一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法，该方法由以下步骤组成：(1)取如SEQ ID NO.1所示的N端带有6个his标签的人端粒酶C端第936-1132片段的编码序列，经双酶切、连接反应克隆至含有绿色荧光蛋白基因GFP的穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒；(2)将得到的重组穿梭质粒进行PmeⅠ酶切线性化，通过与骨架质粒PAdEasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，得到重组腺病毒质粒；(3)将得到的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞进行重组包装，收集具有绿色荧光的细胞，得到细胞包装的重组腺病毒；(4)将得到细胞包装的重组腺病毒采用氯化铯梯度离心法进行纯化，得到重组腺病毒载体。本方法所得到的重组腺病毒载体不仅可抑制肿瘤细胞增殖，而且起效快。
【专利说明】一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含肽的医药配制品，具体涉及含人端粒酶逆转录酶（hTERT)C端的重 组载体的构建方法，该方法所得到的重组载体可抑制肿瘤细胞增殖。
【背景技术】
[0002] 人DNA末端是非编码的TTAGGG重复序列，即端粒。由于末端复制问题，正常体细 胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，当端粒缩短到一定程度不能维持DNA的稳定时，细胞即 开始凋亡或程序性死亡。肿瘤细胞与正常细胞的最大区别之一是90%以上的肿瘤细胞表达 端粒酶活性，可以延长端粒，使肿瘤细胞得以永生。因此，端粒酶成为识别肿瘤细胞和正常 细胞的重要标志之一，成为抗肿瘤作用的重要靶点。
[0003] 传统的通过抑制端粒酶活性抗肿瘤作用的抑制剂，如针对端粒酶模板区（hTR) 或逆转录酶（hTERT)的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxyribonucleotides，ASODN) 都是抑制端粒酶活性，使端粒缩短而发挥抗肿瘤作用。但即使是肿瘤细胞其端粒也足够 长（2?10kb)，体外培养的细胞倍增时间一般>10h，即使没有端粒酶，每天端粒缩短也只 有 0.1 ?0.2kb (Harley CB et al. Nature. 1990. 345 (6274): 458-460)。所以，端粒酶完 全被抑制使端粒缩短到临界点时一般也需要7?30天甚至更长才能发挥作用，尤其是 体内给药时（肿瘤细胞体内的倍增时间>30天）。在这个漫长的过程中，许多细胞的端 粒依然得以维持或代偿，使得效果难以理想，往往都需要与化疗或放疗合用。近年来发 现，端粒酶除了通过延长端粒促进肿瘤生长外，还有端粒外作用，如直接与NF-kB靶基因 启动子DNA结合并与P65亚基作用启动有关的癌基因表达（Martinez Pet al. Nat Rev Cancer. 2011. 11(3):161-176 ；Ghosh A et al. Nat Cell Biol. 2012. 14(12):1270-1281) 等，这些端粒外功能同样可以促进肿瘤的生长。目前的端粒酶抑制剂都是针对缩短端粒设 计的，对端粒外功能没有影响，这也是端粒酶抑制剂效果不理想的重要原因之一。这类药物 中研究较多、也是唯一进入临床试验的药物是GRN163L (又叫Imetelstat)，但起效慢，效果 也难以令人满意（Crees Z et al.Curr Pharm Des.2014;20(41):6422-37)。
[0004] 另一类进入临床试验的针对端粒酶逆转录酶的抗肿瘤药物是hTERT抗原肽。肿瘤 细胞可以将hTERT的部分肽段呈递在细胞膜上作为肿瘤细胞的特异性抗原，将这些特异性 抗原呈递给树突状细胞（DCs)可诱发细胞毒性T细胞杀伤肿瘤细胞作用。体外合成这些短 肽或用病毒载体表达这些短肽作为抗原，可特异性杀伤端粒酶阳性的肿瘤细胞，如Vx-001 疫苗（Kotsakis A et al. Ann Oncol. 2012, 23 (2): 442-9)。hTERT 抗原肽用于肿瘤的免疫 治疗，免疫原性较低，治疗窗较窄，只适用于表达相应的hTERT抗原肽的肿瘤细胞，临床使 用首先要筛选肿瘤抗原类型，分离自身树突状细胞并反复致敏后回输体内。操作复杂，疗效 较低。
【发明内容】
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[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的 构建方法，该方法所得到重组腺病毒载体不仅可抑制肿瘤细胞增殖，而且起效快。
[0006] 本发明解决上述技术问题的方案如下：
[0007] -种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法，该方法由以下步骤组成：
[0008] (1)取如SEQ ID NO. 1所示的N端带有6个his标签的人端粒酶C端第936-1132 片段（命名为C197)的编码序列，经双酶切、连接反应克隆至含有绿色荧光蛋白基因GFP的 穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒（命名为PAdTrack-GFP-C197);
[0009] (2)将得到的重组穿梭质粒进行Pme I酶切线性化，通过与骨架质粒PAdEasy-1在 BJ5183细菌中进行同源重组，得到重组腺病毒质粒；
[0010] (3)将得到的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞进行重组包装，收集具有绿色荧光 的细胞，得到细胞包装的重组腺病毒；
[0011] (4)将得到细胞包装的重组腺病毒采用氯化铯梯度离心法进行纯化，得到重组腺 病毒载体（命名为Ad-GFP-C197)。
[0012] 上述方法中，所述SEQ ID NO. 1所示基因片段由上海生物公司根据本发明人所提 供的序列合成。
[0013] 上述方法中，含有绿色荧光蛋白基因GFP的重组腺病毒载体系统AdEasy-1由南 方医科大学李红卫教授惠赠，其制备方法参照以下文献所记载方法进行：Xia〇-Ying He， et al. Recombinant adenovirus-mediated human telomerase reverse transcriptase gene can stimulate cell proliferation and maintain primitive characteristics in bovine mammary gland epithelial cells. Develop. GrowthDiffer. (2011)53,312 - 322。
[0014] 本发明是将hTERT羧基端（c-端）197个氨基酸的DNA重组到腺病毒载体，该载 体进入肿瘤细胞后高效表达目的蛋白（C197)。hTERT是含有1132个氨基酸的蛋白质，包 括N-端、逆转录区、C-端。其中，C-端主要是与端粒DNA结合区，含核转位的关键信号，可 以进入细胞核。由于本发明所述的人端粒酶C端第936-1132片段（C197)失去了 N-端和 逆转录区，因此其本身没有端粒酶活性，但可以与hTERT竞争端粒结合位点，抑制端粒酶活 性。以端粒酶为靶点的的其他药物，因其抑制端粒酶活性可使端粒缩短，但端粒酶活性抑制 至端粒缩短到临界值至少需要20天以上，起效时间较长。如目前唯一进入临床试验的针对 端粒酶活性的抑制剂GRN163L对体外胰腺癌细胞增殖抑制作用起效在40天后（Burchett KM et al. Telomerase inhibitor Imetelstat (GRN163L)limits the lifespan of human pancreatic cancer cells PLoS One. 20149 (1) : e85155?图 3b.)。而本发明所述的重组腺 病毒Ad-GFP-C197能够高效表达C197cDNA序列，并能够同时与NF-kB靶基因启动子DNA 结合，抑制NF-kB的转录活性，因此在第三天就开始抑制肿瘤细胞增殖，动物实验中也可 快速抑制肿瘤生长。可见，本发明所述重组腺病毒的优势是同时通过端粒和端粒外作用抑 制肿瘤细胞增殖，起效快。
[0015]
【专利附图】
【附图说明】：
[0016] 图1为构建本发明所述的重组腺病毒Ad-GFP_C197的流程图，其中，⑷图是穿梭 质粒的结构示意图，（B)图是骨架质粒的结构示意图。
[0017] 图2为重组腺病毒质粒PAd-GFP_C197双酶切后琼脂糖凝胶图。
[0018] 图3为重组腺病毒质粒PAd-GFP-C197测序图。
[0019] 图4为重组腺病毒Ad-GFP-C197的一组鉴定结果图，其中，（A)图是转化后得 HEK-293细胞出现70%左右荧光的显微照片，（B)图是蛋白免疫印迹图，表明C197cDNA片 段在细胞内高效表达，（C)图是mRNA相对表达量柱状图，荧光定量PCR实验表明C197mRNA 在细胞内高效转录。
[0020] 图5重组腺病毒Ad-GFP-C197体外抑制肿瘤细胞增殖实验（MTT)的一组增殖曲线 图，其中，（A)图是Hela细胞的增殖曲线图，（B)图是Cac 〇2细胞的增殖曲线图，（C)图是 MCF-7细胞的增殖曲线图，（D)图是SGC7901细胞的增殖曲线图。
[0021] 图6为重组腺病毒Ad-GFP-C197对裸小鼠体内皮下移植瘤生长抑制的一组实验结 果图，其中，（A)图为Ad-GFP_C197对control肿瘤块组织与control裸鼠瘤生长抑制前后 的照片；(B)图为肿瘤生长曲线图，p〈0. 05, n = 6 ; (C)图为肿瘤重量柱状图，p〈0. 05, n = 6〇
【具体实施方式】
[0022] 例1 (构建重组腺病毒载体）
[0023] 一、材料：
[0024]1、重组腺病毒骨架质粒PAdEasy-1和穿梭质粒PAdTrack-GFP-CMV，BJ5183、 DH5 a、HEK293细胞、Hela细胞均本实验室保存；
[0025]2、引物：用DNAMAN软件设计扩增SEQ ID NO. 1所示DNA序列的引物，该引物由上 海生物公司合成，具体为：
[0026] 引物 1 :5, -AGGGTCGACACCATGCATCATCACCATCACCAT-3,（SEQ ID N0. 2)，
[0027] 引物 2 :5'-TGGATATCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA-3'（SEQ ID NO. 3);
[0028] 3、SEQ ID NO. 1所示C197DNA序列由上海生物公司合成，并克隆至PGSI载体中保 存；
[0029]4、工具酶 Sal I、Ecor V、Pme I、Pac I 均购自 Takara 公司；
[0030] 5、T4DNA连接酶、Ex-Tag酶均购自Thermo公司；
[0031]6、6_his tag抗体，羊抗鼠IgG抗体，0-Actin抗体均购自Santa公司。
[0032] 二、方法：
[0033] 参见图1本发明所述重组腺病毒载体的构建方法如下：
[0034] 1、his-C197DNA 片段克隆至穿梭质粒 PAdTrack-GFP-CMV 中
[0035] (1)将含SEQ ID NO. 1所示C197DNA片段的pGSI载体进行双酶切（Sal I和Ecor V酶），酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收C197DNA片段。
[0036] (2)穿梭质粒PAdTrack-GFP-CMV分别用Sal I和Ecor V限制性内切酶进行双酶 切，随后在T4DNA连接酶作用下与C197DNA片段在37°C连接过夜，连接产物经琼脂糖凝胶鉴 定大小正确后回收，获得重组穿梭质粒PAdTrack-GFP-C197。
[0037] 2、同源重组得到重组腺病毒质粒：
[0038] (1) Pme I酶切线性化PAdTrack-GFP_C197后将其转化进入到含有骨架质粒 PAdEasy-1的BJ5183细菌中进行同源重组，得到重组腺病毒质粒。
[0039](2)以重组腺病毒质粒为模板，(：197(^嫩片段的上游引物5￡〇10勵.2，下游引物 SEQ ID NO. 3进行PCR扩增鉴定和基因序列测序，同时用SalI和Ecor V限制性内切酶对 质粒进行双酶切鉴定。
[0040] 3、重组腺病毒的包装
[0041] (1)将重组大质粒用Pac I酶切线性化后，用脂质体2000将线性化产物转染进入 HEK293细胞中进行腺病毒包装,一周后可观察到绿色荧光。
[0042] (2)待细胞出现CPE病变现象时，收集细胞，反复冻融3次，离心（3000r，4°C)收 集上清，得到重组腺病毒原液。
[0043] 4、重组腺病毒的扩增与纯化
[0044] (1)将收集好的重组腺病毒Ad-GFP-C197原液感染新一批对数生长期的HEK293细 胞，待细胞出现CPE病变现象，收集细胞，反复冻融3次，离心（3000r，4°C)收集病毒液。
[0045] (2)取2根Backman管，用75%乙醇浸泡30min后，于超净台风干。
[0046] (3)将配制好1. 4和1. 2CsCl分别取2. 5ml装入Backman管中（每管容量为5ml), 记。
[0047] (4)吸取备用的病毒液置于含有CsCl的Backman管中，用DMEM补平管口即可。
[0048] (5)将Backman管置于离心机真空离心，20000r，2h。
[0049] (6)小心取出Backman管可以看到明显的两条乳白色带，上层为病毒带，下层为杂 带。
[0050] (7)取出5ml注射器，在超净台中于病毒带位置插进针头，并吸出病毒带，并将病 毒液置入透析袋中，在透析液中4°C搅拌下进行透析，得到重组腺病毒载体Ad-GFP-C197。
[0051](8)透析后，取出透析袋，将病毒收集并分装于-80°C储存即可。
[0052]三、重组腺病毒载体Ad-GFP_C197的滴度测定
[0053] (1)以无血清培养基梯度稀释重组腺病毒Ad-GFP_C197从1(T 2到KT6,取对数生长 期的HEK293细胞消化、计数、铺24孔板，每孔2*105个细胞，每个梯度设3个复孔。
[0054] (2)待细胞贴壁后每孔滴加50ul稀释好的对应梯度下的病毒样品。
[0055] (4) 37°C，5% C02培养箱培养48h，直接荧光显微镜下计数没视野荧光细胞数，每 个梯度计数3个复孔，以每视野荧光细胞数10-50个为最佳。
[0056] (5)测得病毒滴度以PFU/ml表示，每个荧光细胞对应一个绿色荧光形成单位。依 公式：滴度（PFU/ml)=(-个视野的荧光数*每孔对应的视野数）/[加入病毒体积（ml)* 稀释倍数]计算，上述步骤二所构建的重组腺病毒载体的病毒滴度为3. MXlO^FU/ml。
[0057] 四、重组腺病毒载体Ad-GFP_C197的鉴定
[0058] 1、采用本发明构建包装重组腺病毒是否成功有以下两种鉴定方法：
[0059] (1)由于GFP蛋白序列和C197DNA序列在重组腺病毒穿梭载体中由不同启动子启 动，即非融合表达，所以当GFP蛋白表达出现绿色荧光也可推断C197DNA序列也成功表达。 当重组腺病毒Ad-GFP-C197感染细胞后，24h观察到绿色荧光说明重组腺病毒包装成功。
[0060] (2)重组腺病毒Ad-GFP-C197感染HEK293细胞后，收集细胞分别采用RT-PCR和 western blot进行C197mRNA和蛋白的检测，验证C197基因的表达，如果C197mRNA转录和 蛋白均表达，则进一步说明重组腺病毒构建成功。
[0061] 具体步骤如下：
[0062] 于6孔板中每孔铺2*105个细胞，分别将M0I = 100的Ad-GFP-C197和Ad-GFP转 染Hela细胞48h，提取6孔板中细胞的总蛋白和总RNA分别行免疫印迹实验和荧光定量PCR 实验。
[0063] 免疫印迹实验是通过SDS-PAGE将Hela细胞提取液中的各种蛋白按照相对分子质 量大小分离。采用湿式转膜（l〇〇v，90min)将蛋白转印至PVDF膜上。分别用一抗（his-tag 一抗稀释度1:1〇〇〇和6八?011-抗稀释度1:2000)41：孵育过夜，1打831'漂洗膜71^113次。 最后将膜在室温下孵二抗（辣根过氧化物酶标记，稀释浓度为1:5000)，2h后用1*TBST漂 洗膜7min 3次，加上ECL发光液，进行显影，定影和曝光。Trizol法提取6孔板中细胞的总 RNA，用C197的引物（引物序列同上）行荧光定量PCR实验，以内参GAPDH为对照组，验证 其mRNA的转录情况。
[0064] 2、鉴定结果
[0065] 双酶切产物跑胶后可见650bp条带（见图2)，测序结果也和目的序列一致（见图 3)，则重组腺病毒大质粒PAd-C197构建成功，包装后可见绿色荧光出现（见图4A)，初步证 明该重组腺病毒表达系统正确。RT-PCR结果中his-C197mRNA转录水平是内参GAPDH的 两倍（见图4B)，免疫印迹结果表明his-C197蛋白在重组腺病毒系统中表达（见图4C)， 进一步验证了重组腺病毒Ad-GFP-C197表达成功，即本发明所述的一种重组腺病毒载体 Ad-GFP-C197已成功建立。
[0066] 例2 (抗肿瘤作用效果实验）
[0067] 一、作用对象
[0068] 肿瘤细胞：Hela细胞，SGC7901细胞，MCF-7细胞和CaC02细胞
[0069] 裸鼠成瘤：Hela细胞实体瘤，裸鼠是4-6周龄
[0070] 二、实验方法
[0071] 1、本发明所述的重组腺病毒Ad-GFP_C197用于感染多种肿瘤细胞并抑制细胞增 殖实验（MTT)的具体步骤如下：
[0072] (1)将Hela、MCF-7、SGC7901和CaC02细胞每孔1*104个铺于96孔板中，待细 胞贴壁后将本发明所述重组腺病毒Ad-GFP-C197以M0I = 100分别感染肿瘤细胞（Hela、 SGC7901、MCF-7和CaC02)，同时以空白对照组（正常细胞）和对照病毒组Ad-GFP(空载体 病毒）作为对照，每组设6个复孔。
[0073] (2)次日在荧光显微镜下观察绿色荧光表达，每隔24h采用MTT法进行测定，即弃 去培养基，每孔加入含有lOOul 5mg/ml MTT的培养基，37°C，5% C02浓度下培养4h ;
[0074] (3)取出板后，4°C、3000r离心lOmin，弃上清；加入100ul DMS0,振荡lOmin，于 490nm波长的酶标仪测量0D值。
[0075] (4)实验连续7d，根据每天的0D值（X土SD)绘制细胞增殖曲线，比较重组腺病毒 Ad-GFP-C197对肿瘤细胞的抑制情况。
[0076] 2、本发明所述的重组腺病毒Ad-GFP_C197对裸小鼠体内皮下移植瘤生长抑制实 验，具体步骤如下：
[0077] (1)将处于对数生长期的Hela细胞弃去培养基，PBS洗2遍，加入1ml胰酶，待消 化好后加3ml全培终止消化。
[0078] (2)将全部细胞液转入50ml离心管中，1000r离心4. 5min，用PBS洗两遍。用 4°C PBS:Matrigel (9. 4mg/ml) (1 :1)调整细胞密度为 5X 107 个 /ml，Matrigel 胶的终浓度 为2. 5mg/ml。细胞混悬液收集于50ml已灭菌青霉素瓶中，密封，置于冰上备用。
[0079] (3)每只裸小鼠后肢背部皮下接种Hela细胞混悬液0.2ml，待肿瘤生长至直径 为4-6mm，将裸鼠分为二组：重组腺病毒Ad-GFP-C197组和control组（即Ad-GFP组）。 Ad-GFP-C197和Ad-GFP均以1*10 9PFU/次/只进行瘤内注射，给药五周后则停止给药，每次 给药均测量肿瘤大小并记录。
[0080] (4)裸鼠麻醉后行安乐死，取出肿瘤并称重，根据每次测量的肿瘤大小绘制肿瘤生 长曲线，且根据肿瘤称重绘制柱状图以比较重组腺病毒Ad-GFP-C197对肿瘤生长的抑制情 况。
[0081] 三、实验结果
[0082] 1、由图5中增殖曲线可见，重组腺病毒Ad-GFP-C197对Hela、MCF-7、SGC7901和 Cac 〇2细胞均有抑制作用，且均于第三天开始出现抑制，第5-6天出现最大抑制率。由表1 可见，与Ad-GFP相比，Ad-GFP-C197能够有效抑制Hela、Caco2、MCF-7和SGC7901生长，抑 制率高达50%。
[0083] 表1.重组腺病毒Ad-GFP_C197对肿瘤细胞的抑制效果
[0084]
【权利要求】
1. 一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法，该方法由以下步骤组成： (1) 取如SEQ ID NO. 1所示的N端带有6个his标签的人端粒酶C端第936-1132片段 的编码序列，经双酶切、连接反应克隆至含有绿色荧光蛋白基因 GFP的穿梭质粒中，得到重 组穿梭质粒； (2) 将得到的重组穿梭质粒进行Pme I酶切线性化，通过与骨架质粒PAdEasy-1在 BJ5183细菌中进行同源重组，得到重组腺病毒质粒； (3) 将得到的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞进行重组包装，收集具有绿色荧光的细 胞，得到细胞包装的重组腺病毒； (4) 将得到细胞包装的重组腺病毒采用氯化铯梯度离心法进行纯化，得到重组腺病毒 载体。
【文档编号】C12N15/66GK104450786SQ201410784351
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】庞建新, 邬贤, 丘玉昌, 曹莹, 谢宝平, 周平正, 王杞妹, 陈嘉盛, 李红卫 申请人:南方医科大学