一种采用响应面法提高基因工程菌c102产酶能力方法
【专利摘要】本发明公开一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、pH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响，确定以酵母氮源含量、pH值和甲醇含量作为响应面优化的基本条件，在30℃，200r／min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g／L，氮源采用酵母氮源含量为5-9g／L，甲醇含量为7-11g／L，pH值为5.5-6.5，低温脂肪酶酶活比优化前产酶活力28.0IU／ml提高了50.9％。表明使用本发明提供响应面法优化发酵条件可显著提高基因工程菌株C102的产低温脂肪酶的产酶能力，具有广泛的实用性。
【专利说明】一种采用响应面法提高基因工程菌Cl02产酶能力方法
发明领域
本发明属于制备微生物发酵【技术领域】，具体的，本发明涉及一种提高基因工程菌产酶能力的【技术领域】。
【背景技术】 脂肪酶是广泛应用于食品、医药以及皮革等轻工业的一种特殊的酯键水解酶，能够在水相和非水相界面催化长链甘油三酯水解[I]。低温脂肪酶具有较低的最适酶活温度(<40°C )，以及在低温下保持较高酶活的能力[2]，因而在食品、医药、环境和精细化工等诸多领域的低温生物催化方面具有很高的应用价值[3-5]。
目前已知的低温脂肪酶生产菌株主要为极地地区、高山以及深海等低温环境中的嗜冷菌，包括无色杆菌属、气单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属等细菌和曲霉属、假丝酵母属、白地霉属、青霉、根霉等真菌[6]，而有研究者认为，使用基因工程菌生产脂肪酶将成为未来的主要发展方向，因为工程菌将实现为特定应用领域生产适合的具有显著特性的脂肪酶
[7]。Feller等[8]最早从南极嗜冷菌莫拉菌属(Moraxella) TA144中分离克隆了 3种低温脂肪酶基因，并在E.coli中表达，随后，多种不同来源的低温脂肪酶基因获得了克隆和表达，如Kim等[9]从活性污泥基因组中克隆、分离得到一类新的细菌来源的低温碱性脂肪酶LipEH166 ； ；Zhang[10]等在大肠杆菌中表达了从冰川土壤中分离的鲍曼不动杆菌XMZ-26的低温脂肪酶基因；王永杰等[11]在巴斯德毕赤酵母中表达了南极嗜冷菌Psychrobactersp.低温脂肪酶基因Iip- 948。但有关低温脂肪酶工程菌的发酵优化的研究较少。
【发明内容】
针对现有技术中有关低温脂肪酶工程菌的发酵优化的研究较少的技术现状。本发明为了提供一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，采用响应面法优化已公开的低温脂肪酶基因工程菌C102产低温脂肪酶的发酵条件，以期提高低温脂肪酶的产量，为该基因工程菌产脂肪酶的工业化生产奠定基础。
本发明的技术方案:
本发明为了提高基因工程菌毕赤酵母C102表达低温脂肪酶酶活水平，通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、PH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响，确定以酵母氮源含量、pH值和甲醇含量作为响应面优化的基本条件。利用Design-Expert软件，以低温脂肪酶酶活为响应值，对培养基的组成和产酶条件进行了优化，得出优化产酶条件为:酵母氮源含量7.3g / L、pH值6.0、甲醇含量9.1g / L，在此培养条件下，低温脂肪酶酶活达到42.25IU / ml，比优化前产酶活力28.0IU / ml提高了 50.9%。说明使用响应面法优化发酵条件可显著提高基因工程菌株C102的产低温脂肪酶的产酶能力，此结果为规模化生产低温脂肪酶奠定了基础。
具体的，本发明提供一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，在30°C,200r / min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g / L，氮源采用酵母氮源含量为5-9g / L，甲醇含量为7-llg / L，pH值为5.5-6.5，其他发酵培养条件都为本领域常见工序和技术参数，对基因工程菌C102产低温脂肪酶活性的影响最大。
进一步，本发明提供一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，在30°C,200r / min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g / L，氮源采用酵母氮源含量为7.3g / L，甲醇含量为9.1g / L，pH值为6.0，其他发酵培养条件都为本领域常见工序和技术参数，在此培养条件下，低温脂肪酶酶活达到42.25IU / ml,比优化前产酶活力28.0IU / ml提高了 50.9%，对基因工程菌C102产低温脂肪酶活性的影响最大。
本发明采用的基因工程菌C102为一种已公开的基因工程菌的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得。
通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下有益效果。
本发明通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、PH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响，确定以酵母氮源含量、PH值和甲醇含量作为响应面优化的基本条件，以低温脂肪酶酶活为响应值，对培养基的组成和产酶条件进行了优化，得出优化产酶条件为:酵母氮源含量7.3g / L、pH值6.0、甲醇含量9.1g / L，在此培养条件下，低温脂肪酶酶活达到42.25IU / ml，比优化前产酶活力28.0IU / ml提高了 50.9%。说明使用响应面法优化发酵条件可显著提高基因工程菌株C102的产低温脂肪酶的产酶能力，此结果为规模化生产低温脂肪酶奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
图1甘油含量对低温脂肪酶酶活的影响图。
图2酵母氮源含量对低温脂肪酶酶活的影响图。
图3甲醇含量对低温脂肪酶酶活的影响图。
图4pH对低温脂肪酶酶活的影响图。
图5酵母氮源含量、pH值及其交互作用对低温脂肪酶酶活的响应面图。
图6酵母氮源含量、pH值及其交互作用对低温脂肪酶酶活的等高线图。
图7酵母氮源含量、甲醇含量及其交互作用对低温脂肪酶酶活的响应面图。
图8酵母氮源含量、甲醇含量及其交互作用对低温脂肪酶酶活的等高线图。
图9为pH、甲醇含量及其交互作用对低温脂肪酶酶活的响应面图。
图10为pH、甲醇含量及其交互作用对低温脂肪酶酶活的等高线图。
【具体实施方式】
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
菌种:产低温脂肪酶巴斯德毕赤酵母基因工程菌C102由新疆师范大学生命科学学院遗传实验室构建，一种已公开的基因工程菌的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得[12-13]。
培养基:基因工程菌C102菌种保藏和活化培养基YPD:含酵母提取物IOg / L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g / L;诱导表达培养基BMGY:含酵母提取物10g/L，蛋白胨20g / L，酵母氮源(yeast nitrogen base) 13.4g / L,生物素 4X10_4g / L,甘油 5g / L, IOOmM 憐酸钾缓冲液调节PH6.0 ;诱导表达培养基BMMY:含酵母提取物IOg / L，蛋白胨20g/L，酵母氮源13.4g / L，生物素4X10-4g / L，甲醇5g / L，IOOmM磷酸钾缓冲液调节pH6.0。
摇瓶培养:按照5%接种量(菌液浓度I X IO8个/ ml)将菌种接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，30°C，200r / min培养60~72h。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一:提高基因工程菌C102产酶能力的方法 通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、PH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响，确定以酵母氮源含量、PH值和甲醇含量作为响应面优化的基本条件。利用Design-Expert软件，以低温脂肪酶酶活为响应值，对培养基的组成和产酶条件进行了优化，得出优化产低温脂肪酶的条件:
在30°C，200r / min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g / L，氮源采用酵母氮源含量为5-9g / L，甲醇含量为7-llg / L，pH值为
5.5-6.5，其他发酵培养条件都为本领域常见工序和技术参数，对基因工程菌C102产低温脂肪酶活性的影响最大。
进一步，本发明提供一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，在30°C,200r / min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为
10.0g / L，氮源采用酵母氮源含量为7.3g / L，甲醇含量为9.1g / L，pH值为6.0，其他发酵培养条件都为本领域常见工序和技术参数，在此培养条件下，低温脂肪酶酶活达到42.25IU / ml，比优化前产酶活力28.0IU / ml提高了 50.9%，从而表明了上述因素对基因工程菌C102产低温脂肪酶活性的影响最大，使用响应面法优化发酵条件可显著提高基因工程菌株C102的产低温脂肪酶的产酶能力，此结果为规模化生产低温脂肪酶奠定了基础。
实施例二:工程菌产低温脂肪酶条件的优化
1.工程菌产低温脂肪酶条件的优化
(1)单因素试验:在30°C，200r/ min条件下培养工程菌72h，探讨培养基的碳源(甘油含量分别为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5g / L)、氮源(酵母氮源含量分别为3、5、7、9、115-9g / L)、甲醇含量(分别为 3、5、7、9、117-llg / L)和 pH 值(5.5-6.55.0、5.5、6.0、
6.5,7.0)对基因工程菌的低温脂肪酶活性的影响，以确定各因素的合适范围。
(2)单因素试验结果:
甘油含量的优化:检测结果显示，甘油含量超过5g / L，其含量继续增加对低温脂肪酶酶活的影响不明显，甘油含量达IOg / L时，酶活达最高，为29.0IU / ml，参见附图1。因此确定培养基的甘油含量为IOg / L。相对于其他因素，甘油含量对低温脂肪酶酶活的影响并不显著。
酵母氮源含量的优化:检测结果显示，随着酵母氮源含量的上升，低温脂肪酶酶活逐渐升高，当酵母氮源含量达7g / L时，酶活达最高，为33.5IU / ml，参见附图2。因此确定进一步试验的酵母氮源含量的范围为5-9g / L0
甲醇含量的优化:检测结果显示，随着甲醇含量的上升，低温脂肪酶酶活逐渐提高，当甲醇含量达9g / L时，酶活达最高，为34.1IU / ml，参见附图3。因此确定进一步试验的甲醇含量的范围为7-llg / L0
pH值的优化:检测结果显示，低温脂肪酶酶活在pH为6时达最高，为28.0IU / ml，参见附图4。因此确定进一步试验的pH值范围为5.5-6.5。
实施例三:工程菌产低温脂肪酶条件的优化
1.响应面试验:综合甘油含量、酵母氮源含量、pH值和甲醇含量对低温脂肪酶酶活的影响，选取3个主要因素(酵母氮源含量、pH值和甲醇含量)进行响应面试验，以低温脂肪酶酶活为指标，采用统计软件Des ign_Expert7.1中关于响应面(Response surfacemethodology,RSM)的部分对试验进行设计、分析和培养条件的优化。根据Box-Benheken中心组合试验设计原理，试验设计因素和水平见表1。以低温脂肪酶酶活为响应值，自变量取值为试验设计水平中值的为中心点试验，其他为非中心点试验，中心点试验重复5次，以估计试验误差。见表1
表1响应面分析因素与水平
【权利要求】
1.一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，其特征在于，在30°C，200r / min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为l0.0g /L，氮源采用酵母氮源含量为5-9g / L，甲醇含量为7-llg / L，pH值为5.5-6.5。
2.如权利要求1所述采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，其特征在于，在30°C，200r / min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g / L，氮源采用酵母氮源含量为7.3g / L，甲醇含量为9.1g / L，pH值为6.0。
【文档编号】C12N9/20GK103642770SQ201310656567
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】付建红, 汪世娟, 吕豪豪 申请人:新疆师范大学