一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子及应用，所述的标记分子为Opcml、Phex和Gdf10；本发明筛选出小鼠内耳干细胞特异性的细胞标记分子可以区分小鼠内耳干细胞与其他组织来源的细胞，也可为其他物种内耳干细胞特异性标记分子研究提供参考。
【专利说明】-种检测小鼠内耳干细胞的标记分子及应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小鼠内耳干细胞鉴定，特别涉及一种组合式细胞标记分子鉴定小 鼠内耳干细胞的新型方法，这种方法能特异性地鉴定分离和培养的小鼠内耳干细胞。 (二）
【背景技术】
[0002] 2003年首次从成年小鼠椭圆囊感觉上皮中发现了一类细胞：这些细胞在体外与 肌源性细胞联合培养可沿着中胚层方向分化；体内实验证明可在鸡胚原肠胚形成过程中向 3个胚层方向分化。这类细胞命名为内耳干细胞。体外诱导证明内耳干细胞可以分化为毛 细胞样细胞，提示内耳中存在干细胞或者毛细胞祖细胞。内耳干细胞具有自我更新和多分 化潜能，这种多潜能干细胞一个重要的特性就是在悬浮培养条件下可以形成球体。此后，研 究人员逐渐从耳蜗Corti器、大上皮脊、小上皮脊、前庭球囊和椭圆囊感觉上皮、三个半规 管的壶腹脊等不同组织中分离得到内耳干细胞。
[0003] 近年来的研究发现内耳干细胞具有多分化潜能，在特定的分化条件下可以发育成 内耳毛细胞。将内耳干细胞接种在多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，贴壁无血清培养。14 天之后，基因检测表明分化之后的细胞表达毛细胞特异性蛋白，说明有部分细胞分化为内 耳毛细胞。对这些分化后的毛细胞进行电生理检测，产生电压依赖性电流。内耳干细胞在 体外除了可以分化为毛细胞之外，还可以分化为内耳支持细胞、神经元和星形胶质细胞等， 说明内耳干细胞具有多分化潜能，在将来遗传性耳聋听力功能重塑再生医学方面具有重要 的应用价值。
[0004] 但是到目前为止，对内耳干细胞的研究不多。这主要是由于内耳干细胞的分离、 培养以及纯化存在一定的困难。虽然目前有研究发现了一些不同物种内耳干细胞表达的 基因，但这些基因尚缺乏较强的组织特异性，例如成鼠分离的内耳干细胞表达的Nestin， Pax-2, BMP-4以及BMP-7,在其他的组织中也有不同程度的表达。因此，到目前为止尚缺乏 针对内耳干细胞特异性的细胞标记分子，这对内耳干细胞的分离和纯化以及鉴定造成了一 定的困难，也是内耳干细胞应用研究方面存在的一个技术瓶颈。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种鉴定小鼠内耳干细胞的标记分子，并采用这种标记分子特 异性地鉴定小鼠内耳干细胞的方法；本发明是通过对分离的小鼠内耳干细胞进行细胞球培 养方法获得克隆的小鼠内耳干细胞，并提取小鼠内耳干细胞核糖核酸（RNA)进行小鼠基因 表达谱芯片检测小鼠内耳干细胞基因表达谱，然后筛选特异性候选基因。最后从新生小鼠 中提取出如大脑、肝脏、皮肤等10个不同组织的RNA，对候选的目的基因进行特异性检测， 确定小鼠内耳干细胞的特异性组合式细胞标记分子。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子，所述的标记分子为Opcml (核 苷酸序列为序列7所示）、Phex (核苷酸序列为序列8所示）和GdflO (核苷酸序列为序列 9所示）。
[0008] 本发明还提供一种所述的标记分子在检测小鼠内耳干细胞中的应用，所述的应用 为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别 以Opcml正向引物和Opcml反向引物，Phex正向引物和Phex反向引物，GdflO正向引物和 GdflO反向引物作为三对引物进行PCR扩增，若Opcml正向引物和Opcml反向引物扩增产物 920bp，Phex正向引物和Phex反向引物扩增产物258bp，且Gdf 10正向引物和Gdf 10反向引 物扩增产物381bp，则单细胞为小鼠内耳干细胞；
[0009] Opcml 正向引物：5' -ATGTACCATCCCGCCTACTG-3' ；
[0010] Opcml 反向引物：5, -CCAGGCCCATACAGGGTGAT-3,；
[0011] GdflO 正向引物：5' -CAGTTTGACTGGCTGGGCTA-3' ；
[0012] GdflO 反向引物：5' -GGTCCCCTGGATTACCCTTG-3' ；
[0013] Phex 正向引物：5 ' -AGGTGTCAAAACCCCTGCAA-3 ' ；
[0014] Phex 反向引物：5 ' -GGACAATCTTGGGCATGGGG-3 '。
[0015] 本发明所述检测小鼠内耳干细胞的标记分子按如下步骤筛选：
[0016] (1)内耳干细胞分离和成球培养
[0017] 解剖小鼠获得小鼠耳蜗基底膜后，将基底膜胰酶消化，用移液枪吹打散后，获得单 细胞，然后将单细胞悬浮在内耳干细胞培养基中，在37°C、5% CO2孵育箱中悬浮培养5-6 天，形成内耳干细胞球。本发明分离培养的小鼠内耳干细胞阳性表达Nestin、AbCg2、PaX-2、 BMP-4及BMP-7等基因。
[0018] (2)基因表达谱芯片检测基因表达谱与特异性候选基因筛选
[0019] 将分离的内耳干细胞总RNA进行Phalanx小鼠基因表达谱检测（检测单位：上海 仪方生物科技有限公司）。经对比内耳毛细胞以及内耳祖细胞后，对内耳干细胞差异表达性 基因进行进一步分析，从内耳干细胞中筛选出30个特异表达的基因。
[0020] (3)特异性组合式细胞标记分子验证
[0021] 根据内耳干细胞筛选的30种特异表达的基因，结合比较内耳祖细胞及毛细胞中 特异表达的基因，候选Opcml、Phex和Gdf 10共3种基因，对小鼠大脑、肝脏、皮肤、肺、肠、 胃、肾脏、肌肉、心脏及眼睛10个不同的组织及器官进行RNA提取后，聚合酶链反应（PCR) 检测这3种基因在不同组织细胞内的表达水平，验证出Opcml、Phex和GdflO三种分子组 合为小鼠内耳干细胞最佳组合式细胞标记分子。通过小鼠不同组织3种候选基因的分子检 测，只有在小鼠内耳干细胞中〇pcml、Phex和GdflO这三种基因都是阳性表达的。因此这三 种基因的组合阳性表达可作为小鼠内耳干细胞的分子标记。
[0022] 本发明提供的标记分子在小鼠内耳干细胞中是特异性表达的，通过Phalanx小鼠 基因表达谱的检测，表明Opcml、Phex和GdflO三种基因具有显著的高水平表达，可应用于 小鼠内耳干细胞的鉴定，用于小鼠内耳干细胞的分选和纯化依据，亦可应用于小鼠分离或 体外培养扩增的内耳干细胞分选以及纯化研究。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] (1)本发明筛选出小鼠内耳干细胞特异性的细胞标记分子OpcmUPhex和GdflO。
[0025] (2)以本发明提供的细胞标记分子可以区分小鼠内耳干细胞与其他组织来源的细 胞。
[0026] (3)使用本发明提供的细胞标记分子的阳性表达可鉴定小鼠内耳干细胞，为发展 新的分离纯化技术提供依据。
[0027] (4)本发明提供的细胞标记分子也可为其他物种内耳干细胞特异性标记分子研究 提供参考。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1小鼠内耳干细胞球显微图，A行为100X放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、 5天的形态，B行为250X放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、5天的形态；C行为用DAPI 对培养1、3、5天的内耳干细胞球染色后，250X放大倍数下显微图。
[0029] 图2小鼠内耳干细胞基因表达电泳图，泳道1为Marker，泳道2为GAPDH，泳道3 为Nestin，泳道4为Abcg2,泳道5为Pax-2,泳道6为BMP-4,泳道7为BMP-7。
[0030] 图3小鼠内耳干细胞球5-Brdu染色激光共聚焦显微图，a为使用DAPI观察内耳 干细胞球中的细胞核，b为Brdu抗体标志显微图，c为a与b合并图。
[0031] 图4小鼠内耳干细胞Nestin表达激光共聚焦显微图，a为使用DAPI观察内耳干 细胞球中的细胞核，b是Nestin抗体标志显微图，c为DAPI与Nestin共同标志显微图。
[0032] 图5候选基因在不同组织中的表达电泳图，泳道1为大脑，泳道2为肝脏，泳道3为 皮肤，泳道4为肺，泳道5为肠，泳道6为胃，泳道7为肾脏，泳道8为肌肉，泳道9为心脏， 泳道10为眼睛，泳道11为内耳干细胞。
[0033] 图6标志分子Opcml+Phex+GdflO在不同类型细胞中的表达电泳图，泳道1为内耳 单细胞检测Opcml，泳道2为内耳单细胞Phex，泳道3为内耳单细胞检测Gdf 10 ;泳道4为 肺组织细胞检测Opcml，泳道5为肺组织细胞检测Phex，泳道6为肺组织细胞检测Gdf 10 ; 泳道7为肠组织细胞检测Opcml，泳道8为肠组织细胞检测Phex，泳道9为肺组织细胞检测 表达Gdf 10。 (五）
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0035] 本发明实施例所用PBS的pH值均为7. 4。
[0036] 实施例1小鼠内耳干细胞的分离及培养
[0037] 1)将ICR小鼠（浙江省医学科学院）在-20°C冰箱中麻醉5分钟，浸入75%酒精 中杀菌。用手术剪将小鼠直接断头，去除皮毛。然后在无菌状态下中分头颅，去除大脑及脑 干，充分暴露位于颅底的颞骨。仔细的用剪刀和镊子分离出颞骨，将其转移到装有4°C预冷 PBS (pH值为7. 4)的3. 5cm培养皿中。显微镜下用镊子在耳蜗底部钻一个小孔，从下至上剖 开螺壳，暴露完整的蜗轴和蜗管。用镊子夹住耳蜗管的最底部，将耳蜗管与蜗轴分离。由此 得到的耳蜗管包括螺旋韧带、前庭膜、以及基底膜（包含Corti器）。将分离得到的耳蜗管 转移到新鲜4°C预冷的PBS中，进一步将包含Corti器的基底膜与前庭膜及螺旋韧带分离 开。将基底膜转移到100 μ L 0.05% (w/v)的胰酶（购自Gbico)中，37°C消化7分钟，力口 入100 μ I lmg/ml的大豆胰酶抑制剂（PBS缓冲液配制，购自Gbico, pH = 7. 4)终止胰酶反 应。
[0038] 2)用量程为200 μ L的移液枪吹打步骤1)反应物30-40次，使单细胞从基底膜中 脱落。细胞脱落后经70 μ m的细胞筛过滤，去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细 胞聚集的单细胞悬液。然后用内耳干细胞培养基稀释，细胞密度为l〇 5/ml，获得稀释后的 单细胞悬液。内耳干细胞培养基组成为：1% (v/v)B27(血清替代物B27)、2% (v/v)N2(血 清替代物N2)、20ng/mL EGF(表皮生长因子）、50ng/mL bFGF (碱性成纤维细胞生长因子）、 10ng/mL IGF-I (类胰岛素生长因子1)、50 μ g/ml青霉素，溶剂为DMEM/F12 (购自Gbico)， DMEM/F12 组成为 DMEM 和 Ham's F-12, pH 值为 L 4。
[0039] 3)稀释后的单细胞悬液经20 μ m的细胞筛过滤，获得单细胞悬液。
[0040] 4)取步骤3)获得的200 μ L单细胞悬液，用2mL内耳干细胞培养基稀释后在37°C、 5% CO2孵育箱中悬浮培养1-5天，其中内耳干细胞会形成内耳干细胞球，其它非干细胞的 细胞由于生长条件的限制而逐渐凋亡。分别取50 μ L培养1、3和5天的内耳干细胞培养基 滴于玻片上，在显微镜下分别放大100倍（图1中的A行）和250倍（图1中的B行）观 察内耳干细胞球。同时，分别取50 μ L培养1、3和5天的内耳干细胞培养基，让其中的内耳 干细胞球在玻片上贴壁后，用200 μ L DAPI试剂（Roche公司）孵育细胞球1-3分钟，进行 DAPI染色，并放大250倍观察内耳干细胞球，如图1中C行所示，每一个细胞球里有几十至 数百个细胞。
[0041] 实施例2内耳干细胞基因表达检测
[0042] 1)内耳干细胞总RNA提取：将实施例1中培养5天的含内耳干细胞球的培养基收 集在15ml离心管中，IOOOrpm离心5分钟弃上清；加入ImL TRIzol (TakaRa公司），置漩润 振荡器上震荡至内耳干细胞完全溶解后，转移至1.5ml EP管（Axgen公司）中；加入200 μ L 氯仿（国药集团化学试剂有限公司），剧烈振荡混匀，室温放置5min ;4°C下12, OOOrpm离心 15min，吸取上层水相约300 μ L入新的I. 5ml EP管中；加入等体积的异丙醇（国药集团化 学试剂有限公司），颠倒混勻，室温静置IOmin ;4°C下12, OOOrpm离心IOmin,弃上清；用体 积浓度75%的乙醇水溶液洗漆沉淀，4?下12, OOOrpm离心5min，弃上清；室温干燥2-5min 后，加入适量DEPC水（Sigma公司）溶解，即为内耳干细胞总RNA样品，用于下一步实验或 保存于_80°C冰箱。
[0043] 2) cDNA第一链合成：内耳干细胞总RNA样品用DNA酶（Sigma公司）消化处理清 除残余的基因组DNA污染，用紫外分光光度计测定（波长为260nm) RNA浓度。cDNA第一链 合成采用反转录试剂盒（Fermentas公司），取2 μ g总RNA(0. 5-1 μ L)用于第一链合成，平 行3次。具体步骤如下：2 μ g总RNA (0. 5-1 μ L)、1 μ L oligo (dT) 18引物和1 μ L随机引物， CldH2O 补至总体积 12μ L，置 65°C反应 5min ;加入 5Xbuffer 4μ L、dNTP2y L、ribolockTM RNase inhibitor 1 μ L 和 RevertAidTM M-MulV 反转录酶 1 μ L，反应总体积为 20 μ L，PCR 反应程序为25°C 5min - 42°C 60min - 70°C 5min，RNA反转录产物即为cDNA第一链，用 于下一步PCR反应。
[0044] 3)PCR反应：将步骤2)制备的cDNA第一链作为模板进行RT-PCR扩增，所用引物序 列见表1。PCR反应采用PCR Mix试剂盒（上海翊圣生物技术有限公司），PCR反应体系为： cDNA 2yL、2mM dNTP 1μ?、10μΜ 的上下游引物各 IyUlOXbufTer(含 1.5mM Mg2+)5yL 和TaqDNA聚合酶1 μ L，加 H2O补至总体积50 μ L。PCR程序为：94°C预变性5min，94°C变性 30s，53°C?62°C退火30s，72°C延伸30s，35循环，72°C延伸7min，退火温度和循环数根据 引物的具体情况进行选择。反应完成后取5 μ L扩增产物加1 μ L溴酚兰指示剂（Sigma公 司），用1. 2%的琼脂糖（Biowest公司）进行凝胶电泳。采用RT-PCR检测细胞球中干细胞 标志基因 Nestin、Abcg2以及内耳发育标志基因 Pax-2、BMP-4及BMP-7的表达情况，GAPDH 作为参照基因。电泳完毕后，用凝胶成像分析系统观测，结果如图2,表明实施例1中培养得 到的细胞球中含有内耳干细胞。
[0045] 表1用于RT-PCR的引物序列
[0046]
【权利要求】
1. 一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子，其特征在于所述的标记分子为Opcml、Phex 和 GdflO。
2. -种权利要求1所述的标记分子在检测小鼠内耳干细胞中的应用，其特征在于所述 的应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模 板，分别以Opcml正向引物和Opcml反向引物，Phex正向引物和Phex反向引物，GdflO正 向引物和Gdf 10反向引物作为三对引物进行PCR扩增，若Opcml正向引物和Opcml反向引 物扩增产物920bp，Phex正向引物和Phex反向引物扩增产物258bp，且GdflO正向引物和 GdflO反向引物扩增产物381bp，则单细胞为小鼠内耳干细胞； Opcml 正向引物：5' -ATGTACCATCCCGCCTACTG-3' ； Opcml 反向引物：5 ' -CCAGGCCCATACAGGGTGAT-3 ' ； GdflO 正向引物：5' -CAGTTTGACTGGCTGGGCTA-3' ； GdflO 反向引物：5' -GGTCCCCTGGATTACCCTTG-3' ； Phex 正向引物：5' -AGGTGTCAAAACCCCTGCAA-3' ； Phex 反向引物：5' -GGACAATCTTGGGCATGGGG-3'。
【文档编号】C12Q1/68GK104278029SQ201410495125
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】王金福, 柳全文 申请人:浙江大学