转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由5条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQIDNO：1~5所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、环引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、阳性DNA对照和阴性DNA对照，试剂盒还可以含有显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，并采用加入显色剂观察颜色变化或直接观察反应管内沉淀的浊度变化等方法，判断样品是否含有cry3A基因成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，适合现场检测。
【专利说明】转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因植物中cit3A基因的引物组、试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]2013年全球转基因作物种植面积高达1.752亿公顷，比1996年商业化初期增长了 100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性状为抗虫、抗除草剂。在抗虫转基因植物中应用的目的基因有crylAb、crylAc、crylA.105、crylF、cry2Ab> cry3A > cry3Bb^ vip3'等,其中ciyJA基因存在于转基因玉米MIR604中，已获准在美国、欧盟、澳大利亚、俄罗斯、韩国、南非等近20个国家和地区商业化种植或作为食品和饲料，我国也在2008年批准转基因玉米MIR604进口用作加工原料。
[0003]为加强转基因生物及其产品的安全管理，全球50多个国家和地区制订了转基因生物标识制度。我国于2001年相继颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及安全评价、标识管理、进口安全、加工审批等一系列配套管理办法，对转基因生物进行全产业链监管，要求对转基因玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等5类17种产品实施强制性标识管理制度。
[0004]转基因检测技术是转基因生物安全管理的重要技术支撑。目前转基因检测技术主要分为两大类:一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，PCR方法应用最为广泛，但基于PCR技术的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约3~4 h)，难以实现现场快速检测，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。
[0005]LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是:①恒温扩增:整个扩增反应在恒温条件(6(T65°C)进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效:整个扩增和产物检测可在I h内完成；③高特异性:针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度:检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便:扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、加入染料观察颜色变化等。
[0006]LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因植物中cir3A基因的检测方法和试剂盒。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的在于公开一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组。
[0008] 本发明的另一个目的在于公开一种转基因植物中CirM基因的LAMP检测试剂盒。[0009]本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因植物中cry3A基因的LAMP检测方法。
[0010]本发明所采用的技术方案如下:
根据CIT.3A基因的核苷酸序列，设计CIT.3A基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO: f 5 ;确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性、灵敏度进行验证。
[0011]转基因植物中CiySA基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:1);
外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2);
内引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);
内引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4);
环引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5)。
[0012]转基因植物中ciy3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分:
(1)检测引物溶液:由2条外引物和2条内引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物I和内引物2的浓度依次为4飞Mmol/L、r6 Mmol/L、32~48 Mmol/L和32~48Mmol/L ；
(2)环引物溶液:环引物浓度为16~24Mmol/L ；
(3)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7~9U/ μ L ;
(4)IOX 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4) 2S04,40~100 mmol/L MgSO4,6~14 mol/L 甜菜喊；
(5)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
(6)阳性DNA对照样品，转基因植物的基因组DNA，或含有基因序列的大肠杆菌质粒DNA ；
(7)阴性DNA对照样品:不含ciy3A基因序列的DNA。
[0013]优选的，所述的检测引物溶液中含有5 Mmol/L外引物1、5 Mmol/L外引物2、40Mmol/L内引物1、40 Mmol/L内引物2。
[0014]优选的，所述的环引物溶液中含有20 Mmol/L环引物。
[0015]优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μ L0
[0016]优选的，所述的10Χ反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L和8mol/L。
[0017]本发明的CIT3A基因的LAMP检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为SYBRGREEN I荧光染料。
[0018]利用以上所述的试剂盒检测基因的方法，包括如下步骤:
(1)提取待测 样品的基因组DNA:按常规CTAB方法或植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA ；
(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200μ L PCR反应管内加入模板DNA 2^5UL、检测引物溶液1.5 yL、环引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用灭菌去离子水补齐到25 μ L ；
(3)配制对照样品的LAMP检测反应体系:配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤(2) —致；
(4)运行LAMP扩增反应:63~65°C孵育3(T60min，80°C孵育5min终止反应；
(5)LAMP扩增结果的鉴定:通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或取2~5 PL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
[0019]在试剂盒中含有显色剂的情况下，在步骤(4)后获得的LAMP扩增产物中加入1~ 2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
[0020]通过实验证明，本发明提供的基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为实施例1的LAMP检测结果图，I为阳性对照样品，2为阴性对照样品，3、4为待测样品；
图2为实施例2的LAMP检测结果图，I为阳性对照样品，2为阴性对照样品，3、4为待测样品；
图3是实施例3中进行特异性检测的结果图，1~15依次为转基因玉米M0N89034、M0N810、Btll、Btl76，转基因棉花 M0N531、MONl5985，转基因水稻 KF_6、TT51_1，转基因玉米M0N863、M0N88017、MIR604、TC1507、59122、非转基因玉米阴性对照、空白对照；
图4和图5是实施例4中进行灵敏度检测的结果图，1~7依次为转基因玉米MIR604质量分数分别为100%、10%、1%、0.1%、0.05%,0..02%,0.01%的测试样品，8为非转基因玉米样品，M为DNA分子量Marker。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0023]实施例1不含显色剂的试剂盒及其检测方法:
按下列配方制备ciy3A基因的LAMP检测试剂盒:
(1)检测引物溶液:合成外引物1、外引物2、内引物I和内引物2，将引物干粉用灭菌去离子水分别配成浓度为100 μ mol/L的母液，然后取7.5 111^外引物1、7.5 μ L外引物2、60 “1^内引物1、60 “1^内引物2、15 μ L灭菌去离子水，充分混匀配成150 μ L的基因的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为:
外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:1);
外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2)；
内引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);
内引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4);
(2)环引物溶液:合成环引物，将引物干粉用灭菌去离子水配成浓度为100μ mol/L的母液，然后取20 μ L环引物、80 μ L灭菌去离子水，充分混匀配成100 4 1^的<^7124基因的LAMP环引物溶液，其中引物序列为:
环引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5);(3)Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/yL；
(4)IOX 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,80 mmol/L MgSO4,8 mol/L 甜菜喊;
(5)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
(6)阳性DNA对照样品，转基因植物的基因组DNA，或含有基因序列的大肠杆菌质粒DNA ；
(7)阴性DNA对照样品:不含ciy3A基因序列的DNA。
[0024]用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测:
(1)提取待测样品的 基因组DNA:采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA ；
(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200uL PCR反应管内加入模板DNA 2UL、检测引物溶液1.5 yL、环引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用灭菌去离子水补齐到25 μ L ；
(3)配制对照样品的LAMP检测反应体系:配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤(2) —致；
(4)将反应管放置在浊度仪中，运行LAMP扩增反应:63°C孵育40min，80°C孵育5min终止反应；
(5)LAMP扩增结果的鉴定:利用实时浊度仪(日本荣研公司)观察反应管内沉淀的浊度变化(反映为实时扩增曲线)来判断扩增结果。
[0025]本实施例中，阳性对照有沉淀产生(出现典型扩增曲线)，阴性对照无沉淀产生(无典型扩增曲线);待测样品I的反应管出现沉淀，表明含有基因成分；待测样品2的反应管未出现沉淀，表明不含有基因成分。
[0026]实施例2含显色剂的试剂盒及其检测方法 按下列配方制备ciy3A基因的LAMP检测试剂盒:
(1)检测引物溶液:合成外引物1、外引物2、内引物I和内引物2，将引物干粉用灭菌去离子水分别配成浓度为100 μ mol/L的母液，然后取7.5 111^外引物1、7.5 μ L外引物2、60 “1^内引物1、60 “1^内引物2、15 μ L灭菌去离子水，充分混匀配成150 μ L的基因的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为:
外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:1);
外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2)；
内引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);
内引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4);
(2)环引物溶液:合成环引物，将引物干粉用灭菌去离子水配成浓度为100μ mol/L的母液，然后取20 μ L环引物、80 μ L灭菌去离子水，充分混匀配成100 4 1^的<^7124基因的LAMP环引物溶液，其中引物序列为:
环引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5);
(3)Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/yL；
(4)10X 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,80 mmol/L MgSO4,8 mol/L 甜菜喊;
(5)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
(6)阳性DNA对照样品，转基因植物的基因组DNA，或含有基因序列的大肠杆菌质粒DNA ；
(7)阴性DNA对照样品:不含ciy3A基因序列的DNA；
(8)显色剂:1000XSYBRGREEN I荧光染料。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测:
(1)提取待测样品的基因组DNA:采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA ；
(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200uL PCR反应管内加入模板DNA 2UL、检测引物溶液1.5 yL、环引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用灭菌去离子水补齐到25 μ L ；
(3)配制对照样品的LAMP检测反应体系:配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤(2) —致；
(4)将反应管放置在恒温水浴锅中，运行LAMP扩增反应:63°C孵育40min，8(TC孵育5min终止反应；
(5)LAMP扩增结果的鉴定:在LAMP扩增产物中加入2 μL的显色剂，混匀，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
[0027]本实施例中，阳性对照显现绿色，阴性对照显现橙色；待测样品I的反应管显现绿色，表明含有基因成分；待测样品2的反应管显现橙色，表明不含有基因成分。
[0028]实施例3试剂盒及检测方法的特异性实验
对实施例2所述的试剂盒及其检测方法的特异性进行实验，测试样品包括:转基因玉米 MIR604 CcrrSA ), M0N89034 icrylA.105, cry2Ab), M0N810 (.cryIAb), Btll (.cryIAb),Btl76 (crrlAb),M0m63 (crj^^)、M0N88017 助)、TC1507 (^7/^),59122 icry34Ab、转基因棉花 M0N531 (.cry I Ac), M0N15985 (.cry I Ac,转基因水稻 KF-6
{cryIAb), TT51-1 icrylAb/Ac)等13种抗虫转基因作物，以及非转基因玉米。
[0029]本实施例中，仅含有基因的转基因玉米MIR604样品反应管显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对⑶成基因具有很好的特异性。
[0030]实施例4试剂盒及检测方法的灵敏度实验
对实施例2所述的试剂盒及其检测方法的灵敏度进行实验，测试样品由转基因玉米MIR604 (含基因)与非转基因玉米按一定质量比混合制备而成，8份测试样品中的MIR604 玉米的质量分数分别为 100%、10%、1%、0.1%、0.05%,0.02%,0.01%,O0[0031 ] 本实施例中，MIR604玉米质量分数分别为100%、10%、1%、0.1%、0.05%、0.02%、
0.01%的测试样品反应管中均显现绿色，而阴性对照显现橙色，表明本发明所述试剂盒及其检测方法的检测灵敏度可达0.01%。
[0032]以本发明所述的外引物I和外引物2，对上述测试样品进行定性PCR检测。 [0033]PCR检测反应体系为:I XPCR缓冲液(大连宝生物公司)、0.2 mmol/L dNTPs (大连宝生物公司)、0.2 μ mol/L外引物1、0.2 μ mol/L外引物2、1 U Taq DNA聚合酶(大连宝生物公司)、2 μL模板DNA，用灭菌去离子水补齐到25 μ L。PCR反应程序为:94°C预变性5min;95°C变性 30 s、60°C退火 30 S、72°C延伸 30 S，35 次循环；72°C延伸 7 min。PCR 结束后，取5 UL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0034]本实施例中，MIR604玉米质量分数分别为100%、10%、1%、0.1%、0.05%的测试样品的PCR扩增产物出现典型电泳条带，而0.02%、0.01%、阴性对照均无典型电泳条带，表明PCR方法的检测灵敏度为0.05%。
[0035]两种方法的比较结果显示，本发明的试剂盒及其检测方法的检测灵敏度可以达到
0.01%，而PCR方法的检测灵敏度为0.05% ;经比对，本发明的试剂盒及检测方法的灵敏度明显高于PCR方法，可检测出更低含量的样品。
[0036]应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为 是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.转基因植物中基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:I)；
外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2)；
内引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);
内引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4); 环引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5)。
2.转基因植物中ciy3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分: (1)检测引物溶液:由权利要求1所述的2条外引物和2条内引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物I和内引物2的浓度依次为4飞Mmol/L,r6 Mmol/L、32~48Mmol/L和 32~48 Mmol/L ； (2)环引物溶液:由权利要求1所述的环引物配制而成，环引物的浓度为16~24Mmol/L ； (3)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7~9U/ μ L ; (4)IOX 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4) 2S04,40~100 mmol/L MgSO4,6~14 mol/L 甜菜喊； (5)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成； (6)阳性DNA对照样品，转基因植物的基因组DNA，或含有基因序列的大肠杆菌质粒DNA ； (7)阴性DNA对照样品:不含ciy3A基因序列的DNA。
3.根据权利要求2所述的CirJA基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的检测引物溶液中含有5 Mmol/L外引物1、5 Mmol/L外引物2、40 Mmol/L内引物1、40 μ mol/L内引物2。
4.根据权利要求2所述的CirJA基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的环引物溶液中含有20 Mmol/L环引物。
5.根据权利要求2所述的cit3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μ L0
6.根据权利要求2所述的基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的10X反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L、8 mol/L。
7.利用权利要求2飞任一项所述的试剂盒检测cit3A基因的方法，包括以下步骤: (1)提取待测样品的基因组DNA； (2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200μ L PCR反应管内加入模板DNA 2^5UL、检测引物溶液1.5 yL、环引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用灭菌去离子水补齐到25 μ L ； (3)配制对照样品的LAMP检测反应体系:配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤(2) —致； (4)运行LAMP扩增反应:63~65°C孵育3(T60min，80°C孵育5min终止反应； (5)LAMP扩增结果的鉴定:通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果、或取2~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
8.根据权利要求2飞任一项所述的ciy3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:试剂盒中还包括显色剂，所述显色剂为SYBR GREEN I荧光染料。
9.利用权利要求8所述的试剂盒检测cry3A基因的方法，包括以下步骤: (1)提取待测样品的基因组DNA； (2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200μ L PCR反应管内加入模板DNA 2^5UL、检测引物溶液1.5 yL、环引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用灭菌去离子水补齐到25 μ L ； (3)配制对照样品的LAMP检测反应体系:配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤(2) —致； (4)运行LAMP扩增反应:63~65°C孵育3(T60min，80°C孵育5min终止反应； (5)LAMP扩增结果的鉴 定:在反应管中加入广2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
【文档编号】C12Q1/68GK103924000SQ201410176842
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】李飞武, 闫伟, 李葱葱, 龙丽坤, 董立明, 邢珍娟, 夏蔚, 邵改革 申请人:吉林省农业科学院