一种绵羊y染色体特异微卫星位点检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒及应用，该试剂盒包括待测样品模板DNA:0.6yL;特异微卫星上游引物：0.2yL;下游引物：0.2yL;核酸扩增体系6XBuffer1yL、dNTP0.8yL、TaqDNA聚合酶0.2yL，最后加ddH20至10uL的混合物。本发明是在绵羊Y染色体特异区域筛选出的一个微卫星位点，该位点经应用在公羊上能够扩增出产物，而在母羊样本上无扩增产物。经进一步研究公羊群体，具有一定多态性，说明利用该位点既可以进行绵羊早期胚胎性别鉴定，有可以用于绵羊父系起源进化研究。
【专利说明】-种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学【技术领域】，涉及一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒 及其应用。
【背景技术】
[0002] 常染色体微卫星和mtDNA标记研究家养动物的起源，忽略了父本的遗传效应，有 一定局限性。近年来，Underhill P A等许多研究者意识到Y染色体上的遗传标记是研究 物种起源、进化和迁移理想的工具。作为父系遗传的染色体，绝大部分为非重组区，故单倍 型保持完整，不易受重组和回复突变影响，突变率低，比微卫星标记更能稳定遗传，是进化 事件的忠实记录者。再者，由于染色体为单倍体，其有效群体大小远小于常染色体位点，较 易产生生物群体特异的单倍型。
[0003] 关于绵羊Y染色体微卫星分子遗传标记研究，国内外文献仅发现SRYM18 -个复合 微卫星位点，而选用近缘物种牛的Y染色体微卫星位点（INRA124、INRA126、INRA189)在绵 羊Y染色体上的应用研究，结果该位点引物在公羊和母羊均能扩增出产物，说明无特异性， 对于Y chromosome microsatellite DNA mark研究在人、牛（水牛）、马上研究较多。因 此，需要挖掘绵羊Y染色体潜在微卫星位点，作为绵羊早期胚胎性别鉴定和遗传进化研究。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种绵羊Y染色体特异微卫星位点 检测试剂盒及其应用。其技术方案如下：
[0005] -种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒，包括待测样品模板DNA :0. 6 y L ; 特异微卫星上游引物：〇. L ;下游引物：0. L ;核酸扩增体系6XBuffer I ii L、dNTP 0. 8 ii L、TaqDNA聚合酶0. 2 ii L，最后加ddH20至10 ii L的混合物。
[0006] 一种本发明所述绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒的应用，包括以下步 骤：待测样品DNA提取、PCR扩增、PCR产物琼脂糖电泳检测、SDS-PAGE检测和PCR产物测 序，具体为：
[0007] (1)待测样品DNA提取，选取公羊和母羊血液样品，利用酚-氯仿法提取待测样品 基因组DNA，经纯度检测，稀释至lOOng，以满足PCR扩增要求。
[0008] (2) PCR扩增在本试剂盒中加入待测DNA样品进行PCR扩增，扩增条件是94°C预变 性3分钟，94°C变性30秒，58. 5°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30个循环。
[0009] (3) PCR产物琼脂糖电泳检测，取PCR产物2 ii L和6 X Buffer3 ii L混匀加入2 %琼 脂糖凝胶中，在电压120V，电流80A下电泳30分钟，经紫外检测拍照，结果公羊均有扩增产 物，母羊无扩增产物。
[0010] (4)SDS-PAGE检测，取公羊PCR产物与变性剂去离子甲酰胺，以3 : 7的比例混合， 在95°C条件下变性10分钟，然后在10%丙烯酰胺凝胶电泳22小时，经固定-染色-脱色 后，凝胶成像仪拍照，电泳条件是电压220V，内外环境温度是17°C。
[0011] (5) PCR产物测序，PCR产物经纯化后送生物公司测序，验证是否具有微卫星特征， 测序结果附后。
[0012] 本发明的有益效果：
[0013] 本发明是在绵羊Y染色体特异区域筛选出的一个微卫星位点，该位点经应用在公 羊上能够扩增出产物，而在母羊样本上无扩增产物。经进一步研究公羊群体，具有一定多态 性，说明利用该位点既可以进行绵羊早期胚胎性别鉴定，有可以用于绵羊父系起源进化研 究。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为PCR反应条件；
[0015] 图2为琼脂糖检测结果；图2a为公母羊样本琼脂糖电泳检测结果图，M :表示 MARK ; S :公羊样本；早：母羊样本，图2b为公羊样本琼脂糖电泳检测结果图，M :表示MARK ; 古：公羊样本；
[0016] 图3为公羊样本PCR产物SDS-PAGE结果。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0018] 血液基因组DNA提取（采用传统酚-氯仿抽提法）
[0019] (1)冷冻血液在室温融化以后，取500 ill移至离心管中，加入等体积PBS缓冲液， 混合，充分摇动，12000rpm离心IOmin,弃去上清液。
[0020] (2)再取500 ill血液移至离心管中，加入等体积PBS缓冲液，混合，充分摇动， 12000rpm离心IOmin,弃去上清液。
[0021] (3)加入500 UlDNA抽提缓冲液（20% SDS)，重悬沉淀物。
[0022] (4)加入蛋白酶K至终浓度为IOOii g/ml，混勻，用封口膜封住，55°C水浴过夜。
[0023] (5)将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，缓慢的颠倒离心管10分钟，直至两相混 合形成乳池液，12000rpm离心IOmin,吸上清。
[0024] (6)取上清，再加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1)，缓慢的颠倒离心 管 lOmin，12000rpm 离心 lOmin，吸上清。
[0025] (7)取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24 : 1)，缓慢的颠倒离心管lOmin， 12000rpm离心lOmin，吸上清。
[0026] (8)取上清，加入2倍体积的无水冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色 DNA沉淀。
[0027] (9) 12000rpm离心IOmin ;弃上清，然后加4°C预冷的70 %乙醇洗两次，12000rpm 离心IOmin,弃上清。
[0028] (10)将DNA干燥（注意不能太干燥）。
[0029] (11)加适量TE溶解，_20°C冷冻保存备用。
[0030] Y染色体微卫星引物设计
[0031] 利用近缘物种Y染色体特异序列比对，寻找哺乳动物Y染色体具有微卫星特征的 保守序列，再利用Primer5. O设计引物，引物如下：
[0032] 上游引物：5' -GITGAGGACTCTTGCATCTG-3'，如 SEQ ID NO :1 所示。
[0033] 下游引物：3，-CACAGGCCTAGAAGAITGAG-5，，如 SEQ ID NO :2 所示。
[0034] 重复序列（GT) n
[0035] PCR扩增及结果检测
[0036] ( 一）反应体系（10 U L)
[0037] 6 X Buffer ：1 U L
[0038] dNTP ：0. 8u L
[0039] 上游引物：0.2 ii L [0040]下游引物：0.2iiL
[0041] TaqDNA 聚合酶：0? 2 ii L
[0042] 模板DNA:0.6uL
[0043] 加 ddH20 至 10 U L
[0044] (二）反应条件如图1所示。
[0045] (三）琼脂糖检测结果如图2所示。
[0046] 该引物在公羊能扩增出产物，但在母羊样本中未扩增出产物
[0047] (四）该位点PCR产物SDS-PAGE分析结果如图3所示。
[0048] 图3经分析，说明该位点具有一定多态性，可作为绵羊父系起源进化研究。
[0049] (五）测序结果如SEQ ID NO :3所示。
【权利要求】
1. 一种绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒，其特征在于，包括待测样品模板 DNA :0. 6 ii L ;特异微卫星上游引物：0. 2 ii L ;下游引物：0. 2 ii L ;核酸扩增体系6XBuffer I ii L、dNTP 0? 8 ii L、TaqDNA 聚合酶 0? 2 ii L，最后加 CldH2O 至 10 ii L 的混合物。
2. -种权利要求1所述绵羊Y染色体特异微卫星位点检测试剂盒的应用，其特征在于， 包括以下步骤：待测样品DNA提取、PCR扩增、PCR产物琼脂糖电泳检测、SDS-PAGE检测和 PCR产物测序，具体为： (1) 待测样品DNA提取，选取公羊和母羊血液样品，利用酚-氯仿法提取待测样品基因 组DNA，经纯度检测，稀释至lOOng，以满足PCR扩增要求； (2) PCR扩增在本试剂盒中加入待测DNA样品进行PCR扩增，扩增条件是94°C预变性3 分钟，94°C变性30秒，58. 5°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30个循环； (3) PCR产物琼脂糖电泳检测，取PCR产物2 ii L和6 X Buf fer3 ii L混匀加入2 %琼脂糖 凝胶中，在电压120V，电流80A下电泳30分钟，经紫外检测拍照，结果公羊均有扩增产物，母 羊无扩增产物； (4) SDS-PAGE检测，取公羊PCR产物与变性剂去离子甲酰胺，以3 : 7的比例混合，在 95°C条件下变性10分钟，然后在10%丙烯酰胺凝胶电泳22小时，经固定-染色-脱色后， 凝胶成像仪拍照，电泳条件是电压220V，内外环境温度是17°C ; (5) PCR产物测序，PCR产物经纯化后送生物公司测序，验证是否具有微卫星特征。
【文档编号】C12Q1/68GK104212891SQ201410415448
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】王玉涛, 韩建林, 罗玉柱, 郭丽君 申请人:王玉涛