专利名称：受体拮抗剂趋化因子的制作方法
背景技术：
本发明涉及新的tetramic酸型化合物、含有它们的药物组合物和它们作为CCR-5拮抗剂治疗人类免疫缺陷性病毒-1(″HIV-1″)感染的用途。本发明化合物从CCR-5活性复合物中分离出来，在控制条件下通过将生物纯的微生物培养液(球毛壳霉Kunze SCH 1705 ATCC74489)发酵来制备复合物。
M.P.Singh等人在抗生素杂志，1998年十二月，51卷，12号1109-1112页公开了新的由未知真菌制备的抗生素，它包括在二环烃骨架上带有N-甲基tetramic酸部分的LL-49F233d。公开了这个抗生素对抗万古霉素和甲氧西林的细菌有活性，但没有公开对抗-HIV-1活性。
S.B.Singh等人在四面体杂志，39(1998)2243-2246页公开了N-甲基tetramic酸的衍生物，从微生物的提取物中分离出来的equisetin和phomasetin为HIV-1整合酶的抑制剂。这两篇文献中都未公开本发明化合物。
A-M.Vandamme等人在抗病毒的化学和化学疗法，9187-203页(1998)公开了，现代临床上治疗人类HIV-1感染的方法包括至少三种药联合使用，或称之为高效抗逆转录病毒疗法(″HAART″)；HAART包括各种的核苷逆转录酶抑制剂(″NRTI″)、无核苷逆转录酶抑制剂(″NNRTI″)和艾滋病病毒蛋白酶抑制剂(″PI″)联合使用。在适用的首次用药的病人中，HAART有效地减少了死亡率和抑制了HIV-1向爱滋病的发展。然而这种多种药物疗法没有除去HIV-1，长期治疗会导致对多种药抗性。发展治疗HIV-1的新药仍然是重点。
人们已经认识到CCR5趋化因子受体是HIV-1进入细胞的共同受体。因此，妨碍CCR5受体和HIV-1相互作用的CCR5拮抗剂，可以阻止HIV-1进入细胞。
毫无疑问，HIV-1，即爱滋病病原体(AIDS)引起了全球的健康危机，虽然延缓爱滋病发展的药物疗法已经取得成功，但仍然需要寻找新药疗法来控制HIV-1感染。
发明概述本发明包括具有识别球毛壳霉Kunze特征的球毛壳霉Kunze SCF1705，ATCC 74489和它们的突变株和变体。
本发明另外提供了CCR5活性的复合物，在pH和温度控制介质中，有碳和氮源的有氧条件下，通过培养生物纯的具有识别球毛壳霉KunzeATCC 74489特征的球毛壳霉Kunze SCF 1705得到复合物，直到该组合物具有抗HIV-1活性。
本发明也涉及CCR5活性复合物的基本上化学纯的三个组分，或它们药学上可接受的盐。即由式I、II和III代表的化合物。2页图 或 本发明涉及化合物式I、II或III的用法，它们可以作为CCR5的拮抗剂单独治疗，或与pegylated干扰素-α一起使用，治疗病人的免疫缺陷病毒1型的感染。
本发明也涉及治疗所有艾滋病病毒-1感染病人的方法，将有效治疗量的HAART和有效治疗量的化合物式I、II或III联合使用，来降低HIV-1-RNA。
本发明也涉及治疗所有艾滋病病毒-1感染病人的方法，将有效治疗量的pegylated干扰素-α和有效治疗量的化合物式I、II联合使用，来降低艾滋病病毒HIV-1-RNA。
本发明也提供了治疗HIV-1感染小儿科病人的方法，它包括将治疗有效量的pegylated干扰素-α与治疗有效量的CCR5拮抗剂式I、II或III化合物联合使用。
本发明也提供了治疗感染了HIV-1和HCV病人的方法，它包括将治疗有效量的pegylated干扰素-α与治疗有效量的病毒唑和治疗有效量的HAART和治疗有效量的CCR5拮抗剂联合使用，即基本上化学纯式I、II或III化合物或它们药学上可接受的盐。 图的简要说明
图1-9详细说明了生物纯培养球毛壳霉Kunze SCF 1705在synthetischer nrstoffrmer琼脂(SNA)上生长。
图1显示了通过复式显微镜看到的在子囊壳上盘绕的菌丝。
图2显示了在复式显微镜下的单个子实体，显示了由卷曲的和直的菌丝覆盖的子囊壳。
图3显示了实体在滤纸上生长。
图4和5显示了解剖显微镜下的单个子囊壳，显示了灰色卷曲菌丝覆盖的黑色子囊壳。
图6显示了从子囊壳上浮起的孢子的黑色触毛。
图7显示了在高倍解剖显微镜下看到的在子囊壳上盘绕的菌丝。
图8显示了卷曲菌丝和结晶状的外壳的详细情况。
图9显示了具有柠檬形状和终端有单个气孔的子囊孢子。
发明的详细说明微生物用于制备CCR5-活性复合物和式I、II和III化合物的微生物为生物学纯的球毛壳霉Kunze SCF 1705，ATCC 74489。
这个微生物的培养物放置(于1999年4月21日)在美国标准菌库(ATCC)10801 Blvd.大学，Manassas，VA 20110-2209，它的登记号为ATCC 74489。从培养物保藏之日起30年期间，或在最后要求培养物保藏的5年之后，或有由这个申请引发的专利有效使用期内，如果保藏的培养物丢失、破坏或者不能存活，由申请人或本申请的受让人来替换培养物。在审理这个申请期间，当专利与商标的助理官员在37CFR 1.14和35USC 122条款下要求时可以得到此培养物，或在这个申请授予美国专利权后，公众可以随时得到。微生物的使用取决于美国专利法。
用于制备的微生物从托斯卡纳亚利桑那州收集的常绿植物的叶子样品中分离得到，它是一种未经确认的真菌。已经表征和发现它具有毛壳属微观的、宏观的和whole cell hydrolysia性质。
用于制备的球毛壳霉Kunze SCF 1705 ATCC 74489菌株的说明。形态学形态学观测用于制备菌株，它为在SNA(Synthetischernhrstoffrmer琼脂)的标准化琼脂上生长的球毛壳霉SCF 1705，琼脂配制如下KH2PO41.0g，KNO31.0g，MgSO4.7H2O 0.5KCI 0.5g葡萄糖 0.2g蔗糖0.2g琼脂20.0gdH2O 1000mL在琼脂固化后，将无菌的滤纸碎片(大约5cm直径)铺在表面。图的详细说明室温下(12小时黑暗12小时光照循环，用近紫外和荧光等混合控制)10天之后，在SNA上的生长出50-70mm直径的菌群，在表面四处散布着子囊壳(有性的实体)(参见图3)，抽提边缘的酵母和滤纸的边缘，看到模糊的同心环向外扩展，没有或难以觉察到气生菌丝体和沉侵的未染色的菌丝体。子囊壳(参见图2，4和5)在表面，容易从底物上脱落，单个散布或连续地聚集，表面看是橄榄色的，但是事实上是被直的和卷曲的浅灰色的菌丝所覆盖，它们超出子囊壳壁300-400uM，形成了橄榄色和多毛的出现，包括表面的毛状物有700-1250uM长和700-1100uM宽，而除去表面的菌丝有大约300-600×125-350uM。在视图表面变暗的孢囊被(子囊壳的壁)由褐色细胞的表层组织(类似于拼板玩具的排列)构成，该细胞有2.5-4uM宽，具有微不规则的、微厚的壁。菌丝以两种方式覆盖着孢囊被，两者都具有分散的隔膜；第一种是从子囊壳表面直接伸出来；第二种成螺旋形卷曲，有2.5-3.5uM宽(参见图表1和7)，具有均匀略微增厚并覆盖有细小晶体的壁，这样表面形状为尖刺状的和有突起的(参见图8)。没有观察到Asci(包含孢子的结构)，假定为已经溶解。子囊孢子(有性孢子)，9.5-10.5×8-9uM，椭圆的类似柠檬形状，橄榄色的，具有平滑的稍微变厚的壁，在一个终端有大约1uM的气孔(参见图9)。子囊孢子联合成喇叭状，为称之为chirrhi的黑色的集结(图6)，有300uM长和50-125uM宽。
术语″它们药学上可接受的盐″在这里指，式I-III化合物和药学上可接受的碱形成的盐。
在本发明中药学上可接受的碱是适合于与式I、II或III化合物形成药学上可接受盐的化合物，包括适当的有机和无机碱。适当的有机碱主要包括，伯烷基胺、仲烷基胺和叔烷基胺、烷醇胺、芳香族胺、烷基芳香族胺和环胺。有机胺的例子包括选自下述的药学上可接受的碱，氯普鲁卡因、普鲁卡因、哌嗪、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、N，N-二甲基葡糖胺乙二胺、二乙醇胺、二异丙胺、二乙胺、N-苄基-2-苯乙胺、N-N′-二苄基乙二胺、胆碱、克立咪唑、三(羟甲基)氨基甲烷或右旋葡糖胺。优选的有机碱包括N-甲基葡糖胺(″NMG″)、二乙醇胺和三(羟甲基)氨基甲烷(″TRIS″)。
据报道，CCR5基因在抗HIV感染中起着重要的作用。HIV感染是首先通过与细胞的受体CD4和从属的趋化因子共同受体分子相互作用，将病毒附着到靶细胞膜上，然后通过血及其他组织复制和传播受感染细胞。有各种的趋化因子受体，但对于在体内感染初期复制的致病菌株亲巨噬细胞HIV来说，HIV-1进入细胞的主要的趋化因子受体为CCR5。因此，干扰病毒CCR5受体和HIV-1相互作用，可以阻止HIV-1进入细胞。
术语″CCR5拮抗剂化合物″和″CCR5拮抗剂″在这里指，妨碍病毒CCR5受体和HIV-1相互作用，阻止HIV-1进入细胞的任何化合物。在这里进行下述试验，例如CCR5膜结合试验、HIV-1进入和HIV-1进入复制试验，确定化合物可以作为CCR5拮抗剂和它具有CCR5拮抗剂活性。
治疗HIV-1感染的病人的方法包括，将治疗的有效量的CCR5拮抗剂式I、II或III化合物、治疗有效量的pegylated干扰素-α联合使用、或和治疗有效量的至少一种病毒唑、干扰白细胞素-2(″IL-2″)、白细胞间介素-12(″IL-12″)和单独的pentafuside联合使用，或根据优质临床规范将HIV-1RNA血浆水平降低到最少，和特别是HAART的抗HIV-1疗法联合使用。参见实例A.M.Vandamme等，抗病毒的化学和化学疗法，9187-203(1998)和内科杂志中，39卷(期号1015)″HIV感染的药物″，1997年，十二月5日，111-116页。本发明优选的方案为，将pegylated干扰素α和式I到III的CCR5拮抗剂联合，给感染HIV-1的病人使用，如果同时感染HIV-1和HCV，再联合病毒唑和HAART。本发明的特征在于，pegylated干扰素α、CCR5拮抗剂式I到III和HAART的组合物分别在治疗HIV-1中的作用机理不同。本发明另一个的特征在于，pegylanotherted干扰素α、式I到IIICCR5拮抗剂之间不互相抵触，也不和HAART组合物抵触。根据本发明开始使用治疗有效量的pegylated干扰素α和病毒唑混合，之后使用结构式I或II或III化合物的CCR5拮抗剂和HAART，之后，治疗有效量的pegylated干扰素-α和CCR5拮抗剂式I、II或III化合物联合使用。在本发明的具体实例中，治疗HIV-1感染病人的方法包括2个治疗周期。第一个治疗周期为，将治疗有效量的pegylated干扰素-α和CCR5拮抗剂化合物式I、II或III联合使用，预处理一段时间来降低HIV-1-RNA血浆水平，与最初的HIV1-RNA血浆水平相比降低优选10倍，更优选至少100倍，即至少102。在第二个治疗周期，继续施用治疗有效量的pegylated干扰素-α和CCR5拮抗剂结构式I或II或III混合物，根据优质临床规范使用治疗有效量的HAART，降低HIV-1-RNA血浆水平。A.M.Vandamme等，抗病毒的化学和化学疗法，9187-203(1998)公开了，现代临床治疗HIV-1感染的方法，包括什么时候使用多药物疗法和与哪种药联合使用。三联药物疗法可以包括二个NRTIs和一个PI，但对不同的病人，还要考虑许多其它问题来选择精确的HAART。参见表1和2，和在上文提到的A-M.Vandamme等的图2。
术语″感染HIV-1的病人″在这里指任何病人，包括感染HIV-1的小儿科病人，包括第一次治疗的病人和经受多次治疗的感染HIV-1的病人，以及同时感染HIV-1和丙型肝炎病毒(″HCV″)的第一次治疗的病人和经受多次治疗的病人。
术语″小儿科的病人″在这里指年龄小于17岁，一般包括从出生到16岁的任何病人。
术语″第一次治疗的病人″在这里指感染HIV-1或同时感染HIV-1和HCV，从来没有接受任何抗逆转录病毒药物治疗的病人，抗逆转录病毒药物例如NRTI、NNRTI、PI或任何干扰素，包括而不是限于干扰素-α，或pegylated干扰素α。
术语″经受多次治疗的病人″在这里指感染HIV-1或同时感染HIV-1和HCV，接受过某种抗HIV治疗的病人，包括但不限于HAART或某种形式的抗HCV疗法，包括但不限于干扰素-α、pegylated干扰素α或病毒唑。
术语″感染丙型肝炎病毒的病人″在这里指任何病人，包括感染丙型肝炎病毒的小儿科病人，包括第一次治疗的病人和经受多次治疗的感染丙型肝炎病毒的病人，以及那些患有慢性肝炎的小儿科的、第一次治疗的病人和经受多次治疗的病人。
患有丙型肝炎的病人包括那些感染了多种HCV基因型的病人，包括1型以及那些感染上例如ICV基因型2，3，4，5和/或6及其他可能的HCV基因型的病人。
术语″第一次治疗的感染丙型肝炎的病人″在这里指从来没有接受病毒唑或任何干扰素治疗的患有丙型肝炎的病人，包括而不限于干扰素-α或pegylated干扰素α。
术语″接受多次治疗的感染丙型肝炎的病人″在这里指已经接受病毒唑或任何干扰素治疗的患有丙型肝炎的病人，包括而不限于干扰素-α或pegylated干扰素α包括复发者和没有应答者。
术语″复发者″在这里指经过多次治疗的感染丙型肝炎的病人，经过以前的干扰素单独治疗或与病毒唑结合治疗后又复发。
术语″无应答者″在这里指经过多次治疗的感染丙型肝炎的病人，经过以前的干扰素单独治疗或与病毒唑结合治疗没有产生应答。
当使用pegylated干扰素-α时使用pegylated干扰素α-2b，根据本发明在包括两个阶段的治疗期间内，治疗有效量的pegylated干扰素α-2b使用范围大约为每周服用0.1到9.0微克每千克pegylated干扰素α-2b，一次或分开计量，优选一周一次(QW)或每周两次(BIW)，优选的范围为大约一周一次(QW)服用0.1到大约9.0微克每千克pegylated干扰素α-2b，或每周两次(BIW)服用大约0.05到大约4.5微克每千克pegylated干扰素α-2b，或每周服用大约0.5到大约3.0微克每千克pegylated干扰素α-2b，优选的范围为一周一次(QW)服用大约0.5到大约3.0微克每千克pegylated干扰素α-2b，或每周两次服用大约0.25到大约1.5微克每千克pegylated干扰素α-2b，或每周服用大约0.75到大约1.5微克每千克pegylated干扰素α-2b，最优选范围为一周一次服用大约0.75到大约1.5微克每千克pegylated干扰素α-2b或每周两次服用大约0.375到大约0.75微克每千克pegylated干扰素α-2b。
当使用pegylated干扰素-α给小儿科的病人服用时，使用pegylated干扰素α-2b，根据本发明在包括两个阶段的治疗期间内，治疗有效量的pegylated干扰素α-2b使用范围为大约0.1到9.0微克每千克pegylated干扰素α-2b，一次或分开计量，优选一周一次(QW)或每周两次(BIW)，优选的范围为大约一周一次(QW)服用大约0.1到大约9.0微克每千克pegylated干扰素α-2b，或每周服用大约0.05到大约4.5微克每千克pegylated干扰素α-2b，一次或分开计量服用，优选一周一次(QW)或每周两次(BIW)，更优选一周一次服用大约0.05到大约4.5微克每千克pegylated干扰素α-2b，或者优选服用大约0.75到大约3.0微克每千克pegylated干扰素α-2b，一次或分开计量，优选一周一次(QW)或每周两次(BIW)，更优选一周一次服用大约0.75到大约3.0微克每千克pegylated干扰素α-2b，或每周两次服用大约0.375到大约1.5微克每千克pegylated干扰素α-2b，最优选范围为一周一次服用大约2.25到大约2.6微克每千克pegylated干扰素α-2b或每周两次(BIW)服用大约1.1到大约1.3微克每千克pegylated干扰素α-2b。
当使用pegylated干扰素-α时使用pegylated干扰素α-2a，根据本发明在包括两个阶段的治疗期间内，治疗有效量的pegylated干扰素α-2a使用范围为一周一次(QW)大约50微克到大约500微克，优选一周一次大约200微克到大约250微克，或有效量范围为每周两次大约50微克到大约250微克，优选每周两次大约100微克到大约125微克。
当使用pegylated干扰素-α给小儿科的病人服用时，使用pegylated干扰素α-2a，根据本发明包括第一阶段的治疗期间内，治疗有效量的pegylated干扰素α-2a使用范围为一周一次(QW)大约50微克到大约500微克，优选一周一次大约300微克到大约375微克，或给小儿科病人服用的治疗有效量范围为，每周两次大约50微克到大约250微克，优选一周一次大约150微克到大约190微克。
病毒唑和pegylated干扰素联合给病人用药，也就是说，在pegylated干扰素α之前、之后或同时给药。在同一段时间，使用pegylated干扰素-α的剂量优选病人使用的病毒唑的计量。病毒唑和pegylated干扰素-α同时，使用的量为每公斤每天大约400到大约1600毫克，优选每公斤每天大约600到大约1200毫克或者大约800到大约1200毫克每天，最优选每公斤每天大约1000到大约1200毫克。给小儿科病人使用时，在同一段时间使用pegylated干扰素-α的剂量优选病人使用的病毒唑的计量。同时给小儿科病人使用病毒唑和pegylated干扰素α时，使用量为每公斤每天大约8到大约15毫克，优选每公斤每天大约8，12或15毫克，分计量使用。
口服pegylated干扰素-α制剂效果不好，所以优选的方法为肠胃外给药，优选皮下注射、静脉注射或肌肉注射。病毒唑可以以胶囊、片剂口服给药，或液态与pegylated干扰素-α经肠胃外给药。当然可以考虑这两种药剂的其它给药形式，例如鼻喷入法、经皮、通过栓剂、通过持续释放剂型和由肺吸入给药。只要能够供给适当的剂量，不破坏活性成分可以允许任何形式给药。微生物的发酵在大约24℃到37℃，优选24℃到35℃的温度条件，pH值为大约6.5到8.0，将含水的培养基沉侵在有氧条件下，当用于制备的微生物MER-229生长出来，不断搅拌，直到真正的CCR-5活性传送到介质中，这样制备出CCR-5活性复合物。温度研究表明有机体在大约24℃迅速生长，因此优选在大约24℃的单一的温度下，进行大约48到大约144小时，优选在烧瓶中进行大约120小时。
有机体生长的红细胞压积、pH值和残余的葡萄糖浓度间歇地变化，在发酵期间，CCR-5活性复合物的制备由CCR-5试验控制。
关于培养基，可以使用任何适当含碳的介质，例如可吸收的碳水化合物；含氮源介质，例如可吸收的含氮的或蛋白质的原料和各种的无机盐。
用于发酵的介质包含作为主要氮和碳源的朊蛋白胨、酵母提取物、结晶葡萄糖和大豆粒。在这个条件下，当使用CCR-5试验检测发酵过程时，微生物MER-229生产出了活性组分。
上文的介质是MER229制备活性组分的营养物模板。然而，对于熟知发酵科学的人来说，很明显许多物质提供的营养物可以替代上文提到的介质，从中获得各种各样的，这些营养物质和上述阐述的营养物质具有同等的功效，而且一般会获得良好的生长和制备。
一般在发酵工艺中，在加入酵母前，先对发酵介质进行最初的杀菌。在杀菌前，通常将介质的pH值调到7。
将酵母加入液体培养基后启动发酵。通常，相对于液体培养基的体积，酵母体积在3.5到7.0％之间。酵母的制备，是将相对于整个用于制备培养物的液体培养基为5％的样品酵母加入到初始的适当的介质中。按克/升算，特别优选的初始介质包括，变形杆菌蛋白胨#3，5.0；氯化钠5.0；结晶葡萄糖20.0；酵母提取物3.0；大豆粒5.0和磷酸钾钠(一元的)5.0。发酵的培菌时期通常要求从24到120小时，优选72-96小时，一般在24℃下进行，并且搅拌(每分钟250转)。将培养物的5％酵母转移到初始介质中，如上述描述的培养，将用这种方法培养的酵母转移到发酵介质中，特别优选的发酵介质包括10g/L的新胨、40g/L的结晶葡萄糖和5g/L的碳酸钙。发酵阶段一般要求96到144小时，优选120小时，通常在大约24℃下进行，并搅动(每分钟250转)。将溶液的pH值调到7，如有必要向介质中加入例如消泡剂B(Dow Corning)的消泡剂用于控制泡沫。进行CCR-5检测试验，发现制备出了活性配合物。CCR-5活性物质的分离关于分离工艺的第一步，传统的乙酸乙酯提取法在pH为6.5-7.2时，不能从发酵液体培养基中提取出210791(I)、Sch 210792(II)和Sch 213766(III)。原来使用DZC-18(Diazem)密封材料，小规模应用了固相提取法(SPE)。进一步的评估表明I、II和III化合物可以用乙酸乙酯在酸性条件下(pH＝2)进行提取。先用浓盐酸(12N，37％)将发酵液(4升)调整到pH为2，然后用12升的乙酸乙酯提取。减压除去溶剂后，用双相的溶剂系统(己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶含5％乙酸的水，8∶2∶5∶5)分配粗提物(8g)。将上面部分(800mg)的CCR-5活性复合物进行正相高压液相色谱分离(YMC半制备的聚醋酸乙烯酯-Sil柱，30×250mm有30×75mm保护柱，S-5，2％甲醇溶于等浓度的氯丁烷中，24毫升/分钟，UV＝295nm))，得到纯的I(6mg)和III(20mg)和富集的复合物。进一步用反向高压液相色谱法(YMC半制备的ODS柱，20×250mm，并有20×50mm保护柱，S-5，用溶于水的70-100％乙腈梯度洗涤15分钟，12毫升/分钟，UV＝220nm)提纯富集的复合物，得到纯的II(5毫克)。化合物I、II和III的理化性质用丙酮/二氯甲烷(1∶1)结晶化合物I和II，形成结晶固体。然而除去高压液相色谱法提纯得来的溶剂后，化合物III为胶状物质，用许多溶剂体系都不能使其结晶。三个化合物都可以溶于丙酮、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷和甲醇，但不溶于己烷和水。这些化合物在茚三酮试验中显阴性，在Rydon试验中显阳性。这些化合物的理化性质概括在表1中。式I、II和III化合物的结构测定通过分析光谱数据来解释式I、II和III化合物的结构，包括UV、IR、MS、1H和13C核磁共振，这些光谱数据参见表2和3。
通过相关光谱学(COSY)和附着的氢核试验(APT)实验来分别确定氢核和碳的谱带归属。通过杂环相关的(HETCOR)实验将氢分配到有关的碳上。通过杂核多重键相关性(HMBC)、异核多级量子相干(HMQC)和选择使用通过偏振传递提高不灵敏核(SINEPT)的实验来确定氢核和碳的关系。通过核极化效应光谱(NOSEY)来确定相关的立体化学。分析化合物II的X射线晶体学数据，数据见表4，来进一步证明提出的化合物的结构和相关的立体化学。三个化合物都属于tetramic酸族，该化合物键合亲油的二环部分。化合物I和II在手性中心C-23位置为立体异构的。化合物III在C-25位置是羧酸甲酯。表1式I、II和III化合物的理化性质III III溶点℃ 126-128 149-150 -------1ESI-MS (m/z)2446(MH+H)+446(M+H)+460(M+H)+元素分析 C25H35NO6C25H35O6C26H37NO6计算值 C67.42，H7.87， C67.42，H7.87，NC67.97，H8.06，N3.15 3.15N3.05实际测量值 C68.23，H7.98， C66.95，H7.51， C67.11，N3.11 N3.58 H7.88，N3.67[]24D(丙酮)+127.5°+40.0°+33.3°UV(甲醇)maxnm 220，290 220，295220，295IR(Kbr)MAXCM-13390，1725， 3436，1710，1645， 3407，1736，1650，1595，1440 1578，1447 1655，1602，14561.大概由于存在两个同分异构体(烯醇-酮平衡)，化合物III好象是胶状的软固体。2、电喷射离子化质谱数据表2式I、II和IIIa化合物的核磁共振数据质子# I II III1 3.95dd(8.0，7.0)b3.94dd(8.0，7.0)3.95dd(8.0，7.0)2 3.01dt(8.0，1.0，1.0) 3.00dt(8.0，1.0，1.0) 3.00dt(8.0，1.0，1.0)3 5.67br.s 5.66br.s5.66br.s4 5.67br.s 5.66br.s5.66br.s5 1.85m 1.85m 1.82m6 0.93，1.90m0.95，1.91m 0.95，1.90m7 1.62m 1.63m 1.63m8 0.82，1.64m0.83，1.66m 0.83，1.66m9 1.38m 1.39m 1.39m10 1.40m 1.40m 1.40m11 -- -- --12 1.58br.s 1.57br.s1.59br.s13 5.20dq(6.5，1.0) 5.19dq(6.5，1.0)5.19dd(6.5，1.0)14 1.51br.d(6.5) 1.50br.d(6.5) 1.50br.d(6.5)15 0.92d(6.5) 0.91d(6.5) 0.91d(6.5)16 0.84d(6.5) 0.85d(6.5) 0.84d(6.5)17 -- -- --18 -- -- --19 -- -- --20 4.10dd(10.0，2.5) 3.80dd(10.0，2.5) 4.04(10.0，2.5)21 -- -- --22 1.90dd(14.0，10.0) 1.75dd(14.0，10.0) 1.72dd(14.0，10.0)2.22dd(14.0，2.5) 2.50dd(14.0，2.5) 2.45dd(14.0，2.5)23 -- -- --24 1.49s 1.49s 1.46s5 -- -- --25-OCH3-- -- 3.77sa.在丙酮-d6中400MHz测量，从TMS的化学位移单位ppmb.偶合常数单位Hz。CCR5膜结合试验使用高流量滤网，利用CCR5膜结合试验确定RANTES结合的抑制剂。利用表达人的CCR5趋化因子受体的NIH 3T3细胞制备膜来进行试验，这个受体可以和它的自然配体RANTES结合。使用96孔的培养皿，用125I-RANTES培养制备的膜，在有或没有化合物的情况下培养1小时。顺序地将化合物稀释到0.001ug/ml到1ug/ml的范围内，并分三份进行试验。通过玻璃纤维过滤器获得反应的混合物，并彻底洗涤。求出重复试验的平均值，作为抑制125I-RANTES结合50％时的浓度。进一步用亚细胞为基底HIV-1进入和复制试验来表征，在膜结合试验中化合物的有效活性。在CCR5膜结合试验中式II化合物的活性在CCR5膜结合试验中，评价式II化合物的活性。这个试验利用表达人的CCR5趋化因子受体的NIH 3T3细胞制备的膜，RANTES(调节正常的T细胞表示和分泌的活性)是CCR5的自然配体。使用96孔的培养皿，在有(和没有)化合物的情况，将14ug(总蛋白)制备的膜和0.05nM125I Rantes培养1小时。顺序地将化合物II稀释到0.001ug/ml到1.0ug/ml的范围内，每一浓度试验四次。通过玻璃纤维过滤器获得反应的混合物，并彻底洗涤。求出重复试验值的平均数，作为抑制膜结合125I RANTES达到50％时的浓度。式II化合物的IC50值为78.6nM。可以预计式I和III化合物的类似活性范围。
表3式I、II和IIIa化合物的13C NMR数据刺菜蓟(Carbon)# I II III1 45.8db46.9d45.2d2 47.8d 48.5d48.7d3 128.4d129.4d 126.2d4 133.5d134.5d 134.3d5 40.4d 41.2d38.4d6 41.8t 42.6t42.4t7 32.4d 33.2d33.2d8 45.8t 46.6t46.8d9 39.1d 39.9d35.1d1046.0d 46.9d39.9d11135.3s136.2s 138.2s1215.1q 16.8q16.5q13121.5d122.3d 122.0d1412.9q 13.8q13.8q1521.8q 22.6q22.8q1620.5q 21.4q20.2q17192.8s193.5s 192.9s18100.6s101.4s 100.9s19194.8s194.9s 194.7s2058.9d 60.9d60.7d21175.6s176.6s 176.6s2241.3t 42.7t43.0t2372.9s 75.1s75.3s2425.0q 27.7q28.0q25176.9s177.2s 176.9s25OCH3- -52.9qa.在丙酮-d6中100MHz测量，从TMS的化学位移ppmb.通过APT数据确定多重峰表4.晶体学数据1
1在所有测量中使用Enraf-Nonius CAD-4衍射仪(Cu-Kα射线，石墨单色器)。因为洛伦兹和极化影响校正强度。劳厄对称性表明这些晶体属于单斜晶系。没有规则和分子是手性的事实决定了空间群。最后由衍射计装置角计算单位晶胞参数，在倒易空间大大偏离了25度(25°＜θ＜29°)。
由直接法了解晶体结构(MULTAN11/82)。从一系列通过增加原子数分阶段记录重量的Fo傅里叶合成法和E-map，可以获得没有氢原子的近似坐标。通过一些完全的矩阵最小方阵计算，调整这些原子的位置和热力学参数(先各向同性和然后各向异性)。大多数的氢原子通过差值傅里叶合成法确定出了位置，并且通过接下来的最小方阵叠代法插入到预计的位置。在后面的时间，将消光校作为可变的。最后的差值傅里叶合成没有异常特征。
利用Enraf-Nonius结构测定程序包(SDP)，在PDP11/44和MicroVAX MICROVAX计算机上进行结晶的计算。
所有的结构-因子运算、中性原子散射因子和它们的异常色散校正都来自于国际X射线结晶学表，IV卷，Kynoch出版社，伯明翰，U.K.，1974。2R＝∑||Fo|-Fc||/∑|Fo|；Rw＝[∑w(|Fo|-|Fc|)2/∑w|Fo|2]；∑wΔ2[w＝1σ2(|Fo|)，Δ＝(|Fo|Fc|)]是最小的。3拟合优度＝ [∑wΔ2/(N观测-N参数)]
权利要求
1.式I、II或III化合物基本上化学纯形式或药学上可接受的盐。
2.一种药物组合物包括作为CCR5拮抗剂的有效量权利要求1化合物和至少一种药学上可接受的载体。
3.一种生物纯球毛壳霉Kunze SCF 1705和它的突变株和变体培养物，它具有球毛壳霉Kunze SCF 1705，ATCC 74489的特征，所述的培养物在含有碳和氮源和无机物的水介质中，能够制造任意数量的式I-III化合物。
4.包括式I、II和III化合物的CCR-5活性复合物。
5.一种制造权利要求1式I、II或III化合物的方法，包括在大约24℃到40℃的温度条件，pH值为大约6.0到8.5，有氧条件下，在包含碳和氮源和无机物的含水培养基中，培养球毛壳霉Kunze SCF 1705，ATCC 74489，并不断搅拌，直到真正的抗CCR-5活性传送到介质中。
全文摘要
本发明涉及新的tetramic酸型化合物，它从CCR－5活性复合物中分离出来，在控制条件下通过将生物纯的微生物培养液(球毛壳霉Kunze SCH 1705 ATCC 74489)发酵来制备复合物。还涉及含有它们的药物组合物和它们作为CCR－5拮抗剂治疗人类免疫缺陷性病毒－1(“HIV－1”)感染的用途。
文档编号A61K31/4015GK1422252SQ01807677
公开日2003年6月4日 申请日期2001年3月28日 优先权日2000年3月30日
发明者M·楚, R·A·米尔兹瓦, J·特拉齐尔诺, M·G·帕特尔 申请人:先灵公司