一种通过调控基因表达来提高s-腺苷甲硫氨酸产量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种通过调控基因表达来提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。首次揭示将透明颤菌血红蛋白(VHb)的编码基因转入S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，并敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因后，能够显著地提高S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸产量。
【专利说明】一种通过调控基因表达来提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种通过调控基因表达来提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。
【背景技术】
[0002]S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-meth1nine, SAM)由 Cantoni 等人于 1%2 年发现，作为所有生物体内的重要甲基供体，并参考多种代谢反应，SAM在抑郁症、肝脏疾病和关节炎治疗领域都具有良好的临床应用价值。因此，越来越多的研究人员利用代谢工程改变细胞的代谢途径以获得高产SAM的菌株。 [0003]在生物体内，以L-Met和ATP为前体，可经SAM合成酶催化合成SAM (图1)。其反应过程为，ATP的腺苷部分与L-Met的硫原子部分发生撞击，使得腺苷结构与甲硫氨酸相结合，从而生成具有闻能量的有机硫化物。
[0004]提高SAM合成酶活性是获得SAM高产菌的一个重要策略。经研究发现在生物体内存在两种SAM合成酶，它们是同工酶，编码基因分别为saml和sam2，saml编码SAM合成酶I是受产物抑制的，而sam2编码的SAM合成酶II不受产物抑制，所以提高sam2基因的表达可以提高SAM合成酶的含量。因此人们利用受甲醇诱导的强启动子PAOX或者组成型的PGAP调控sam2的表达，李东阳等将sam2基因导入pPIC3.5K转化毕赤酵母GS115使得SAM合成酶酶活提高了 37倍，SAM最终产量达到了 1.58g/L。Yu等(Yu ZL, Wu XJ, Li DY，et al.Enhancement of the product1n of SAM by overexpress1n of SAM synthetase inPichia pastoris.Acta B1chimica et B1physica Sinica.2003, 35:127 - 132)利用组成型的GAP启动子调控SAM合成酶，导入GSl 15使得SAM产量达到了 2.49g/L。
[0005]除了提高SAM合成酶的表达量，还能对SAM合成酶进行体外进化，以获得高酶活的重组酶。本发明人以往的研究中(Hu H, Qian JC, Chu J, et al.DNA shuffling of meth1nineadenosy I transferase gene leads to improved S-adenosyl-L-meth1nine product1n inPichia pastoris.J B1technol.2009,141 (3): 97-103)，利用 DNA Shuffling 技术对 SAM 合成酶进行了体外进化，经过筛选获得高酶活重组SAM合成酶基因dsl6和相应的高产菌株DS16。在摇瓶中，DS16的胞内SAM累积量为1.64g/L，SAM合成酶的酶活达到463U/g DCW，与表达酵母SAM合成酶的重组菌相比，分别提高了 102%和201%，有效改善了胞内SAM合成酶活性对SAM合成的限制。
[0006]在强化SAM合成酶表达后，将SAM分解代谢途径进行阻断是增加细胞内SAM积累的另一有效策略。敲除β -胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻断SAM和L-Met在细胞内转化为半胱氨酸的途径，可以实现胞内SAM积累的增加。鉴于此，He等(He J，Deng J，Zheng Y, et al.A synergistic effect on the product1n of S-adenosyl-L-meth1nine inPichia pastoris by knocking in of S-adenosyl-L-meth1nine synthase and knocking outof cystath1nine-beta synthase.J B1technol.2006, 126:519-527)通过基因敲除的方法将过量表达SAM合成酶的毕赤酵母菌株的CBS合成基因缺失掉，结果SAM积累量提高了两倍多，效果相当明显；但是，将SAM分解代谢途径β-胱硫醚(CBS)完全阻断，重组菌成为营养缺陷型，培养基中需外源添加谷胱甘肽(GSH)。因此也导致发酵成本大大提高。
[0007]S-腺苷甲硫氨酸在毕赤酵母中的合成与分解途径如图2。
[0008]综上，鉴于S-腺苷甲硫氨酸的重要的临床应用价值，本领域仍然有必要进一步开发提高其产量的有效途径。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种通过调控基因表达来提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。
[0010]在本发明的第一方面,提供一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法,所述方法包括:
[0011](I)在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的基因组中引入外源的透明颤菌血红蛋白(VHb)表达盒，并敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶Spe2基因；
[0012](2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生产S-腺苷甲硫氨酸。
[0013]在一个优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因中(较 佳地，插入位点为spe2基因的起始位点ATG至终止子，为整段spe2基因敲除)，从而敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。
[0014]在另一优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件:
[0015]AOXl启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因，转录终止序列(较佳地为TT，防止在vgb基因的终止子后还继续转录)；或
[0016]所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件:
[0017]ADH2启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因，转录终止序列(较佳地为TT)。
[0018]在另一优选例中，步骤(2)中，培养的方法包括:起始阶段采用分批发酵，通气量为3±2VVM，控制溶氧大于30%，在基础培养基中的甘油耗尽以后，溶氧出现反弹，进行限制性流加甘油，并通过调节甘油的补料速率使得DO在20-30%，促使菌体生长；在达到菌体OD6tltolS 200±10时，停止甘油的补料，待甘油耗尽，开始以2±0.5g/L/h的流速流加甲醇，开始诱导阶段，逐渐提高甲醇的流加速率，使得DO维持在10-15%。
[0019]在另一优选例中，发酵过程中调节pH5.5±0.5。
[0020]在另一优选例中，S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是毕赤酵母菌株、较佳地是DS16菌株。
[0021]此外，经过进一步改造的，例如弱化了胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)的菌株也可作为本发明的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株。
[0022]在本发明的另一方面，提供一种改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，所述的菌株的基因组中引入了外源的透明颤菌血红蛋白(VHb)表达盒，并敲除了 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。
[0023]在一个优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因中，从而敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。
[0024]在另一优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件:
[0025]AOXl启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因转录终止序列(较佳地为TT，防止在Vgb基因的终止子后还继续转录)。
[0026]在另一优选例中，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件:
[0027]ADH2启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因转录终止序列(较佳地为TT，防止在vgb基因的终止子后还继续转录)。
[0028]在另一优选例中，所述的改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株以毕赤酵母菌株、较佳地以DS16菌株为出发菌株进行改良。
[0029]在本发明的另一方面，提供透明颤菌血红蛋白的用途，用于促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株生产S-腺苷甲硫氨酸。
[0030]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1、S-腺苷甲硫氨酸的生物合成。 [0032]图2、S-腺苷甲硫氨酸在毕赤酵母中的合成与分解途径。
[0033]图3、质粒pDsmvA和pDsmvP构建过程。
[0034]图4、质粒pDspe z质粒构建过程。
[0035]图5、重组菌DS16/DsvP构建过程。
[0036]图6、PCR 验证重组菌 DS16/DsvP 基因型。M:Marker2, 000 ;Lanel、2:以 DS16 基因组 DNA 为模板；Lane3-Lane6:以 DS16/DsmvP 基因组 DNA 为模板；Lane7_Lane9:以 DS16/DsvP 基因组 DNA 为模板；Lanel>3:以 speFl/speRl 为引物;Lane2、5、7:以 mazFF/mazFR 为引物；Lane4:以 G1F/CYCTTR5 为引物；Lane6:以 TTF2/G1R 为引物；Lane8:以 G1F/PADHR2 为引物；Lane9:以PADHF3/G1R为引物。
[0037]图7、重组菌DS16/DsvA构建过程。
[0038]图8、PCR验证重组菌DS16/DsvA基因型。
[0039]Ml:Marker2, 000 ；M2:Marker5, 000 ;Lanel、2:以 DS16 基因组 DNA 为模板；Lane3-Lane6:以 DS16/DsmvA 基因组 DNA 为模板；Lane7_Lane9:以 DS16/DsvA 基因组 DNA为模板；Lanel、3:以 speFl/speRl 为引物;Lane2、5:以 mazFF/mazFR 为引物;Lane4、7:以G1F/CYCTTR5 为引物；Lane6、8:以 TTF2/G1R 为引物；Lane9:以 speF2/speR2 为引物。
[0040]图9、重组菌正常条件下的生长㈧和存活率⑶。
[0041]图10、正常条件下四株菌的产量。
[0042]图11、重组菌低氧条件下的生长状况(A)和存活率(B)。
[0043]图12、低氧条件下四株菌的SAM产量。
[0044]图13、重组菌5-L罐中的生长状况(A)和存活率(B)。
[0045]图14、四株菌的比氧气吸收速率(SOUR)。
[0046]图15、5L罐中四株菌的SAM产量。
[0047]图16、5L罐中四株菌的SAM累积量。
【具体实施方式】
[0048]本发明人经过深入的研究，首次揭示将透明颤菌血红蛋白(VHb)的编码基因转入S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，并敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因后，能够显著地提高S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸产量。
[0049]如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
[0050]如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5，端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。 [0051 ] 如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为VHb多肽)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件:启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
[0052]如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
[0053]NCBI已公开了 VHb蛋白序列或vgb基因序列，因此，本领域人员易于获得和制备这些基因。作为本发明的优选方式，所述的vgb具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0054]发明还涉及vgb的多核苷酸变异体，其编码与野生型基因编码的氨基酸序列相同的多肽。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0055]本发明的vgb的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
[0056]为了优化S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸的生产，本发明人作了广泛地研究，找到了适合于进行改良的基因vgb，并构建了相应的构建物；并且，同时敲除S-腺苷甲硫氨酸生产菌株内源存在的spe2基因。
[0057]因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括:vgb的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件(包括启动子、编码DNA以及终止子等)，从而可完整地表达出相应的VHb蛋白。
[0058]本领域已知的一些诱导型或组成型启动子均适用于本发明、进行表达盒的构建。作为本发明的优选方式，所述的启动子是甲醇诱导型启动子AOXl启动子或来自树干毕赤酵母的乙醇脱氢酶启动子ADH2启动子。受低氧诱导的启动子ADH2无需添加外源诱导物，可在发酵过程中响应溶氧的降低而被激活，适用于本发明中的毕赤酵母表达系统。
[0059]通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。为了实现在基因组上的基因定向敲除和基因定向重组，所述的表达载体还可设置合适的同源臂；同源臂的设置是本领域技术人员了解的。应理解，只要能够实现对于本发明的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的改造，任何表达载体均可选用的。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
[0060]包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是S-腺苷甲硫氨酸生产菌株。作为本发明的优选方式，所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是酵母菌株，优选地是毕赤酵母菌株，包括各种经改造的毕赤酵母菌株；更优选的，S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是DS16菌株。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
[0061]在本发明的优选实施例方式中，本发明人以高产菌DS16为出发菌，将vgb整合到重组菌DS16染色体的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的基因spe2位点，在引入vgb基因的同时，阻断SAM向精胺和亚精胺的转化，获得高的SAM产量。
[0062]当S-腺苷甲硫氨酸生产菌株为毕赤酵母细胞时，可以应用毕赤酵母细胞的一般培养方法，并结合所选择的启动子的类型，来进行培养。
[0063]作为本发明的优选方式，所述的培养方法包括:起始阶段采用分批发酵，通气量为3±2VVM，控制溶氧大于30% (—般在30-50% )，在基础培养基中的甘油耗尽以后，溶氧出现反弹(一般反弹至约80% )，进行限制性流加甘油，并通过调节甘油的补料速率使得DO在20-30 %，促使菌体生长；在达到菌体OD6tltol为200 土 10时，停止甘油的补料，待甘油耗尽，开始以2±0.5g/L/h的流速流加甲醇，开始诱导阶段，逐渐提高甲醇的流加速率，使得DO维持在10-15%。较佳地，发酵过程中调节pH5.5±0.5。
[0064]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0065]材料与方法
[0066]质粒、菌株和培养基
[0067] 表1、质粒
[0068]
【权利要求】
1.一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的基因组中引入外源的透明颤菌血红蛋白表达盒，并敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因； (2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生产S-腺苷甲硫氨酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因中，从而敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件: AOXl启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因，转录终止序列；或 所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件: ADH2启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因，转录终止序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养的方法包括:起始阶段采用分批发酵，通气量为3±2VVM，控制溶氧大于30 %，在基础培养基中的甘油耗尽以后，溶氧出现反弹，进行限制性流加甘油，并通过调节甘油的补料速率使得DO在20-30%，促使菌体生长；在达到菌体OD6tltlnm为200 ±10时，停止甘油的补料，待甘油耗尽，开始以2±0.5g/L/h的流速流加甲醇，开始诱导阶段，逐渐提高甲醇的流加速率，使得DO维持在10-15%。
5.一种改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，其特征在于，所述的菌株的基因组中引入了外源的透明颤菌血红蛋白表达盒，并敲除了 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。
6.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因中，从而敲除S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶spe2基因。
7.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件: AOXl启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因转录终止序列。
8.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述的透明颤菌血红蛋白表达盒包括以下操作性连接的元件: ADH2启动子、编码透明颤菌血红蛋白的基因转录终止序列。
9.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述的改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株以毕赤酵母菌株、较佳地以DS16菌株为出发菌株进行改良。
10.透明颤菌血红蛋白的用途，其特征在于，用于促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株生产S-腺苷甲硫氨酸。
【文档编号】C12R1/84GK104031959SQ201410299274
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】钱江潮, 陆俊杰, 乔雪锋, 秦秀林, 储炬, 庄英萍, 张嗣良 申请人:华东理工大学