基因组中是非偏好性密码子对；而密码子对AGA-GAA编码Arg-Glu的理论次数是2, 644 次，但其实际出现次数则是4, 195次，因此AGA-GAA是人类基因组中的偏好性密码子对。
[0003] 尽管到目前为止人们并不清楚密码子对偏好性的形成原因，但是密码子对的使用 却是可以影响翻译效率的。2008年，Coleman等人把脊髓灰质炎病毒（poliovirus)的核 衣壳（capsid)基因进行了突变，在不改变氨基酸序列及RNA二级结构的前提下，在基因内 进行同义密码子置换，使得偏好性的密码子对被置换为非偏好性的密码子对，化学合成突 变后的片段，然后利用反向遗传学手段将合成的片段连入病毒全长cDNA克隆，这种致弱病 毒的方法称为合成病毒致弱工程（synthetic attenuated virus engineering, SAVE)。置 换后病毒capsid基因的翻译速率显著下降，并且含有突变序列的重组病毒在体外细胞上 的复制能力和在小鼠中的致病力都明显降低，在攻毒试验中，重组病毒能够有效的保护野 生型毒株对于免疫小鼠的再次感染。这种病毒弱化的方法具有广泛的应用性，2010和2013 年，分别有人用同样的方法改造了流感病毒，获得了致弱效果明显的流感病毒弱毒株。最重 要的是，在这种致弱病毒的工程中，病毒的弱化是由成百上千个点突变引起的，因此其发生 返强的可能性极低。
[0004] 猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syn -drome, 简称PRRS)，俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductive and respiratory syndrome viruse，PRRSV)引起的一种高发病率、高死亡率、低治愈率的猪病。 目前，世界上广泛使用商品化的PRRS疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗。灭活的PRRSV疫苗没 有效果或者是只能对同源毒株的感染提供有限的保护；弱毒疫苗持续散播病毒，尤其有回 复突变以致毒力返强的可能性，弱毒疫苗的返强性一直是人们担心的一个安全问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种可以作为弱毒疫苗毒株的重组PRRS病毒。
[0006] 本发明要求保护的重组PRRS病毒HV-nsp29,其基因组对应的cDNA序列为将序列 表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列替换为序列表序列2自5'末端第814 -1395 位的序列；将序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替换为序列表序列3自5'末 端第158- 2002位的序列所获得的序列。
[0007] 序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列为序列表序列2自5'末端第 814-1395位的序列；序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列为序列表序列3自 5'末端第158- 2002位的序列的DNA片段，也是本发明需要保护的；
[0008] 同时，含有该片段的重组质粒、重组菌或重组细胞，也是本发明需要保护的。具 体地说，所述重组质粒为将质粒pcDNA3. I-HV中对应于序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的DNA片段替换为序列表序列2自5'末端第814-1395位的DNA片段，将质粒 pcDNA3. I-HV中对应于序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替换为序列表序列 3自5'末端第158- 2002位的序列得到的质粒。质粒pcDNA3. I-HV是将序列表中的序列1 所示的HV毒株的基因组全长序列克隆到了真核表达载体pcDNA3. 1中得到的。
[0009] 上述重组质粒在制备重组PRRS病毒HV-nsp29或PRRS疫苗中的应用，以及重组 PRRS病毒HV-nsp29在制备PRRS疫苗中的应用，也是本发明需要保护的内容。
[0010] 实验证明，将野生型PRRSV高致病毒株HV基因组的全长CDNA克隆中对应于序列 表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列改造为序列表序列2自5'末端第814 -1395 位，将野生型PRRSV高致病毒株HV基因组的全长cDNA克隆中对应于序列表序列1自5'末 端第7683- 9527位的序列改造为序列表序列3自5'末端第158- 2002位后获得的重组病 毒HV-nsp29,与野生型PRRSV高致病毒株HV相比，在PAM (猪肺泡巨噬细胞)上生长的速度 均明显下降。重组PRRS病毒HV-nsp29在猪体内的致病力明显减弱，且经HV-nsp29免疫后 的小猪再次感染不同PRRS病毒后，小猪的精神状态良好，食欲正常，健康，且体内PRRS病毒 量显著低于未经免疫的小猪，说明本发明所提供的重组PRRS病毒可以开发为弱毒疫苗毒 株。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为重组PRRS病毒感染猪PAM细胞后不同时间的病毒滴度结果。
[0012] 图2为重组PRRS病毒感染猪PAM细胞后84小时诱导的细胞病变结果。
[0013] 图3为接种HV-wt或HV-nsp29后小猪的直肠温度变化。
[0014] 图4为接种HV-wt或HV-nsp29后小猪的存活率变化。
[0015] 图5为接种HV-wt或HV-nsp29后小猪血清中PRRS病毒滴度变化。
[0016] 图6为实时荧光定量PCR检测接种HV-wt或HV-nsp29两周后小猪各组织的中PRRS 病毒滴度变化。
[0017] 图7为接种HV-Wt或HV-nsp29两周后小猪部分组织切片的苏木精一伊红染色结 果。
[0018] 图8为免疫HV-nsp29和未免疫的小猪在接种不同PRRS病毒后的存活率变化。
[0019] 图9为免疫HV-nsp29和未免疫的小猪在接种不同PRRS病毒后的直肠温度变化。
[0020] 图10为免疫HV-nsp29和未免疫的小猪在接种不同PRRS病毒后血清中PRRS病毒 滴度变化。
[0021] 图11为实时荧光定量PCR检测免疫HV-nsp29和未免疫的小猪在接种不同PRRS 病毒两周后小猪各组织的中PRRS病毒滴度变化。
[0022] 图12为免疫HV-nsp29和未免疫的小猪血清中和抗体滴度变化。
[0023] 图13为流式细胞仪检测不同PRRS毒株对免疫HV-nsp29和未免疫的小猪淋巴细 胞进行再刺激后的INF γ和DC8+的水平。
[0024] 图14为在PAM细胞上对HV-nsp29连续传代过程中观察细胞病变的部分结果。其 中，pi、PlO和p20分别代表第1、10和20代。
[0025] 图15为第1代、第10代和第20代的HV-nsp29中的nsp2和nsp9基因的CPB值。 其中，pl、pl0和p20分别代表第1、10和20代。
【具体实施方式】
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 下述实施例中所用的野生型PRRSV高致病毒株HV :Genbank号为JX317648,公众 可从中国农业大学获得。
[0029] 下述实施例中的实验数据如无特殊说明，均为三次重复的平均值，并用t检测进 行统计学分析，当P〈〇. 05时差异显著。
[0030] 下述实施例中基因的CPB值等于基因内每个密码子对的CPS值的算术平均值，公 式为：。
【权利要求】
1. 一种重组PRRS病毒，其特征在于：该重组PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列为将 序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列替换为序列表序列2自5'末端第814- 1395位的序列；且将序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替换为序列表序列3 自5'末端第158- 2002位的序列所获得的序列。
2. 权利要求1所述病毒在制备PRRS疫苗中的应用。 3. DNA片段，其序列是将序列表序列1自5'末端第1474-2055位的序列替换为序列 表序列2自5'末端第814-1395位的序列；且将序列表序列1自5'末端第7683- 9527位 的序列替换为序列表序列3自5'末端第158- 2002位的序列得到的。
4. 权利要求3所述DNA片段在制备权利要求1所述重组PRRS病毒中的应用。
5. 权利要求3所述DNA片段在制备PRRS疫苗中的应用。
6. 含有权利要求3所述DNA片段的重组质粒、重组菌或重组细胞。
7. 根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为将质粒pcDNA3. 1-HV 中对应于序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的DNA片段替换为序列表序列2自5'末 端第814-1395位的序列；将质粒pcDNA3. 1-HV中对应于序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替换为序列表序列3自5'末端第158- 2002位的序列。
8. 权利要求6或7所述重组质粒在制备权利要求1所述重组PRRS病毒中的应用。
9. 权利要求6或7所述重组质粒在制备PRRS疫苗中的应用。
【文档编号】C12N15/79GK104419687SQ201310394862
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】封文海, 高丽, 杨丙田, 王良海, 郭雪坤, 余志彬, 刘翼浩, 陈鑫鑫, 郑世军, 唐军 申请人:中国农业大学