专利名称：17肽有机化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属有机化合物，主要涉及多肽类有机化合物，尤其是关于人工化学合成或用基因工程的方法获得的17肽有机化合物及其在医药领域的应用。
在临床上，如不慎将B型血输给了A型或O型的病人，由于A型或O型血的人体内有预存的抗B型血的抗体，故会出现针对B型血抗原的免疫反应，从而出现临床上危急的输血反应，如抢救不及时，有可能使病人失去生命。
本发明提供的17肽有机化合物，包括a、b、c、d四种，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。
本发明提供的17肽有机化合物a的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRS，分子量为1990；17肽有机化合物b的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRP，分子量为2002；17肽有机化合物c的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRT，分子量为2004；17肽有机化合物d的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRA，分子量为1974。
本发明的目的之二是将17肽有机化合物用于器官移植术中控制异种移植中超急性排斥反应。
本发明的另一个目的是将17肽有机化合物用于血型不合输血后产生的输血反应。
本发明的优点有①本发明的17肽有机化合物，由于只有17肽，故可以用人工化学合成或基因工程的方法大量合成。以前者为例，可以得到大量较纯的小肽。
②本发明的17肽有机化合物能与抗B抗体特异性结合，所以能用于某些血型不合输血后而产生的输血反应。
③本发明的17肽有机化合物与抗B单克隆抗体的结合位点是特异性的，起到封闭抗B单克隆抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
④本发明的17肽有机化合物除了能与抗B单克隆抗体结合外，还能与人体内预存的抗猪抗原的抗体特异性结合，从而封闭它的作用，起到了抑制猪异种移植超急性排斥反应的发生。
⑤本发明的17肽有机化合物与人体内预存抗体的结合位点是特异性的，正好起到封闭抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
⑥由于本发明的17肽有机化合物的氨基酸数量较少，开发成药物后容易被机体利用而起效。
图2为本发明抑制A型血人血清与猪红细胞的凝集反应结果图。
图3为本发明抑制西非单叶豆凝集素BS-I-B4与猪红细胞的凝集反应图。
实施例1用抗B型血单克隆抗体作为靶蛋白，用噬菌体展示的方法得到阳性噬菌体克隆。
噬菌体展示方法利用基因工程手段将合成的一组一定长度的随机序列寡核苷酸片段克隆到特定表达载体中，使其表达产物以融合蛋白的形式呈现在丝状噬菌体表面。由于肽库中包含了该长度小肽的所有可能的氨基酸排列顺序或其中的绝大部分，每一个噬菌体呈现其中的一种肽段，因而库容量极大，易于筛选和扩增。用噬菌体肽库感染大肠杆菌，使重组入噬菌体的随机的寡核苷酸片段在大肠杆菌内复制，并在噬菌体的外壳蛋白中表达出来。然后，把靶蛋白包被在酶标板上。用此噬菌体肽库与靶蛋白混合后，洗板。如果噬菌体上的外壳蛋白能与靶蛋白结合，就不会被洗掉。最后用酸或亲和洗脱液把噬菌体洗脱下来。连续这样筛3-4轮，就能筛出与靶蛋白结合力较强的噬菌体。测此噬菌体的DNA序列得到重组寡核苷酸的序列，亦知道了相应的17肽的序列。然后可通过人工化学或基因工程的方法得到17肽。本发明提供的17肽有机化合物包括a、b、c、d四种，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。
本发明提供的17肽有机化合物a的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRS，分子量为1990；17肽有机化合物b的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRP，分子量为2002；17肽有机化合物c的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRT，分子量为2004；17肽有机化合物d的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRA，分子量为1974。
以上实例说明本发明的17肽有机化合物能与抗B抗体特异性结合，所以能控制因某些血型不合输血后产生的输血反应。
实施例2竞争性ELISA(蜜二糖)试验试验方法用100μL/孔的抗B型血单克隆抗体(滴度1128)包被96孔酶标板，4℃过夜。5％BSA室温封闭2小时，用5mM的TBS缓冲液洗板3次后，加入的ELISA液为不同浓度的蜜二糖与噬菌体原液的混合液100μL。以下步骤同前。计算出抑制率＝(未加蜜二糖OD450-加入蜜二糖OD450)/未加蜜二糖OD450*100％试验结果蜜二糖能非常好的抑制抗B型血单克隆抗体与阳性克隆的结合，低达0.003mM的浓度就可以看出作用，随着蜜二糖浓度的升高，300mM浓度时的抑制率达到了80％以上，这说明了阳性克隆很可能就结合在蜜二糖与抗B型血单克隆抗体结合的位点。结果参见
图1。
以上实例说明了17肽有机化合物与抗B单克隆抗体的特异结合位点(α型Gal)是特异性的，正好起到封闭抗B单克隆抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
实施例3小肽抑制A型人血清与猪红细胞的凝集反应试验方法先把制备好的新鲜2％猪红细胞悬浮在PH＝7.4的磷酸缓冲液中备用。在V型血凝板的孔里，40ul小肽用磷酸缓冲液依次逐孔倍比稀释后，每孔分别加入40ul适当稀释的A型血人血清和40ul 2％的猪红细胞。然后把此120ul混合液在室温下先用震荡器震荡1分钟，再静置1小时后观察凝集结果。如果红细胞沉淀到孔的底部，呈一边缘光滑的圆点，则此为没有凝集。如果红细胞并不下沉到孔底，而呈边缘粗糙的网络，此为出现凝集。试验必须设空白、阳性对照。
试验结果此小肽预先能与A型人血清中的抗Gal-α-1，3-Gal抗体结合，使它失活。这样此抗体就不能再与猪红细胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原结合，从而使猪红细胞凝集起来。结果参见图2。1，2，3孔为空白对照，4，5，6孔为阳性对照(1，2，3孔不凝集，4，5，6孔出现凝集)；加入蜜二糖后的试验结果(从600mM-15mM的蜜二糖都能抑制红细胞的凝集)；加入小肽后的试验结果(前三孔能抑制红细胞的凝集，后三孔由于浓度稀释对红细胞的凝集抑制作用不完全)；加入阴性克隆后的试验结果(不能抑制A型血人血清对猪红细胞的凝集)。
图2中A1-A3为空白对照，即用40ul猪红细胞和磷酸缓冲液混匀后静置1小时的结果。此结果为未出现凝集。(红细胞沉于底部，聚集于一点)。
A4-A6为阳性对照，即用40ul磷酸缓冲液稀释60倍的A型人血清和40ul猪红细胞混匀后静置1小时的结果。此结果为出现凝集。(红细胞形成一网络，并不下沉到孔底)。
B，C两条均为蜜二糖抑制猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释蜜二糖，使蜜二糖的浓度形成600mM，300mM，150mM，75.5mM，37.75mM，18.875mM的梯度，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释60倍的A型人血清和40ul猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(低达18.875mM浓度的蜜二糖就能够抑制猪红细胞凝集)。
D，E两条均为阳性阳性克隆抑制猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释一定浓度的阳性克隆(方法同上面的蜜二糖试验)，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释60倍的A型人血清和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(前三孔能抑制红细胞的凝集，后三孔由于浓度稀释对红细胞的凝集抑制作用不完全)。
F，G两条均为阴性阳性克隆不能抑制猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释一定浓度的此阴性阳性克隆(方法同上面的蜜二糖试验)，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释60倍的A型人血清和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(阴性阳性克隆不能抑制A型血人血清对猪红细胞的凝集)。
以上实例用形象而直接的方式说明了17肽有机化合物除了能与抗B单克隆抗体结合外，还能与人体内预存的抗猪抗原的抗体特异性结合，从而封闭它的作用，起到了抑制猪异种移植超急性排斥反应的发生。
实施例417肽有机化合物抑制BS-I-B4与猪红细胞的凝集反应试验方法操作上同前一试验，唯一不同处是前试验加入的人血清替换成本试验2ug/ml的BS-I-B4。
试验结果此小肽预先能与BS-I-B4特异性地结合，从而使BS-I-B4失活而不能使猪红细胞凝集起来。参见图3。1，2孔为空白对照，3，4孔为阳性对照(1，2，孔不凝集，3，4，孔出现凝集)，加入蜜二糖后的试验结果(从600mM-15mM的蜜二糖都能抑制红细胞的凝集)，加入小肽后的试验结果(前三孔能抑制红细胞的凝集，后三孔由于浓度稀释对红细胞的凝集抑制作用不完全)加入阴性克隆后的试验结果不能抑制BS-I-B4对猪红细胞的凝集)。
图3中A1，A2为空白对照，即用40ul 2％猪红细胞和磷酸缓冲液混匀后静置1小时的结果。此结果为未出现凝集。(红细胞沉于底部，聚集于一点)。
A3，A4为阳性对照，即用40ul磷酸缓冲液稀释的2ug/mg的BS-I-B4和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。此结果为出现凝集。(红细胞形成一网络，并不下沉到孔底呈一边缘光滑的圆点)。
B，C两条均为蜜二糖抑制BS-I-B4使猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释蜜二糖，使蜜二糖的浓度形成600mM，300mM，150mM，75.5mM，37.75mM，18.875mM的梯度，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释的2ug/mg的BS-I-B4和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(低达18.875mM浓度的蜜二糖就能够抑制猪红细胞凝集)。
D，E两条均为阳性阳性克隆抑制BS-I-B4使猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释一定浓度的此阳性克隆(方法同上面的蜜二糖试验)，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释的浓度为2ug/mg的BS-I-B4和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(前三孔能抑制红细胞的凝集，后三孔由于浓度稀释对红细胞的凝集抑制作用不完全)F，G二条均为阴性阳性克隆不能抑制BS-I-B4猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释一定浓度的此阴性阳性克隆(方法同上面的蜜二糖试验)，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释的浓度为2ug/mg的BS-I-B4和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(阴性阳性克隆不能抑制BS-I-B4对猪红细胞的凝集)。
此实施例说明了17肽有机化合物与人体内预存的天然抗体的结合位点(α型Gal)是特异性的，正好起到封闭抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.17肽有机化合物及其应用，其特征是提供的17肽有机化合物包括a、b、c、d四种，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连，可用于移植排斥反应和输血反应。
2.如权利要求1所述的17肽有机化合物，其特征是17肽有机化合物a的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRS，分子量为1990。
3.如权利要求1所述的17肽有机化合物，其特征是17肽有机化合物b的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRP，分子量为2002。
4.如权利要求1所述的17肽有机化合物，其特征是17肽有机化合物c的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRT，分子量为2004。
5.如权利要求1所述的17肽有机化合物，其特征是17肽有机化合物d的氨基酸序列为CCWLLRQPVRFVRSIRA，分子量为1974。
6.如权利要求1所述的17肽有机化合物及其应用，其特征是将17肽有机化合物用于器官移植术中控制异种移植中超急性排斥反应。
7.如权利要求1所述的17肽有机化合物及其应用，其特征是将17肽有机化合物用于因血型不合输血后产生的输血反应。
全文摘要
本发明提供一种17肽有机化合物，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。由于能与抗B抗体特异性结合，起到封闭抗B单克隆抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用，能用于控制某些因血型不合输血后产生的输血反应。本发明还能与人体内预存的抗猪抗原的抗体特异性结合，从而封闭它的作用，起到了抑制猪异种移植超急性排斥反应的发生。本发明由于只有17肽，故可以用人工化学合成或基因工程的方法大量合成，又因其氨基酸数量较少，开发成药物后容易被机体利用而起效。
文档编号A61P37/00GK1412197SQ0214530
公开日2003年4月23日 申请日期2002年11月15日 优先权日2002年11月15日
发明者詹金彪, 张晖 申请人:浙江大学