用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，公开了一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用。本发明提供的用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组包括：具有如SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物，具有如SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物，具有如SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物和具有如SEQ?ID?NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。本发明提供的引物组特异性强、灵敏度高，适用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。
【专利说明】用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及 其应用。
【背景技术】
[0002] 锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus Disease，KHVD)是一种锦鲤和鲤鱼的高致病 性疾病，是近几年危害淡水鱼养殖，特别是鲤鱼养殖的主要水生传染病，同时也是近几年所 发现的新的水生病毒性传染病，其传染性和传播性所造成的危害已被全世界重视。锦鲤疱 疹病毒病可导致鲤鱼和锦鲤大规模死亡，造成巨大的经济损失，给淡水鱼养殖造成严重影 响。同时，国际贸易促进了该疾病的传播与扩散，使该疾病在全世界范围内流行，由于目前 没有合适的防治方法，导致其一旦爆发难以控制。近几年，国际动物卫生组织对锦鲤疱疹病 毒病的重视程度逐渐提高，并将其纳入水生动物疫病手册，许多研究人员也参与到该病的 研究工作中，以图尽快控制该病的流行与传播。
[0003] 锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV)引起的鲤鱼和锦鲤的 传染性病毒病。1997年首次在德国发现，1998年以色列和美国相继发生了该病并鉴定其病 原为锦鲤疱疹病毒。锦鲤疱疹病毒（KHV)可感染各年龄段的锦鲤和鲤鱼，死亡率很高，已经 给世界上众多国家造成了巨大的经济损失，目前无有效的预防和控制措施。研究发现，KHV 病毒感染后的临床症状与感染细菌和寄生虫后的临床症状相似，这些症状可能掩盖KHV病 毒所致的危害，所以不能单一通过观察发病鱼的临床症状给予决定性的判断，需要结合其 他检测方法共同检测来确定。目前，检测锦鲤疱疹病毒病的方法有电镜检测、ELISA、PCR、荧 光PCR等。PCR方法在我国已作为疫情检测及诊断手段，也是0ΙΕ诊断手册推荐的检测方 法。为了保证检测结果的特异性和可靠性，0ΙΕ手册建议采用两种不同的基因进行PCR检 测。针对锦鲤疱疹病毒，0ΙΕ手册提供的PCR方法涉及DNA聚合酶基因（Sph)和胸苷激酶 基因（TK)两个基因，操作复杂，特异性和灵敏度较低。所以，急需一种操作简单、准确检测 KHV的方法以便于检测锦鲤疱疹病毒，实现锦鲤疱疹病毒病的及时确诊、控制和治疗。
[0004] LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)法，即环介导等温扩增反应，是 2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列 上六个区域的四条引物（两条外引物，两条内引物）及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶， 在65°C左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到109_101(1个拷贝数量级；并且LAMP 法扩增产物的检测方法种类多：焦磷酸镁沉淀检测（浊度检测）、荧光显色检测、凝胶电泳 检测或实时检测；使得该方法具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。为了实现KHV的 简便、准确检测，很有必要提供一种利用LAMP技术检测锦鲤疱疹病毒的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的发明目的在于提供一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其 应用。本发明提供的用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组特异性强、灵敏度高，可以用 于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。
[0006] 为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组，该引物组包括以下 引物：
[0008] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0009] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0010] 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
[0011] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
[0012] 锦鲤疱疹病毒Sph基因，GenBank登录号AB375381. 1。本发明设计获得了 10组引 物组，从10组引物组中筛选出一组特异性强、灵敏度高、扩增效率高的引物组。实验结果证 明，本发明提供的引物组能够特异性检测锦鲤疱疹病毒Sph基因，相比普通PCR，检测灵敏 度高出两个数量级，可以用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤 疱疹病毒Sph基因的试剂。本发明将具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物 命名为F0P ;具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物命名为Β0Ρ ;具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游内部引物命名为FIP;具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列 的下游内部引物命名为BIP。
[0013] 本发明提供的引物组是根据锦鲤疱疹病毒Sph基因的保守序列设计获得的，所以 本领域技术人员可以推理得出利用本发明提供的引物组除了能够扩增检测本发明设计引 物所对应的锦鲤疱疹病毒Sph基因外。还能够扩增检测以下两个DNA分子中的任意一个： (1)与本发明设计引物所用的锦鲤疱疹病毒Sph基因序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA 分子；（2)与本发明设计引物所用的锦鲤疱疹病毒Sph基因至少具有90%以上同源性且编 码相同功能蛋白的DNA分子。
[0014] 环介导等温扩增反应分为两个阶段：第一阶段为起始阶段，经过这一阶段，形成了 茎环状结构；第二阶段为扩增循环阶段，以茎环状结构为模板进行周而复始地扩增；第一 阶段是第二阶段的基础。根据靶序列设计的上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物和 下游内部引物直接决定了环介导等温扩增的特异性和灵敏度。环介导等温扩增反应中还可 以加入环引物，环引物能够在第二阶段时与茎环状结构结合启动链置换合成，进一步完善 扩增反应，例如，进一步提高扩增的速度和效率，本领域技术人员很容易想到在本发明提供 的引物组的基础上再加入环引物，这也属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明还提供了一种引物组在制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂中的应用， 该引物组包括以下引物：
[0016] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0017] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0018] 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
[0019] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
[0020] 本发明还提供了一种检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂盒，该试剂盒包括一种引 物组，该引物组包括以下引物：
[0021] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0022] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0023] 具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
[0024] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
[0025] 优选地，本发明提供的试剂盒中的上游外部引物的浓度为0. 05 μ mol/L? 0. 5ymol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的上游外部引物的浓度为 0·2 μ mol/L〇
[0026] 优选地，本发明提供的试剂盒中的下游外部引物的浓度为0. 05 μ mol/L? 0. 5ymol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的下游外部引物的浓度为 0·2 μ mol/L〇
[0027] 优选地，本发明提供的试剂盒中的上游内部引物的浓度为0. 8 μ mo 1/L? 2. 0 μ mol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的上游内部引物的浓度为 L 6 μ mol/L〇
[0028] 优选地，本发明提供的试剂盒中的下游内部引物的浓度为0. 8 μ mo 1/L? 2. 0 μ mol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的下游内部引物的浓度为 L 6 μ mol/L〇
[0029] 本发明还提供了一种利用本发明提供的引物组扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方 法，包括：
[0030] 获得待测生物样品，以具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有 如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的 上游内部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物扩增待测生物样品；
[0031] 该引物组包括以下引物：
[0032] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0033] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0034] 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
[0035] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
[0036] 本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法以本发明提供的引物组为引物， 采用LAMP法进行扩增，操作简单，提高了扩增反应的特异性和灵敏度，所得扩增产物鉴定 方便，更有利于灵敏、快速、准确地检测生物样品中是否含有锦鲤疱疹病毒Sph基因。
[0037] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中用 于检测扩增产物的方法为荧光显色法、浊度检测法或凝胶电泳检测法。
[0038] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法 中用于检测扩增产物的方法具体为荧光显色法。
[0039] 当环介导等温扩增的反应体系中含有钙黄绿素时，可通过荧光显色进行结果判 断：如果环介导等温扩增所得扩增产物显示为绿色，代表待测生物样品中含有锦鲤疱疹病 毒Sph基因；如果环介导等温扩增所得扩增产物显示为橙色，待测生物样品中不含有锦鲤 疱疹病毒Sph基因。
[0040] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法 中用于检测扩增产物的方法具体为浊度检测法。
[0041] 在环介导等温扩增反应过程中会产生一种焦磷酸镁的衍生物副产物，随着环介导 等温扩增反应扩增产物的增加，焦磷酸镁衍生物的生成量也会逐渐增加，焦磷酸镁衍生物 为白色沉淀，使得扩增产物呈现出白色浑浊。因此，如果环介导等温扩增产物中生成白色沉 淀代表待测生物样品中含有锦鲤疱疹病毒Sph基因；如果环介导等温扩增产物中没有生成 白色沉淀，则说明待测生物样本中不含有锦鲤疱疹病毒Sph基因。因此，通过观察反应产物 白色浑浊的有无即可验证是否待测生物样品中是否含有锦鲤疱疹病毒Sph基因。因为环介 导等温扩增反应中焦磷酸镁衍生物沉淀的形成量与反应所产生的DNA量之间呈线性关系， 因此可以通过浊度仪实时检测扩增产物，如果浊度仪生成浊度变化曲线代表待测生物样品 中含有锦鲤疱疹病毒Sph基因基因；如果浊度仪没有响应，则代表待测生物样品中不含锦 鲤疱疹病毒Sph基因。同时，也可根据浊度变化曲线对生物样品中所含有的锦鲤疱疹病毒 Sph基因进行定量分析。
[0042] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法 中用于检测扩增产物的方法具体为凝胶电泳检测法。
[0043] 环介导等温扩增产物是一系列具有不同茎长度的茎环结构DNA和带有许多环的 类似花椰菜结构的DNA混合物，因为扩增产物中含有一个或多个重复单元，所以各个扩增 产物之间的长度差可以看作一个常数，当用凝胶电泳分析时，一个待测生物样品所得的扩 增产物所对应的电泳泳道呈现梯状条带。如果扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带， 代表待测生物样品中含有锦鲤疱疹病毒Sph基因；如果扩增产物的琼脂糖凝胶电泳不显示 梯状条带，则说明待测生物样品中不含锦鲤疱疹病毒Sph基因。
[0044] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中， 扩增的体系包括以下组分：
[0045]
[?Ι) Ο.ΝμιηοΙ ,? . 2.0μιι?(.)Ι /[. Ι?Π* U.Kunu)l /1... 2.0μιηοΙ /1.. ΓΟΙ1 O.OSiimoi η.-- ().5umo\ /\. iiOi* ().()5μηιοΙ /1..?（).5'umol /1, tiN ] [:,s O.Knimoi ·· 2.0minol /L Λ?";>? fA ( Hetainc ) 0.1 mmol I... - i .Ommol L. Tris-1 l(..'l(pl !8.S) 5rmm)l .'L ?50mmol ./L KCI 5inmol /1.. 50irmiol /L (NIh)，SO, 5mmoi /1. - 50mmol /L MgS04 5mmol /L ~ 50mmol /L Tween20 0.CH% ~ 1.0% (体积百分含量） 你 DNA 聚合酶 0.02U~L ~ 21Ι/μ[ 模板 1,7ng/pL ~ 68ng4iL。
[0046] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法 中，扩增的体系包括以下组分：
[0047] FIP ?.6μηιοΙ /L BIP i.6umol /L FOP 0.2umol /L r BOP 0.2iimol /L dNTPs 1,4mmol /L 甜菜減（Betaine ) 0,8mmol /L Tris-HCI(pH8.8) 20mmol /L KC1 lOmmol /L SO, lOmmol /L MgS〇4 8mmol /1. Tween20 0.1% (体积百分含量） Bs/ DNA 聚合酶 0.32U/pL 模板 6.8ng/u.L〇
[0048] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法 中，当采用荧光显色法检测扩增产物时，扩增的体系中还包括2%?4%的钙黄绿素。
[0049] 优选地，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中，环介导等温扩增的 反应程序为：61°C?65°C，30min?60min ;4°C，保存。
[0050] 本发明还提供了一种利用本发明提供的引物组检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的方 法，包括：
[0051] 获得待测生物样品，以具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有 如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的 上游内部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物扩增待测生物样品， 得扩增产物；检测所得扩增产物，根据检测结果判断待测生物样品中是否含有锦鲤疱疹病 毒Sph基因；
[0052] 该引物组包括以下引物：
[0053] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0054] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0055] 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
[0056] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
[0057] 本发明提供了一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用。本发明 提供的用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组包括：具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序 列的上游外部引物，具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物，具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游内部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引 物。本发明提供的引物组为根据锦鲤疱疹病毒Sph基因设计获得的，特异性强、灵敏度高， 适用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试 齐U。实验结果证实，本发明提供的引物组能够特异性扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，相比普通 PCR，检测灵敏度高出两个数量级，可以用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于 制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0058] 图1示实施例1引物筛选结果所得扩增曲线，曲线1代表第1组引物组所对应的 扩增曲线；曲线2代表第2组引物组所对应的扩增曲线；曲线3代表第3组引物组所对应的 扩增曲线；曲线4代表第4组引物组所对应的扩增曲线；曲线5代表第5组引物组所对应的 扩增曲线；曲线6代表第6组引物组所对应的扩增曲线；曲线7代表第7组引物组所对应的 扩增曲线；
[0059] 图2示实施例2的扩增产物检测结果，1号反应管代表实验组1，扩增产物为绿色； 2号反应管代表实验组2,扩增产物为绿色；3号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅橙 色；
[0060] 图3示实施例3的扩增产物检测结果，1号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅 橙色；2号反应管代表实验组1，扩增产物为绿色；3号反应管代表实验组2,扩增产物为绿 色；
[0061] 图4示实施例4的扩增产物的检测结果，1号反应管代表实验组1，扩增产物为绿 色；2号反应管代表实验组2,扩增产物为绿色；3号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅 橙色；
[0062] 图5示实施例5中LAMP法第一次扩增实验结果，其中样品1示2. 66 X 101(lcopies/ yL 的模板；样品 2 示 2.66X 109copies/yL 的模板；样品 3 示 2.66X 108copies/yL 的 模板；样品4不2· 66X 107copies/ μ L的模板；样品5不2· 66X 106copies/ μ L的模板；样 品6示2. 66 X 105copies/μ L的模板；样品7示2. 66 X 104copies/μ L的模板；样品8示 2. 66 X 103copies/ μ L的模板；Α为蓝色；Β为红色；C为绿色；
[0063] 图6示实施例5中LAMP法第二次扩增实验结果，其中样品1示2. 66 X 101(lcopies/ yL 的模板；样品 2 示 2.66X 109copies/yL 的模板；样品 3 示 2.66X 108copies/yL 的 模板；样品4不2· 66X 107copies/ μ L的模板；样品5不2· 66X 106copies/ μ L的模板；样 品6示2. 66 X 105copies/μ L的模板；样品7示2. 66 X 104copies/μ L的模板；样品8示 2. 66 X 103copies/ μ L的模板；Α为蓝色；Β为红色；C为绿色；
[0064] 图7示实施例5中LAMP法第三次扩增实验结果，其中样品1示2· 66X 101Qcopies/ yL 的模板；样品 2 示 2.66X 109copies/yL 的模板；样品 3 示 2.66X 108copies/yL 的 模板；样品4不2· 66X 107copies/ μ L的模板；样品5不2· 66X 106copies/ μ L的模板；样 品6示2. 66 X 105copies/μ L的模板；样品7示2. 66 X 104copies/μ L的模板；样品8示 2. 66 X 103copies/ μ L的模板；Α为蓝色；Β为红色；C为绿色；
[0065] 图8示实施例5中普通PCR法扩增的实验结果，其中其中泳道1示 2. 66 X 101Qcopies/μ L 的模板；泳道 2 示 2. 66 X 109copies/μ L 的模板；泳道 3 示 2. 66 X 108copies/μ L 的模板；泳道 4 示 2. 66 X 107copies/μ L 的模板；泳道 5 示 2. 66 X 106copies/μ L 的模板；泳道 6 示 2. 66 X 105copies/μ L 的模板；泳道 7 示 2. 66 X 104copies/μ L 的模板；泳道 8 示 2. 66 X 103copies/μ L 的模板；
[0066] 图9示实施例6中第一次扩增实验中不同的模板LAMP扩增所得扩增曲线的柱状 图；样品1示模板1所得扩增曲线；样品2示模板2所得扩增曲线；样品3代表模板3所得 扩增曲线；样品4代表模板4所得扩增曲线；样品5代表空白对照组;A为蓝色；B为红色； C为绿色；
[0067] 图10示实施例6第二次扩增实验中不同的模板LAMP扩增所得扩增曲线的柱状 图；样品1示模板2所得扩增曲线；样品2示模板3所得扩增曲线；样品3代表模板1所得 扩增曲线；样品4代表模板4所得扩增曲线；样品5代表空白对照组;A为蓝色；B为红色； C为绿色；
[0068] 图11示实施例6第三次扩增实验中不同的模板LAMP扩增所得扩增曲线的柱状 图；样品1示模板2所得扩增曲线；样品2示模板1所得扩增曲线；样品3代表模板3所得 扩增曲线；样品4代表模板4所得扩增曲线；样品5代表空白对照组;A为蓝色；B为红色； C为绿色；
[0069] 图12示实施例7中PCR法扩增实验的检测结果；Μ为DNA分子量Marker ; 1代表 阳性对照；2代表阴性对照；3代表皮肤黏液生物样品；4代表脑生物样品；5代表心脏生物 样品；6代表血液生物样品；7代表肾脏生物样品；8代表肌肉生物样品；
[0070] 图13示实施例7中LAMP法扩增实验的检测结果；样品1代表阳性对照；样品2代 表阴性对照；样品3代表肌肉生物样品；样品4代表血液生物样品；样品5代表肾脏生物样 品；样品6代表脑生物样品；样品7代表皮肤黏液生物样品；样品8代表心脏生物样品；A为 蓝色；B为红色；C为绿色；
[0071] 图14示实施例8中利用试剂盒扩增模板时，所得扩增曲线的柱状图；样品1示阴 性对照所得扩增曲线；样品2示模板所得扩增曲线；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
[0072] 图15示本发明实施例9的检测结果，1号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅橙 色；2号反应管代表待测样品，扩增产物为绿色；3号反应管代表阳性对照组，扩增产物为绿 色；
[0073] 图16示实施例10的检测结果，1号反应管代表阳性对照组，1号反应管中含有白 色浑浊沉淀物；2号反应管代表待测样品，2号反应管中含有白色浑浊沉淀物；3号反应管代 表空白对照组，3号反应管澄清。
【具体实施方式】
[0074] 本发明公开了一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用。本领域技 术人员可以参考本文内容，获得该引物组，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的 制备方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神 和范围内对本文制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0075] 本发明提供的用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用中所用到的试 剂和原料均可由市场购得。
[0076] 为了使本【技术领域】的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施 例，进一步阐述本发明。
[0077] 实施例1特异性引物组的筛选 [0078] 引物设计：
[0079] 根据锦鲤疱疹病毒Sph基因（GenBank登录号AB375381. 1)，利用PrimerExplorer V4 在线软件 http://primerexplorer. jp/elamp4. 0· 0/index. html，设计合成用于检测锦 鲤疱疹病毒的LAMP引物：通过综合考虑碱基组成、GC含量、二级结构的形成、Tm值、引物 之间的距离、引物末端的稳定性等因素，设置和调整引物设计软件参数，共设计合成获得10 组引物，以用于LAMP引物的筛选。LAMP法所需引物中上游外部引物、下游外部引物、上游内 部引物和下游内部引物是必须的，也直接决定了扩增的灵敏度和特异性。本实施例合成的 10组引物及各个引物对应的核苷酸序列见表1。
[0080] 表1 10组引物及各个引物对应的核苷酸序列
[0081]
【权利要求】
1. 用于检测锦鲤疱疹病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物： 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物； 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物； 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游内部引物； 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
2. 如权利要求1所述的引物组在制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂中的应用。
3. -种检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的 引物组。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述上游外部引物的浓度为 0· 05 μ mol/L ?0· 5 μ mol/L〇
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述下游外部引物的浓度为 0· 05 μ mol/L ?0· 5 μ mol/L〇
6. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述上游内部引物的浓度为0. 8 μ mol/ L ?2· 0 μ mol/L〇
7. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述下游内部引物的浓度为0. 8 μ mol/ L ?2· 0 μ mol/L〇
8. 利用如权利要求1所述的引物组扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法，其特征在于，包 括： 获得待测生物样品，以具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有如 SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游 内部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物扩增所述待测生物样品。
9. 利用如权利要求1所述的引物组检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法，其特征在于，包 括： 获得待测生物样品，以具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有如 SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游 内部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游内部引物扩增所述待测生物样品， 得扩增产物；检测所述扩增产物，根据检测结果判断所述待测生物样品中是否含有锦鲤疱 疹病毒Sph基因。
【文档编号】C12Q1/70GK104152580SQ201410381598
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月5日 优先权日:2014年8月5日
【发明者】王伟利, 孟庆峰, 魏春艳, 刘韬, 姚贵哲 申请人:中华人民共和国吉林出入境检验检疫局