弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基及发酵方法
【专利摘要】本发明涉及一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基和发酵方法，其摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。本发明通过优化其培养基配方，从而解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现泰乐菌素稳定、高效的生产。同时利用该培养基可提高发酵单位、缩短发酵周期、减少一级种子接种量、提高泰乐菌素A组分。
【专利说明】弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基及发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵【技术领域】，特别是涉及一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基及发酵方法。
【背景技术】
[0002]泰乐菌素是由放线菌属弗氏链霉菌经发酵提取而得到的一种大环内酯类抗生素，主要作为动物专用抗生素。
[0003]目前，国内生产泰乐菌素的方法主要是三级发酵模式，采用弗氏链霉菌作为菌种，传统培养基中氮源主要有2种模式:一种是以鱼粉、玉米浆、花生饼粉和酵母粉组成的动物性氮源，一种是以花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆和酵母粉组成的植物性氮源。上述培养基存在的主要问题是:
[0004]I泰乐菌素种子、发酵培养基中有机氮源的组成成分有4种，增加了企业的采购成本。
[0005]2 一级种子接种量较多。常规的一级种子培养的接种量为5~10L/m3，增加了菌种研究人员的工作强度。
[0006]3泰乐菌素的种子培养和发酵周期较长，两次种子培养的周期超过了 60h，发酵周期超过了 160h。
[0007]4动物性氮源鱼粉的质量影响发酵液质量和发酵效果。目前，国内生产的鱼粉都是混合鱼粉，鱼粉中含有动物骨粉、羽毛粉等，影响了发酵液的质量和发酵效果。另外，购买纯鱼粉的价格较高，而且容易受到休渔期的影响，增加采购成本和生产成本。
[0008]5泰乐菌素发酵单位低，关键组分泰乐菌素A含量低。
[0009]6泰乐菌素的生产成本较高，其中氮源的成本占到发酵成本的20%左右。
【发明内容】
[0010]本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位，缩短发酵周期，同时最大限度的降低原辅料用量，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现泰乐菌素稳定、高效地生产的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基。
[0011]本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产泰乐菌素的发酵方法。
[0012]为实现上述目的所采取的技术方案为:
[0013]—种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，包括摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有啤酒酵母菌渣和蚯蚓粉。
[0014]上述摇瓶种子培养基组成为:豆油或玉米油3~6ml/L、啤酒酵母菌渣5~IOg/L、虫丘蝴粉4~8g/L、玉米衆干粉2~5g/L、硫酸镁2~3g/L、硫酸铁I~3g/L、轻质碳酸钙2~4g/L、硫酸铵2~4g/L。[0015]上述一级种子培养基的组成为:豆油或玉米油20~30ml/L、啤酒酵母干渣25~35g/L、虫丘虫引粉15~20g/L、玉米衆3~6g/L、磷酸二氢钾0.3~0.4g/L、轻质碳酸?丐2~4g/L、硫酸铵3~6g/L。
[0016]上述二级种子培养基的组成为:豆油或玉米油25~35ml/L、啤酒酵母干渣30~40g/L、虫丘虫引粉20~25g/L、玉米衆5~10g/L、磷酸二氢钾0.5~0.8g/L、轻质碳酸?丐3~5g/L、硫酸铵3~5g/L。
[0017]上述发酵培养基的组成为:豆油或玉米油30~40ml/L、啤酒酵母干渣35~45g/L、虫丘蝴粉30~35g/L、玉米衆10~15g/L、磷酸二氢钾0.8~1.2g/L、轻质碳酸钙6~8g/L、硫酸铵5~8g/L、氯化钠4~6g/L、硫酸镁4~6g/L、硫酸铁3~5g/L、复合型甜菜碱20 ~30g/L。
[0018]所述啤酒酵母干渣质量要求为:
[0019]蛋白质含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≤5% ;灰分≤5% ;碳水化合物≥12% ；干渣颗粒通过60目筛的数量≥80%。
[0020]所述蚯蚓粉质量要求为:蛋白质含量≥60% ;水分≤10% ;粒度能通过80目筛。
[0021]一种弗氏链霉菌利用上述培养基发酵生产泰乐菌素的发酵方法，其工艺步骤包括:首先将已制备好的斜面孢子接入摇瓶培养基中进行摇瓶培养，至菌体浓度10~15%、pH值6~8时按照I~2L/m3接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度15~25%、pH值6~8时转移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度30~40%、pH值6~8时转移至发酵培养基中进行发酵培养，待发酵单位在15000u/ml以上且每6~8h检测时前、后检测的发酵单位相差在300u/ml以内、菌体浓度30~40%、pH值6~
7、周期25~30h时终止发酵。
[0022]所述摇瓶培养的条件为:将种子瓶置于200~240r/min摇瓶机上振荡培养40~48h，培养温度28~30°C，相对湿度35~45%。
[0023]所述一级种子培养条件为:
[0024]I)罐压:控制在 0.04 ~0.06MPa,
[0025]2)罐温:发酵前5h，罐温控制在30~31°C ；6h至一级种子培养结束，罐温控制在29 ~30?，
[0026]3)空气流量:0~5h，5~IOmVh ；6h至一级种子培养结束:15~20m3/h，
[0027]4) pH 控制在 7 ~8，
[0028]5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌，转速控制在60r/min,
[0029]6) 一级种子培养时间15~20h。
[0030]所述二级种子培养条件为:
[0031 ] I)罐压控制在 0.04 ~0.06MPa,
[0032]2)罐温:发酵前5h，罐温控制在30~31°C ；6h至二级种子培养结束，罐温控制在29 ~30?，
[0033]3)空气流量:0~5h，20~25m3/h ；6h至二级种子培养结束:30~40m3/h，
[0034]4) pH 控制在 7 ~8，
[0035]5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌；6h至一级种子培养结束:启动机械搅拌，转速控制在80r/min,
[0036]6) 二级种子培养时间:20~25h。
[0037]所述发酵培养条件为:
[0038]a脂肪控制:发酵培养基灭菌后脂肪控制在3~5% ；
[0039]b发酵开始~组分转化前:培养温度30~31°C、搅拌转速100r/min ；
[0040]c组分转化开始~发酵结束:温度36~38°C、转速150r/min ；
[0041]d发酵周期:培养时间130~150h ；
[0042]6压力控制:罐压0.05~0.0610^;
[0043]f pH控制:发酵过程中pH6.0~7.5 ;
[0044]g无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
[0045]h空气流量:0h~组份开始转化前:150~200m3/h ;组份转化开始~发酵结束:300 ~500m3/h。
[0046]在发酵过程中进行补料，包括补油、补水、补酸或碱和补氮源，其中
[0047]a补油控制:采用流加法补豆油或玉米油，
[0048]发酵前35h不用进行补油，
[0049]36h~IOOh:如果脂肪含量低于2.5%，补入油；如果脂肪含量超过3%，则停止补油，
[0050]IOlh至组份转化开始:如果脂肪含量低于0.8%，补入油；如果脂肪含量超过1.5%，则停止补油，
[0051]组分转化~发酵结束，每隔4~6h检测发酵液脂肪含量，当发酵液脂肪含量
<0.3%，进行补油，肪含量超过0.5%停止补油；
[0052]b 补水:
[0053]发酵前30h不用进行补水，
[0054]30h~80h:当发酵液菌体浓度< 40%，控制菌体浓度40~50%，
[0055]81h至发酵结束:当发酵液菌体浓度< 30%，采用流加法补水，控制菌体浓度30~40% ；
[0056]c补酸或碱:
[0057]发酵前25h，pH不进行控制，
[0058]用酸或碱控制发酵26h至组份开始转化前的pH6~7.5，组份转化期间~发酵结束PH6~7，所述酸为质量浓度为20~30%的硫酸铵溶液，碱为质量浓度为20%的氢氧化钠溶液；
[0059]d补入氮源:在发酵周期分别在40h、60h、80h和IOOh时补入氮源，其补入量为发酵液体积的I~1.5%，所述氮源为20%的啤酒酵母菌渣和15%的蚯蚓粉的混合水溶液。
[0060]本发明的技术优势为:
[0061]1)发酵成本低。首先啤酒酵母干渣、蚯蚓粉由于产量较大，市场价格较低，便于采购，其次使用啤酒酵母干渣、蚯蚓粉代替了常规种子培养基、发酵培养基中的氮源，减少氮源的种类和用量，降低了 20%以上的生产成本，减少因氮源质量影响种子液和发酵液质量的不利因素。
[0062]2)缩短泰乐菌素发酵生产周期。本发明的发酵工艺的生产周期控制在(包括种子培养周期和发酵周期)200h以内，同常规工艺相比，生产周期缩短了 10%以上。
[0063]3)减少一级种子培养的接种量。使用一级种子培养基的新配方，其接种量为IL/m3，而常规工艺的接种量在5L以上，接种量减少了 60%以上。
[0064]4)本发明泰乐菌素发酵液中的氨基酸含量较高。试验过程中，发现泰乐菌素发酵所需的前体物质主要是谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸。根据相关文献报道，泰乐菌素发酵过程中，蛋白质和氨基酸对其产量和组分影响较大，本发明培养基中的蛋白质含量达到55%以上，氨基酸含量明显高于常规种子培养基配方，有利于改善弗氏链霉菌菌丝形态；提高种子培养和发酵液的质量。
[0065]不同原辅料的氨基氮含量对比表
[0066]
【权利要求】
1.一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，包括摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有啤酒酵母菌渣和蚯蚓粉。
2.按照权利要求1所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，其特征在于上述摇瓶种子培养基组成为:豆油或玉米油3~6ml/L、啤酒酵母菌洛5~lOg/U丘蝴粉4~8g/L、玉米楽；干粉2~5g/L、硫酸镁2~3g/L、硫酸铁I~3g/L、轻质碳酸韩2~4g/L、硫酸铵2~4g/L。
3.按照权利要求1所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，其特征在于上述一级种子培养基的组成为:豆油或玉米油20~30ml/L、啤酒酵母干渣25~35g/L、蚯蚓粉15~20g/L、玉米衆3~6g/L、磷酸二氢钾0.3~0.4g/L、轻质碳酸?丐2~4g/L、硫酸铵3~6g/L。
4.按照权利要求1所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，其特征在于上述二级种子培养基的组成为:豆油或玉米油25~35ml/L、啤酒酵母干渣30~40g/L、蚯蚓粉20~25g/L、玉米衆5~10g/L、磷酸二氢钾0.5~0.8g/L、轻质碳酸|丐3~5g/L、硫酸铵3~5g/L。
5.按照权利要求1所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，其特征在于上述发酵培养基的组成为:豆油或玉米油30~40ml/L、啤酒酵母干渣35~45g/L、蚯蚓粉30~35g/L、玉米衆10~15g/L、磷酸二氢钾0.8~1.2g/L、轻质碳酸钙6~8g/L、硫酸铵5~8g/L、氯化钠4~6g/L、硫酸镁4~6g/L、硫酸铁3~5g/L、复合型甜菜碱20~30g/L。
6.按照权利要求1、2、3、4或5所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，其特征在于所述啤酒酵母干渣质量 要求为: 蛋白质含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分< 5% ;灰分< 5% ;碳水化合物≥12% ;干渣颗粒通过60目筛的数量>80%。
7.按照权利要求1、2、3、4或5所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，其特征在于所述蚯蚓粉质量要求为:蛋白质含量> 60% ;水分< 10% ;粒度能通过80目筛。
8.一种弗氏链霉菌利用权利要求2至5任意一项培养基发酵生产泰乐菌素的发酵方法，其工艺步骤包括:首先将已制备好的斜面孢子接入摇瓶培养基中进行摇瓶培养，至菌体浓度10~15%、pH值6~8时按照I~2L/m3接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度15~25%、pH值6~8时转移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度30~40%、pH值6~8时转移至发酵培养基中进行发酵培养，待发酵单位在15000u/ml以上且每6~8h检测时前、后检测的发酵单位相差在300u/ml以内、菌体浓度30~40%、周期25~30h时终止发酵。
9.按照权利要求8所述的发酵方法，其特征在于所述摇瓶培养的条件为:将种子瓶置于200~240r/min摇瓶机上振荡培养40~48h，培养温度28~30°C，相对湿度35~45%。
10.按照权利要求8所述的发酵方法，其特征在于所述一级种子培养条件为: 1)罐压:控制在0.04~0.06MPa, 2)罐温:发酵前5h，罐温控制在30~31°C;6h至一级种子培养结束，罐温控制在29~30。。， 3)空气流量:0~5h，5~10m3/h；6h至一级种子培养结束:15~20m3/h，4)pH控制在7~8， 5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌，转速控制在 60r/min,
6)一级种子培养时间15~20h。
11.按照权利要求8所述的发酵方法，其特征在于所述二级种子培养条件为: 1)罐压控制在0.04~0.06MPa， 2)iig温:发酵如5h, iig温控制在30~31 C ；6h至二级种子培养结束，温控制在29~30。。， 3)空气流量:0~5h，20~25m3/h；6h至二级种子培养结束:30~40m3/h， 4)pH控制在7~8， 5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌；6h至一级种子培养结束:启动机械搅拌，转速控制在80r/min,
6)二级种子培养时间:20~25h。
12.按照权利要求8所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为: a脂肪控制:发酵培养基灭菌后脂肪控制在3~5% ； b发酵开始~组分转化前:培养温度30~31°C、搅拌转速100r/min ； c组分转化开始~发酵结束:温度36~38°C、转速150r/min ； d发酵周期:培养时间130~150h ； e压力控制:罐压0.05~0.06MPa ； f pH控制:发酵过程中ρΗ6.0~7.5 ; g无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌； h空气流量:0h~组份开始转化前:150~200mVh ;组份转化开始~发酵结束:300~500m3/h。
13.按照权利要求8所述的发酵方法，其特征在于在发酵过程中进行补料，包括补油、补水、补酸或碱和补氮源，其中 a补油控制:采用流加法补豆油或玉米油， 发酵前35h不用进行补油， 36h~IOOh:如果脂肪含量低于2.5%，补入油；如果脂肪含量超过3%，则停止补油，IOlh至组份转化开始:如果脂肪含量低于0.8%，补入油；如果脂肪含量超过1.5%，则停止补油， 组分转化~发酵结束，每隔4~6h检测发酵液脂肪含量，当发酵液脂肪含量< 0.3%，进行补油，肪含量超过0.5%停止补油；b补水: 发酵前35h不用进行补水， 36h~80h:当发酵液菌体浓度< 40%，控制菌体浓度40~50%， 81h至发酵结束:当发酵液菌体浓度< 30%，采用流加法补水，控制菌体浓度30~40% ； c补酸或碱: 发酵前25h，pH不进行控制， 用酸或碱控制发酵26h至组份开始转化前的pH 6~7.5，组份转化期间~发酵结束pH`6~7，所述酸为质量浓度为20~30%的硫酸铵溶液，碱为质量浓度为20%的氢氧化钠溶液； d补入氮源:在发酵周期分别在40h、60h、80h和IOOh时补入氮源，其补入量为发酵液体积的I~1.5%，所述氮源为20%的啤酒酵母菌渣和15%的蚯蚓粉的混合水溶液。
【文档编号】C12P19/62GK103484514SQ201310440355
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】任勇, 王 义, 奇乃, 董媛, 李小萍 申请人:宁夏泰瑞制药股份有限公司