专利名称：药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物，尤其是前列腺癌等内皮素诱发的疾病的疼痛缓解药、缓解成骨性病变的治疗药和/或缓解成骨所伴随的疼痛的药物、前列腺癌的骨转移中的成骨性病变的改善剂和/或缓解前列腺癌的骨转移所伴随的疼痛的药物、前列腺癌的癌细胞增殖抑制剂；或是前列腺癌的进展抑制剂。
背景技术：
N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其盐在国际专利出版物97/22595中有记载，其中揭示了它对ET-1与内皮素ETA受体的结合有抑制作用，且对ET-1诱发的血管收缩和血压升高有抑制作用，暗示它可用来处理包括心血管疾病在内的有内皮素参与的各种疾病。
为了创制新的治疗药，本发明者对N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其盐对疾病的治疗可能性进行了更具体的研究。
发明揭示本发明者发现，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其盐能有效地缓解癌症(尤其是前列腺癌、乳癌、卵巢癌)、关节炎、前列腺炎、神经胶质瘤、周围动脉闭塞、月经困难、偏头痛、心绞痛、急性心肌梗塞、脑梗塞、蛛网膜下出血、糖尿病性神经障碍、类风湿性关节炎、青光眼、消化性溃疡、生育时的阵痛等内皮素诱发的疾病的疼痛，从而完成了本发明。
据报道，ET-1在人和试验动物中诱发疼痛。例如，将ET-1给予人肱动脉引起了肌肉局部缺血疼痛(J.Hypertension，8，811-817，1990)。另外，据报道，在广泛采用的疼痛模型小鼠福尔马林疼痛模型中，ET-1使福尔马林引起的疼痛的第一阶段和第二阶段有意义地增强(Can.J.Physiol.Pharmacol.，75，596-600，1997)。在该模型中，第一阶段指由于感觉神经直接刺激而产生疼痛，第二阶段指由于炎症继发反应而产生疼痛(Pain，38，247-352，1989)。
如下述试验例1所示，本发明的有效成分在小鼠福尔马林疼痛模型中对ET-1引起的疼痛增强有抑制作用。
另外，本发明者发现，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其盐能有效地改善成骨性病变和/或有效地缓解成骨所伴随的疼痛，从而完成了本发明。
由于具有破骨细胞抑制作用且改善骨代谢的双膦酸盐类有改善乳癌的骨转移所伴随的骨疼痛效果，因此认为长期骨疾病的改善与骨疼痛的改善相结合。与乳癌骨转移患者不同，在前列腺癌患者中，观察到成骨性骨转移病变(Semin.，Oncol.，21，630-656，1996)，作用于成骨细胞来改善骨代谢的药物预计也具有改善前列腺癌的骨转移所伴随的骨疼痛的效果。
据报道，ET-1对小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1以及来自大鼠头盖骨的原代培养的成骨细胞显示出通过ETA受体使胞内Ca2+浓度上升、DNA合成增加和ALP活性降低的作用。(Am.J.Physiol.，257，E797-E803，1989/Biochem.Biophys.Res.Commun.，170(3)，998-1005，1990/Bone，21(2)，143-146，1997)。
如下述试验例2所示，本发明的有效成分对ET-1诱发的小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1的细胞应答显示出抑制作用。
另外，本发明者发现，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其盐能有效缓解前列腺癌的骨转移所伴随的疼痛，或能有效改善前列腺癌的骨转移引起的成骨性病变，从而完成了本发明。
据报道，人前列腺癌细胞株具有产生ET-1的能力(Nat.Med.1(9)，944-949，1995)并通过ETA受体显示出增殖的能力(Cancer Res，56，663-668，1996)，与没有骨转移的前列腺癌患者相比，有骨转移的前列腺癌患者的血浆中ET-1浓度上升(Nat.Med.，1(9)，944-949，1995)，将这些报告与试验例1和2的结果结合考虑，强烈暗示本发明的有效成分能有效地改善前列腺癌患者的骨转移所伴随的疼痛或能有效地改善前列腺癌的骨转移所引起的成骨性病变。另外，如下述试验例5所示，本发明的有效成分使前列腺癌患者的疼痛评分和镇痛药用量降低，使骨代谢标志减少。
另外，本发明者还发现，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其盐能有效地抑制前列腺癌的癌细胞增殖，从而完成了本发明。
如下述试验例3和4所示，本发明的有效成分显示出对ET-1引起的激素非依赖性前列腺癌细胞的细胞增殖有抑制效果。
另外，本发明者还发现，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其盐能有效地抑制前列腺癌的进展，从而完成了本发明。
如下述试验例5所示，本发明的有效成分抑制或减少了前列腺癌患者的前列腺癌标志的增大。
即，本发明涉及用来缓解癌症(尤其是前列腺癌、乳癌、卵巢癌)、关节炎、前列腺炎、神经胶质瘤、周围动脉闭塞、月经困难、偏头痛、心绞痛、急性心肌梗塞、脑梗塞、蛛网膜下出血、糖尿病性神经障碍、类风湿性关节炎、青光眼、消化性溃疡、生育时阵痛等内皮素诱发的疾病的疼痛的药物组合物、用来改善成骨性病变的药物组合物、和/或缓解成骨所伴随疼痛的药物组合物；尤其是，用来改善前列腺癌的骨转移引起的成骨性病变的药物组合物；和/或用来缓解前列腺癌的骨转移所伴随的疼痛的药物组合物，这些药物组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
另外，本发明涉及N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐在制造前列腺癌等内皮素诱发的疾病的疼痛缓解药、成骨性病变的改善药和或成骨所伴随疼痛的缓解药，尤其是改善前列腺癌的骨转移引起的成骨性病变的药物和/或缓解前列腺癌的骨转移所伴随的疼痛的药物中的用途。
另外，本发明还涉及一种缓解前列腺癌等内皮素诱发的疾病的疼痛和/或成骨伴随的疼痛，尤其是前列腺癌的骨转移伴随的疼痛的方法，该方法包括将治疗有效量的N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐给予患者。另外，本发明还涉及一种改善成骨性病变、尤其是前列腺癌的骨转移引起的成骨性病变的方法，该方法包括将治疗有效量的N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐给予患者。
另外，本发明还涉及用来抑制前列腺癌的癌细胞增殖的药物组合物和/或用来抑制前列腺癌进展的药物组合物，该药物组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
另外，本发明还涉及N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐在制造前列腺癌癌细胞增殖抑制药和/或前列腺癌进展抑制药中的用途。
另外，本发明还涉及一种抑制前列腺癌癌细胞增殖和/或前列腺癌进展的方法，该方法包括将治疗有效量的N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐给予患者。
另外，由于本发明的有效成分的经口吸收性特别好，所以可制成优秀的口服治疗药。如下述试验例6所示，本发明的有效成分在给人口服给药时，以现有ETA受体拮抗药ABT-627[1-(N，N-二丁基氨基甲酰甲基)-2(R)-(4-甲氧基苯基)-4(S)-(3，4-亚甲基二氧苯基)吡咯烷-3(R)-甲酸]的1/2的用量，血浆中的浓度明显较高，AUC约为18倍。
下面将详细地描述本发明。
本发明药物的有效成分是N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐。所述盐可列举上述国际出版物97/22595中记载的盐，具体可列举盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、天冬氨酸和谷氨酸等有机酸的酸加成盐，以及与钠、钾、镁、钙和铝等无机碱，与甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸和鸟氨酸等有机碱的盐以及铵盐。特别佳的列举钾盐。
另外，各种异构体的混合物及分离的异构体、有效成分的水合物、溶剂化物均包括在本发明的有效成分中。另外，本发明的有效成分有时是具有多晶型化合物，这些结晶形式也全部包括在内。
这些化合物可用上述国际出版物97/22595中记载的制法或根据这些制法不难制得。
本发明的药物可用适合经口或非经口给药的有机或无机载体、赋形剂、其它添加剂根据常规方法来配制出口服固体制剂、口服液体制剂或注射剂。由于本发明药物的有效成分具有优秀的口服吸收性，因此，本发明的药物适合用作经口制剂。最佳的是可由患者自己服用且保存和携带方便的经口固体制剂。
作为经口固体制剂，可采用片剂、粉末剂、细颗粒剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释剂等。在这样的固体制剂中，可将一种或多种活性物质与至少一种无活性的稀释剂(例如乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉、玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和硅酸铝镁)混合。根据常规方法，组合物还可含有无活性的稀释剂以外的添加剂，例如诸如羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素(HPMC)等粘合剂；诸如硬脂酸镁、聚乙二醇、淀粉和滑石粉等润滑剂；诸如纤维素乙醇酸钙和羧甲基纤维素钙等崩解剂；诸如乳糖等稳定剂；诸如谷氨酸或天冬氨酸等溶解助剂；诸如聚乙二醇等增塑剂；和诸如氧化钛、滑石和黄色氧化铁等着色剂。片剂或丸剂可根据需要用蔗糖、明胶、琼脂、果胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二酸酯等的糖衣或胃溶性或肠溶性物质的薄膜包衣。
经口液体制剂包括制药学上容许的乳剂、液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等，并含有一般采用的无活性稀释剂如纯化水、乙醇等。除无活性稀释剂外，该组合物还可含有润湿剂、悬浮剂那样的助剂、增甜剂、调味剂、芳香剂、防腐剂。
作为静脉注射、肌内注射、皮下注射等的注射剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮剂、乳剂。水性溶液、悬浮剂的稀释剂例如包括注射用蒸馏水和生理盐水。非水性溶液、悬浮剂的稀释剂例如有丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、乙醇等醇类、聚山梨酯80等。该组合物中还可含有防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如乳糖)、溶解助剂(例如谷氨酸、天冬氨酸)等助剂。这些组合物可例如通过除菌滤膜过滤、与杀菌剂混合或辐照等方式来灭菌。另外，它们可以制成无菌固体组合物，在使用前用无菌水或无菌注射用溶剂溶解使用。
本发明的有效成分化合物的给药量宜考虑给药途径、疾病症状、给药对象的年龄、性别等对个别场合作适当决定，但是通常在经口给药的场合，每个成人1日给予有效成分为0.1-500毫克/日，较佳地为1-250毫克/日，可分1-2次给药。
另外，本发明的药物能与其它疼痛缓解药同时或分开合用。例如，对于前列腺癌、乳癌等癌性疼痛，可列举WHO癌性疼痛治疗法中使用的吗啡等强阿片样镇痛药、喷他佐辛和丁丙诺啡等弱阿片样镇痛药、以及吲哚美辛和布洛芬等非甾体类抗炎镇痛药。
另外，本发明的药物能与用来治疗内皮素诱发的疾病的其它药物同时或分开合用。例如，作为能与本发明药物合用的前列腺癌治疗药，可列举异环磷酰胺、喃氟啶·尿嘧啶等抗恶性肿瘤药、炔雌醇等雌激素、氢化可的松、泼尼松龙和贝美它宗(bemethazone)等肾上腺皮质激素，乙酸氯地孕酮等孕激素，乙酸亮丙瑞林等LH-RH衍生物，乙酸戈舌瑞林等LH-RH激动剂，顺铂等抗恶性肿瘤铂复合物，氟他胺等抗雄激素剂，磷雌酚和雌莫司汀磷酸钠等前列腺癌治疗药，以及硫酸培洛霉素等抗肿瘤性抗生素。
图面的简单说明
图1显示了ET-1引起的对福尔马林疼痛的增强作用(A.第一阶段，B.第二阶段，C.水肿)。
图2显示了化合物1对于ET-1引起的福尔马林疼痛增强作用的抑制作用(A.第一阶段，B.第二阶段，C.水肿)。
图3显示了化合物1对于ET-1诱发的小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1的胞内Ca2+浓度上升的抑制效果。
图4显示了化合物1对于ET-1诱发的小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1的细胞增殖([3H]-胸苷合并(掺入))的抑制效果。
图5显示了化合物1对于ET-1诱发的小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1的细胞增殖(细胞数)的抑制效果。
图6显示了化合物1对于ET-1诱发的激素非依赖性人前列腺癌细胞PPC-1的细胞增殖的抑制效果。
实施发明的最佳方式下面将根据实施例和试验例更详细地说明本发明，但是本发明并不局限于这些实施例。另外，下面的实施例中所用的化合物1指N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺的钾盐。
实施例1 胶囊剂表1
混合上述成分，填入胶囊，制得胶囊剂。
试验例1 化合物1在小鼠福尔马林疼痛模型中对于ET-1引起的疼痛增强作用的抑制作用化合物1的抑制效果(方法)(1)使用的动物在试验中使用雄性ICR小鼠(5周龄，日本SLC)。
(2)疼痛反应的测定将小鼠放入观察用笼子5分钟以上，使其适应环境。然后将20微升生理盐水皮下注入小鼠左后腿足跖中，将20微升含0.7％福尔马林的生理盐水注入右后腿足跖中。每5分钟测定此后立即出现的舔舐和咬的反应的持续时间，共40分钟。计时终了后，切下两个脚踝测定重量。以紧接给予福尔马林后的5分钟内的反应时间作为第一阶段，以给药后10分钟开始到40分钟为止的30分钟内的反应时间总量为第二阶段，将它们作为疼痛指标。另外，根据右足重量-左足重量(毫克)算出的水肿作为炎症反应的指标。
另外，舔舐的反应时间的计时全部均在1000至1800之间进行。
(3)测试药物将含ET-1和0.7％福尔马林的生理盐水以3，10，30皮摩尔/足跖的用量皮下给予右后腿足跖内，检查ET-1对于福尔马林疼痛以及水肿的增强作用。
将化合物1(0.3-3毫克/千克)以1毫升/100克的容量经口给药，给药后60分钟将含ET-1(10皮摩尔/足跖)和0.7％福尔马林的生理盐水皮下给予右后腿足跖内，检查化合物1对于ET-1诱发的福尔马林疼痛以及水肿增强作用的效果。
(4)统计处理结果用平均值±标准误差表示。检查两者间差别显著性，用不成对的司徒登特t检验算出p值。多组间的差别显著性可用单因素方差分析来解析，用Dunnett的多组比较算出p值。p值在5％以下的场合认为是有意义的。
(结果)(1)ET-1引起的福尔马林疼痛和水肿增强的作用通过将0.7％福尔马林溶液皮下给予小鼠后腿足跖内，观察2相疼痛反应。发现接近给药后5分钟内出现的暂时的疼痛反应(有舔舐反应和咬反应，第一阶段)，在福尔马林溶液给药后20分钟前后达到峰值水平的持续性疼痛反应(第二阶段)。(图1A，1B)。另外，通过给予0.7％福尔马林溶液，引起后腿水肿(图1C)。
当福尔马林溶液和ET-1(3，10，30皮摩尔/足跖)同时给药后，第一阶段、第二阶段和水肿以依赖于剂量的方式显著增强(图1A，1B，1C)。
(2)测试药对ET-1引起的福尔马林疼痛增强作用的效果化合物1(0.3，1，3毫克/千克，p.o.)对于ET-1(10皮摩尔/足跖)诱发的福尔马林疼痛(第一阶段、第二阶段)和水肿的增强作用被显著抑制(图2A，2B，2C)。
试验例2抑制ET-1诱发的成骨细胞样细胞MC3T3-E1的细胞增殖的试验(方法)(1)使用的细胞试验中采用小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1(Journal of Cell Biology，96(1)，191-198，1983)。
(2)胞内Ca2+浓度的测定将细胞培养在细胞平皿(直径为13.5毫米)上，至铺满后，在不存在血清下培养约12小时以上后，用于试验。向在Hank’s平衡盐溶液(HBSS)(140mM NaCl，4mM KCl，1mM K2HPO4，1mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM葡萄糖，20mM Hepes，pH＝7.4)中的细胞，加入Fura 2-AM(4μM)后在37℃下培养1小时。将细胞平皿固定在加入了HBSS的石英池中，将该石英池装入胞内Ca2+测定装置(CAF-110)中，在37℃、搅拌子搅拌的恒定条件下开始实验。胞内Ca2+浓度的测定如下用340/380纳米的激发波长，测定500纳米的荧光强度之比，从所得荧光强度比根据计算式算出胞内Ca2+浓度(J.Biol.Chem.，260，3440-3450，1985)。
(3)DNA合成量的测定DNA合成量是测定[3H]标记的胸苷的掺入量。将细胞以1.5×104细胞/孔的比例接种到96孔板中，用FCS 0.2％培养基培养2日。然后加入溶剂和ET-1，培养24小时。然后在培养液中添加[3H-甲基]-胸苷(0.5μCi/孔)，脉冲标记6小时。然后添加SDS溶液使最终浓度为0.2％，细胞溶解后，用液体闪烁计数器测定DNA合成中被使用的[3H-甲基]-胸苷的放射活性。作为对照以添加溶剂的测定值为100％，算出DNA合成的增加率。
(4)细胞数的测定细胞数用细胞计数试剂盒(DOJINDO)的试剂溶液来测定。将细胞以1.0×104细胞/孔的比例接种到24孔板中，用FCS 0.5％培养基培养1日。然后加入溶剂和ET-1，培养72小时。然后在培养液中添加100微升/孔的试剂溶液，在37℃下培育3小时。反应后，从24孔板的各孔中各移取200微升转移到96孔板中，在平板读数仪下测定吸光度(波长为405纳米，参照波长为650纳米)。作为对照以加入了溶剂的测定值为100％，算出细胞数增加率。
(5)测试药物在各个实验中，以ET-1在10-13至10-6M，化合物1在10-12至10-4M的浓度范围(均是10倍稀释比)作为最终浓度进行实验。在胞内Ca2+浓度测定中，化合物1在ET-1添加约2分钟前添加，在其它的实验中，化合物1在ET-1添加的约2小时前添加。
(6)统计处理结果用平均值±标准误差表示。组间差别的显著性用单因素方差分析来解析，用Dunnett的多组比较算出p值。p值在5％以下的场合认为是有意义的。各实验的ET-1的EC50值和化合物的IC50值根据Logistic回归法来算出。
(结果)(1)化合物1对于ET-1诱发的MC3T3-E1的胞内Ca2+浓度上升的抑制效果在小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1中，ET-1(10-12至10-6M)使胞内Ca2+浓度以浓度依赖性方式上升(图3A)。ET-1的EC50值是7.39×10-9M。化合物1(10-12至10-4M)浓度依赖性地抑制ET-1(10-8M)诱发的胞内Ca2+浓度上升作用(图3B)。化合物1的IC50值是1.02×10-8M。
(2)化合物1对于ET-1诱发的MC3T3-E1的细胞增殖的抑制效果在小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1中，ET-1(10-13至10-6M)使[3H]-胸苷掺入量以依赖于浓度的方式有意义地上升，使DNA合成增加(图4A)。ET-1的EC50值是9.84×10-12M。化合物1(10-12至10-6M)浓度依赖性地抑制ET-1(10-10M)诱发的[3H]-胸苷掺入上升作用(图4B)。化合物1的IC50值是1.15×10-8M。
同样，在通过WST-1测定细胞数的实验中，ET-1(10-12至10-6M)使MC3T3-E1的细胞数以依赖于浓度的方式有意义地上升(图5A)。ET-1的EC50值是2.20×10-11M。化合物1(10-11至10-6M)浓度依赖性地抑制ET-1(10-9M)诱发的细胞数上升作用(图5B)。化合物1的IC50值是9.54×10-9M。
试验例3对ET-1诱发的激素非依赖性人前列腺癌细胞的细胞增殖的抑制试验(1)(方法)(1)使用的细胞本实验中使用激素非依赖性人前列腺癌细胞株PPC-1(International Journal ofCancer，44，898-903，1989)。
(2)ET-1对于PPC-1细胞增殖的作用以及测试药对该增殖的抑制效果的检查测定DNA合成量作为细胞增殖的指标。DNA合成量是测定[3H]标记的胸苷的掺入量。将细胞以1×104细胞/孔的比例接种到96孔板中，用不含FCS的培养基培养5日。然后加入溶剂和ET-1，培养24小时。然后在培养液中添加[3H-甲基]-胸苷(0.5μCi/孔)，脉冲标记6小时。然后添加SDS溶液使最终浓度为0.2％，细胞溶解后，用液体闪烁计数器测定DNA合成中被使用的[3H-甲基]-胸苷的放射活性。作为对照以添加溶剂的测定值为100％，算出DNA合成的增加率。
(3)测试药物在本实验中，以ET-1在10-13至10-6M(10倍稀释比)，化合物1在10-10至3×10-6M的浓度范围(3倍稀释比)作为最终浓度进行实验。化合物1在ET-1添加的约2小时前添加。
(4)统计处理结果用平均值±标准误差表示。组间差别的显著性用单因素方差分析来解析，用Dunnett的多组比较算出p值。p值在5％以下的场合认为是有意义的。化合物1的IC50值根据Logistic回归法来算出。
(结果)如图6A所示，在激素非敏感性人前列腺癌细胞株PPC-1中，ET-1(10-13至10-6M)使[3H]-胸苷掺入量以依赖于浓度的方式有意义地上升，显示出细胞增殖促进作用。ET-1的作用在10-8M以上有意义。
化合物1(10-10至3×10-6M)浓度依赖性地抑制ET-1(10-8M)诱发的PPC-1细胞增殖促进作用，其IC50值是28±9.8nM(图6B)。化合物1的抑制作用在3×10-7M以上有意义。
试验例4 对ET-1诱发的激素非依赖性人前列腺癌细胞的细胞增殖的抑制试验(2)(方法)(1)使用的细胞本实验中使用激素非依赖性人前列腺癌细胞株PPC-1(International Journal ofCancer，44，898-903，1989)。
(2)ET-1引起的增殖反应以及测试药对ET-1诱发的增殖的抑制效果的检查用alamar blue的试验溶液测定细胞数。将细胞以2×104细胞/孔的密度接种到24孔板中，附着后，将培养基改为不含FCS的培养基，再培养24小时。然后添加溶剂和ET-1(10-11至10-6M)，培养96小时。使培养基的最终容量为500微升，在培养液中添加50微升alamar blue，培育4小时。反应后，从24孔板的各孔中取出100微升反应液，转移加入96孔板中，在平板读数仪下测定吸光度(波长405纳米，参照波长650纳米)。作为对照以添加溶剂的测定值作为100％，算出细胞数的增加率。
在测试化合物的抑制效果时，化合物1的最终浓度为10-9至10-5M，在10-7M的ET-1添加之前30分钟添加。
另外，在本实验中，由于ET-1可能会分解，所以在刺激后48小时换成新的ET-1培养基。
(结果)
如下表2所示，ET-1从10-11M开始观察到有ET-1引起的PPC-1的细胞增殖作用。
表2
(n＝7)另外，如表3所示，观察到化合物1从10-6M开始对10-7M的ET-1引起的PPC-1细胞增殖有抑制作用。
表3
(n＝7)试验例5 对前列腺癌患者的临床试验(方法)在下列条件下对前列腺癌患者进行临床试验。
对象激素非依赖性的或抗雄激素疗法后复发的D2期前列腺癌患者18名(45岁以上)测试药化合物1剂型2，10和40毫克片剂用量2、4、10、20、60、120和240毫克/日(1日1或2次给药)给药期间4周(28日)评价指标在给药前后测定以下项目。
(1)前列腺特异性抗原(PSA)
(2)骨标志物(骨碱性磷酸酶或脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline))(3)骨疼痛(疼痛评分VAS(直观类比尺度法)的变化/镇痛药的用量变化)(结果)发现化合物1从2毫克/日的用量起改善了各效果指标。化合物1使18名患者中的9名的疼痛评分VAS得到改善。化合物1使18名患者中4名的镇痛药用量降低。化合物1改善了10名患者的前列腺癌标志PSA，维持了2名患者的PSA。化合物1使18名患者中11人的骨代谢标志骨碱性磷酸酶减少，使18名患者中14人的骨代谢标志脱氧吡啶啉/肌酸酐之比改善大约40％。
试验例6 经口给予人时的血浆中浓度(方法)为了评价化合物1的经口给药时的药物动力学、耐受性和安全性，以3名进行了前列腺切除手术的进行性前列腺癌患者为对象，一次给药10毫克化合物1。为了测定血浆中完整化合物1的浓度，在给药前和给药后30分钟、1小时、1小时30分钟、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时和48小时的各时间点将6毫升血液采集到含肝素锂的聚乙烯管内，迅速离心分离(4℃，10分钟，3500rpm)，得到血浆。血浆样品-70℃冷冻保藏直至测定浓度。血浆中的浓度用LC-MS/MS法测定。
(结果)如表4所示，与20毫克ABT-627给药时相比，10毫克化合物1单次经口给药时的Cmax和AUC显示出分别为约11倍和约18倍的高数值。
表4
*)第6届内皮素国际研讨会，1999年10月10-13日，第219号摘要根据试验例1的结果，确认化合物1可用作内皮素诱发性疾病的疼痛缓解药。
根据试验例2的结果，确认化合物1可用作改善成骨性骨疾病和缓解成骨伴随的疼痛的药物。
另外，在试验例2中，ET-1从1×10-11M的非常低的浓度开始显示出引起成骨细胞样细胞应答。在关于人前列腺癌细胞株产生ET-1的能力的报告中，报道106细胞在24小时内产生了约数十pg/ml的ET-1(Nat.Med.，1(9)，944-949，1995)。该浓度为对应于1×10-11M。试验例2的结果强烈暗示，在前列腺癌的骨转移患者的骨转移部位中，前列腺癌细胞产生的ET-1很可能形成成骨性骨病变。在试验例2中，约10nM的低浓度化合物1显示出对由ET-1引起的成骨细胞样细胞应答有抑制作用。因此，强烈暗示化合物1对于有ET-1参与的前列腺癌患者的成骨性骨病变有改善效果。另外，与试验例1的结果综合考虑，强烈暗示化合物1可用作缓解前列腺癌骨转移伴随的疼痛的药物。
另外，根据试验例5的结果，也能确认化合物1可用作缓解前列腺癌的骨转移所伴随的疼痛的药物。
根据试验例3和4的结果，确认化合物1可用作对激素有抗性的前列腺癌的癌细胞增殖抑制剂，强烈暗示化合物1具有前列腺癌进展抑制效果。
另外，根据试验例5，也能确认化合物1是有效的前列腺癌进展抑制剂。
还有，在试验例6中，化合物1以已知ETA受体拮抗剂ABT-627的1/2用量获得了高大约18倍的AUC，显示出化合物1经口给药时的经口吸收性和药物动力学特别优异。化合物1对人ETA受体的亲和性(Ki值)为0.697nM(WO97/22595)，ABT-627为0.48nM(J.Pharmacol.Exp.Ther.，276，473-481，1996)，虽然大致相同，但是预计化合物1是比ABT-627更好的经口治疗药。
另外，在试验例5中，化合物1从2毫克用量开始显示出有效性，该用量是据报道从10毫克用量开始对前列腺癌患者能显著改善疼痛的ABT-627(Proceedings ofASCO，Vol.19，1314，2000)的1/5用量，确认化合物1是优良的前列腺癌经口治疗药。
产业上的利用可能性根据本发明能提供临床中有效的优良的前列腺癌经口治疗药。即，能提供癌症(尤其是前列腺癌、乳癌)、关节炎、前列腺炎、神经胶质瘤、周围动脉闭塞、月经困难、偏头痛、心绞痛、急性心肌梗塞、脑梗塞、蛛网膜下出血、糖尿病性神经障碍、类风湿性关节炎、青光眼、消化性溃疡、生育时的阵痛等内皮素诱发的疾病的疼痛缓解药。另外，还能提供成骨性病变的改善药和/或成骨伴随的疼痛缓解药，尤其是前列腺癌骨转移引起的成骨性病变改善药和/或前列腺癌骨转移伴随的疼痛缓解药。另外，本发明还能提供前列腺癌癌细胞增殖抑制药和/或前列腺癌的进展抑制药。
权利要求
1.一种用来缓解内皮素诱导的疾病疼痛的药物组合物，其特征在于，该组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，内皮素诱发的疾病是前列腺癌。
3.一种用来改善成骨性病变的药物组合物，其特征在于，该组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
4.一种用来缓解成骨所伴随的疼痛的药物组合物，其特征在于，该组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
5.一种用来缓解前列腺癌的骨转移所伴随的疼痛的药物组合物，其特征在于，该组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
6.一种用来改善前列腺癌骨转移引起的成骨性病变的药物组合物，其特征在于，该组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
7.一种用来抑制前列腺癌癌细胞增殖的药物组合物，其特征在于，该组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
8.根据权利要求7所述的用来抑制癌细胞增殖的药物组合物，其特征在于，所述前列腺癌是激素非依赖性前列腺癌。
9.一种用来抑制前列腺癌进展的药物组合物，其特征在于，该组合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
全文摘要
一种用来治疗前列腺癌的药物组合物，它含有N－[6－甲氧基－5－(2－甲氧基苯氧基)－2－(2－嘧啶基)－4－嘧啶基]－2－苯基乙烯磺酰胺或其制药学上容许的盐作为有效成分。
文档编号A61K31/505GK1434715SQ00818938
公开日2003年8月6日 申请日期2000年10月27日 优先权日2000年2月16日
发明者汤山弘法, 藤森明, 佐薙征直, 原田博规, 小圷明子, 森美树子, 山本信行 申请人:山之内制药株式会社