一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种shRNA，特别涉及一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用。编码所述shRNA的DNA序列，如下所示：5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTC?C-3’，所述的GCAAGAG为loop序列。所述的有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的应用包括将所述的shRNA构建于慢病毒载体上，得到含有所述shRNA的重组载体；将含有所述shRNA的重组载体作用于大鼠细胞，达到抑制大鼠FoxO3a基因表达的目的。该shRNA能有效抑制大鼠FoxO3a基因在mRNA及蛋白水平的表达。
【专利说明】—种有效抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种shRNA，特别涉及一种有效抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA及
其应用。
【背景技术】
[0002]Fox03a是属于Forkhead box(Fox)蛋白家族的一个核转录因子，可通过调节Bim、Fas Iigand(FasL)、TNFR2、p27、p53、抗氧化物酶等多种下游祀基因的转录而发挥促细胞凋亡、细胞周期阻滞及抗氧化等不同的生物学功能。目前研究认为，Fox03a广泛分布于哺乳动物的多种组织和细胞中，并参与糖代谢、骨骼肌的分化发育、血管发生、抑制细胞增殖、抑制心肌肥厚等生理和病理过程。因此，研究不同病理及生理条件下Fox03a转录因子的功能越来越受到人们的广泛关注。
[0003]随着RNA干扰技术的不断深入发展，将设计合成的shRNA构建到慢病毒表达系统，进而感染特定的靶细胞，特异性沉默相关基因表达，已经成为研究基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径。shRNA慢病毒表达系统有效克服了以往人工合成的siRNA转染效率低、持续时间短等不足，已经逐步发展成为在原代细胞及体内研究基因功能的有效途径之一。针对大鼠Fox03a基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的慢病毒表达系统，为今后深入研究大鼠Fox03a基因的功能奠定了基础，可广泛应用于Fox03a基因相关的大鼠细胞及动物模型，具有重要的应用前景和经济价值。
【发明内容】
[0004]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述有效抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA的应用。
[0006]本发明的再一目的在于提供一种含有上述shRNA的重组载体。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008]一种有效抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA,其祀向大鼠Fox03a基因的序列如下所示:5，-GGA ACT TCA CTG GTG CTA AGC-3’，位于大鼠Fox03a基因mRNA(NM-001106395.1)的2296位点开始的21个碱基序列；
[0009]编码所述的抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA的DNA序列，如下所示:
[0010]5’ -GGAACTTCACTGGTGCTAAGC gcaagag GCTTAGCACCAGTGAAGTT CC-3’，斜体加下划线为loop序列；
[0011]所述的有效抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA的应用，该应用包括将所述的shRNA构建于慢病毒载体上，得到含有所述shRNA的重组载体；将含有所述shRNA的重组载体作用于大鼠细胞，达到抑制大鼠Fox03a基因表达的目的；
[0012]所述慢病毒载体为PGLV3/H1/GFP+PU1O (pGLV3)慢病毒穿梭载体；
[0013]所述的含有所述shRNA的重组载体的制备方法，包含以下步骤:[0014](I)设计含有抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA的DNA序列，如下所示:
[0015]5’ -GGAACTTCACTGGTGCTAAGC 'gcaagag^ GCTTAGCACCAGTGAAGTT CC-3’，斜体加下划线为loop序列；
[0016]为将其克隆到pGLV3慢病毒穿梭载体上，合成以下正义链(F)及反义链(R)DNA序列:
[0017]Fox03a-shRNA-2296 正义链:
[0018]
【权利要求】
1.一种有效抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA，其特征在于:编码所述shRNA的DNA序列如下所示:
5’ -GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAG TTCC-3’，其中，GCAAGAG 为loop序列。
2.权利要求1所述的shRNA在Fox03a基因的功能研究以及Fox03a基因有关疾病的靶向治疗研究中的应用。
3.根据权利要求2所述的shRNA在Fox03a基因的功能研究以及Fox03a基因有关疾病的靶向治疗研究中的应用，其特征在于该应用包括将权利要求1所述的DNA序列构建于慢病毒载体上，得到含有权利要求1所述DNA序列的重组载体；将含有权利要求1所述DNA序列的重组载体作用于大鼠细胞，达到抑制大鼠Fox03a基因表达的目的。
4.根据权利要求3所述的shRNA在Fox03a基因的功能研究以及Fox03a基因有关疾病的靶向治疗研究中的应用，其特征在于: 所述慢病毒载体为PGLV3慢病毒穿梭载体。
5.根据权利要求4所述的shRNA在Fox03a基因的功能研究以及Fox03a基因有关疾病的靶向治疗研究中的应用，其特征在于: 所述的含有所述shRNA的重组载体的制备方法，包含以下步骤: (1)设计含有 抑制大鼠Fox03a基因表达的shRNA的DNA序列，如下所不: 5，-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAG TTCC-3，，斜体加下划线为loop序列； 为将其克隆到PGLV3慢病毒穿梭载体上，合成以下正义链及反义链DNA序列: Fox03a-shRNA-2296 正义链:
5’ -GATCCGGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAG TGAAGTTCCTTTTTTG-3’ ； Fox03a-shRNA-2296 反义链:
3’ -GCCTTGAAGTGACCACGATTCGCGTTCTCCGAATCGTGGTCACTTC AAGGAAAAAACTTAA-5’ ； 上述正义链模板的5’端添加了 GATCC，与BamH I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了 AATTC，与EcoR I酶切后形成的粘端互补； (2)将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，以形成DNA双链，得到shRNA模板； (3)将pGLV3载体用BamHI和EcoR I双酶切，得到线性化的pGLV3载体； (4)将步骤(2)中的shRNA模版和步骤(3)中线性化的PGLV3载体进行连接，得到重组载体 pGLV3-Fox03a-shRNAo
6.根据权利要求5所述的shRNA在Fox03a基因的功能研究以及Fox03a基因有关疾病的靶向治疗研究中的应用，其特征在于: 步骤(2)中所述的shRNA模板的终浓度为200nM。
7.根据权利要求5所述的shRNA在Fox03a基因的功能研究以及Fox03a基因有关疾病的靶向治疗研究中的应用，其特征在于: 步骤(3)中所述的线性化的pGLV3载体的终浓度为50ng/l.! L。
【文档编号】C12N15/113GK103952410SQ201410178685
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】齐绪峰, 夏景波, 陈卓莹, 蔡冬青, 龙颖妍, 赵天琪, 吴彩红, 王健欢 申请人:暨南大学