一种检测小鼠ndrg2基因的特异性cRNA原位杂交探针及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测小鼠ndrg2基因的特异性cRNA原位杂交探针及其制备方法，其按照如下步骤进行：（1）根据NCBI网站GenBank数据库中小鼠ndrg2基因的序列，设计横跨编码区和3’-UTR的上、下游引物，此对引物扩增出636bp片段作为小鼠ndrg2基因的特异性探针序列；（2）构建ndrg2基因的cRNA原位杂交的探针质粒，转化细菌并进行培养扩增，之后对探针质粒进行测序鉴定；（3）制备ndrg2基因的cRNA原位杂交探针；（4）检测ndrg2基因cRNA探针的原位杂交。
【专利说明】—种检测小鼠ndrg2基因的特异性cRNA原位杂交探针及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测小鼠於基因的特异性cRNA原位杂交探针及其制备方法，属于生物医学及生物技术应用领域。
【背景技术】
[0002]/?基因即 Nnyc 下游调苄基因 2 (N-myc downstream-regulated gene 2),属于NDRG家族,该家族包括Ndrgl、Ndrg2、Ndrg3、Ndrg4四个成员。多项研究证明，Ndrg2在人类许多肿瘤组织中，如乳腺癌、肝癌、结直肠癌、恶性胶质瘤等表达明显降低或缺如，过表达Ndrg2则可抑制肿瘤的生长和转移，提示Ndrg2具有抑制肿瘤发生的作用。因此，目前多数学者认为Ndrg2是一种有效的抑癌候选分子。然而，最近研究表明Ndrg2亦高表达在正常的中枢神经系统中，对其生理功能、神经发生及疾病发生发挥重要的作用，这提示我们除了 Ndrg2的抑癌效应，对它功能的认识可能才刚刚开始。
[0003]在研究Ndrg2功能之前，必须明确Ndrg2在各个组织中的表达情况，因此特异性的抗体十分重要。然而，NDRG家族四个成员氨基酸序列的同源性十分高，达到了 57 - 65%。目前商品化的Ndrg2抗体或是针对Ndrg2氨基酸序列全长，或是针对其N端或C端，因此都或多或少的与NDRG家族的其他三个成员有一定的交叉反应。另一方面，在基因功能研究策略层面，转基因或基因修饰小鼠是目前研究的主要手段，也是今后研究的趋势。然而，目前的Ndrg2抗体主要是来源于人的Ndrg2抗原。因此,设计一种特异性针对小鼠因的检测方法对于Ndrg2功能的研究十分必要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种检测小鼠ndrg2基因的特异性cRNA原位杂交探针及其制备方法。
[0005]本发明是采用如下技术方案实现的:
一种检测小鼠於基因的特异性cRNA原位杂交探针，该探针的序列为:
【权利要求】
1.一种检测小鼠於基因的特异性CRNA原位杂交探针，其特征在于，该探针的序列为:
5，-CTATCTCGGTCTCGCACAGCATCTCTGACCAGTGCAGCATCCATCGATGGCAGTCGGTCCCGATCCCGCACCCTGTCGCAGAGTAGCGAGTCTGGGACTCTCCCTTCTGGACCCCCAGGGCACACCATGGAAGTCTCCTGTTGAATGACCCTCATTGCCTTGGTGTGGATCCCAGCCCTCACCTCCTGCAACACTAATTTAAGAGGTGTTATCAGGGCACTGGGCCAGAGTAAGCAAGGAAAATGGGCAGATTGTGCAGGGAGATGACCTTGATCTTTAATTGCTACCCTAACCTTGACCTTTAACCTGTGATATCCTCTAGCTCCTAGGTGAGGTGTCCTAATATCTCTTAGAGATCTGGGCCCCCTAAATTACCCCCTCTTCCATTTTGGTGTTGAGAAGGCTTGTATGTTCTCTCCCTGACCTAGGTTCTATAGATGAGGAACAATGAGCTGTTCTAGCTGACACGGGGCCTCCATCACTCCCCCTCTTTAGCCCATATTTGCAAGGGTAGGAGAGAGAGTGTGTGTGTGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGGGTTGATGGTGAGAGATGGGGAGCTCCTTCCCCAAAGCTGACAGTGGCTTTGCCTTGATGTGTCAGGCCTCTCTGAA-3，。
2.权利要求1所述探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)根据GenBank数据库中小鼠ndrg2基因的序列，设计跨编码区和3’ -UTR的特异性引物，上游引物为:5’ -CTATCTCGGTCTCGCACAGCA-3’ ；下游引物为:5’ -TTCAGAGAGGCCTGACACATC-3’ ；引物扩增636bp作为小鼠於基因的特异性探针序列； (2)构建小鼠fli/r古?基因的cRNA原位杂交的探针质粒，包括: Ca)制备小鼠cDNA，用设计的引物进行PCR扩增后回收目的片段； (b)目的片段通过TA克隆连接入两端具有T7和SP6启动子的pGEM-T载体，构建探针质粒; (C)转化探针质粒到DH5 α细菌进行扩增，之后测序验证探针质粒； (3)制备小鼠fli/r古?基因的cRNA原位杂交探针，包括: Ca)通过测序得到序列正确的探针质粒，并确认於基因探针序列为正向插入pGEM-T 载体； (b)线性化探针质粒:提取探针质粒，PCR法对质粒进行扩增:T7启动子序列5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’ 和 SP6 启动子序列 5’ -ATTTAGGTG ACACTATAGAA-3 ’ 分别作为上、下游引物，之后回收目的片段； (c)用SP6RNA聚合酶对线性化目的片段进行体外转录，制备的cRNA探针以地高辛标记； Cd)乙醇沉淀法纯化cRNA探针，用去除核酸酶的无菌水调整探针浓度为Iyg/μ 1，_70°C冰箱储存备用。
3.权利要求1所述探针在检测小鼠於基因原位杂交中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103993068SQ201410099872
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】史明, 杜芳, 刘丽娟 申请人:中国人民解放军第四军医大学