肝细胞癌－相关基因和多肽,以及检测肝细胞癌的方法

专利名称：肝细胞癌－相关基因和多肽,以及检测肝细胞癌的方法
技术领域：
本发明涉及在肝细胞癌中上调的基因，由该基因编码的多肽以及检测肝细胞癌的方法。
背景技术：
利用cDNA微阵列技术可以获得正常细胞与恶性细胞内基因表达的详尽分布图(Perou，C.M.等，Nature.406747-752，2000；Clark，E.A.等，Nature.406532-535，2000；Okabe，H.等，Cancer Res.612129-2137，2001)。该方法揭示出癌细胞的复杂的性质，有助于增进对致癌作用的了解。对在肿瘤中下调的基因的鉴定可对具体癌症进行更加准确无误的诊断，并开发出新的治疗靶子(Golub，T.R.等，Science 286531-537，1999)。
肝细胞癌(HCC)是世界范围内癌症死亡的主要原因。尽管近来治疗策略有所改进，但晚期HCC患者的预后仍然很差。尽管分子水平的研究揭示出肝癌的成因与TP53，CTNNB1和/或AXIN1基因的改变相关(Perou，C.M.等，Nature.406747-752，2000；Satoh，S.等，Nat Genet.24245-250，2000)，但这些改变似乎只涉及部分HCC。因此，仍然需要可以作为诊断标记和/或治疗癌症的药物靶子的主要基因。
本发明人早先通过在HCC基因组范围内进行的分析，鉴定并报道了新基因VANGL1(Yagyu，R.等，国际肿瘤学杂志(International Journal ofOncology)201173-1178，2002)。

发明内容
本发明的一个目的在于提供在肝细胞癌中上调的基因，由该基因编码的多肽以及检测肝细胞癌的方法。
本发明人利用能显示23,040个基因的cDNA微阵列，研究了HCC的表达分布图。通过这些努力精确定位了165个基因，包括69个EST，与相应的非癌肝细胞相比它们在癌症组织中似乎高频上调。本发明人从在HCC中的表达经常提高的转录本中分离了三个基因。这些基因编码与矢车菊根皮素(centaurin)-家族蛋白质具有共同结构特征的产物。
三个基因中的一个相应于单基因簇(UniGene cluster)EST Hs.44579，该基因是在染色体带1p36.13上过表达的新基因。由于该基因的开放阅读框编码的蛋白与发育分化增强因子2(DDEF2)具有约60％同一性，本发明人将该基因称作发育分化增强因子样1(DDEFL1)。
另一个在HCC中上调的基因相应于单基因簇EST(hs.122730)。其推定的氨基酸序列分别与在果蝇中涉及细胞极性和决定细胞命运的斜视(Strabismus)(Van Gogh)和Van Gogh样2(VANGL2)具有40％和63％的同一性。因此，将该基因称作Van Gogh样1(VANGL1)。
所发现的另一个在HCC中上调的基因是LGN(Genbank登录号U54999)。LGN蛋白与抑制性异源三聚体G蛋白的α亚基(Gαi2)相互作用。
DDEFL1或LGN的基因转移促进缺乏任何一个上述基因内源表达的细胞的增殖。此外，DDEFL1，VANGL1或LGN的表达通过转染它们的特定反义S-寡核苷酸而降低后，可抑制肝细胞癌细胞的生长。
上述发现有助于阐明HCC的机制，并研究出新的策略对HCC进行诊断和治疗。
本发明具体地提供(1)选自下述的经分离的核酸(a)包含SEQ ID NO1或NO3所示核苷酸序列的核酸；(b)编码包含SEQ ID NO2或NO4所示氨基酸序列的多肽的核酸；(c)包含在严紧条件下可与由SEQ ID NO1或NO3或其互补链组成的核苷酸序列杂交的链的核酸，(2)选自下述的经分离的多肽(a)由SEQ ID NO1或NO3所示核苷酸序列编码的多肽；(b)包含SEQ ID NO2或NO4所示氨基酸序列的多肽；(c)与SEQ ID NO2或NO4具有至少65％同一性的多肽，(3)带有(1)中的核酸的载体，(4)带有(1)中的核酸或(3)中的载体的转化子，(5)生产多肽的方法，该方法包括在培养基中培养(4)中的转化子，在所述转化子中表达所述多肽，和从培养基中回收所述多肽，(6)可与(2)中的多肽特异结合的抗体，(7)检测肝细胞癌的方法，该方法包括下述步骤
(a)制备受试者的生物样品；(b)测定至少一种选自如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO5所示的多肽的表达水平；(c)将上述表达水平与在非癌症样品中的测定值相比较；和(d)确定受试者是否患癌症，(8)检测肝细胞癌的试剂，其包含在严紧条件下可与选自SEQ ID NO1，NO3或NO5的核苷酸序列或其互补序列杂交的链的核酸，(9)检测肝细胞癌的试剂，其包含(6)中的抗体，和(10)抑制肝细胞癌生长的方法，该方法包括向肝细胞癌中引入至少一种可与SEQ ID NO1，NO3或NO5的核苷酸序列杂交的反义寡核苷酸。
下面对本发明进行详细描述。
核酸本发明提供在肝细胞癌中上调的基因。
DDEFL1的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO1和NO2所示。完整的DDEFL1 cDNA由4050个核苷酸组成，具有由2712个核苷酸组成、并编码903个氨基酸的蛋白(Genbank登录号AB051853)的开放阅读框。DDFEL1的氨基酸序列与DDEFL2具有60％的同一性，与DDEF/ASAP1具有46％的同一性，其包含一个ArfGTP酶-激活蛋白(ArfGAP)结构域和两个锚蛋白(ankyrin)重复。
DDEFL1与调节肌动蛋白细胞骨架重新组织相关的矢车菊根皮素家族成员DDEF2具有60％的同一性。这表明DDEFL1可能也在细胞结构的组建中起作用(Randazzo，P.A.等，Arf GTP激活蛋白ASAP1调节肌动蛋白细胞骨架(The Arf GTPase-activating protein ASAP1 regulates the actincytoskeleton，)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974011-4016，2000)。由于DDEFL1也保持PH结构域和ArfGAP基元，所以它似乎是通过GAP激活的方式调节Arf小GTP酶的矢车菊根皮素家族新成员。据认为可在GEFs的Db1家族中的大多数分子中观察到的PH结构域是通过与特定的靶分子相互作用，和/或通过直接调节催化结构域在蛋白的重新定位中起关键作用(Jackson，T.R.等，Trends Biochem Sci.25489-495，2000；Cerione，R.A.和Zheng，Y.，Curr.Opin.Cell.Biol.8216-222，1996；Chardin，P.等，Nature 384481-484，1996)。虽然DDEF2定位于外周的粘着斑(focal adhesion)，本发明人发现myc-标记的DDEFL1蛋白质在细胞质中扩散。
Arf蛋白质涉及重要的细胞过程，如液泡膜运输，内质网(ER)和高尔基体内部空间(comparetment)完整性的维持，以及外周细胞骨架的调整(Cukierman，E.等，Science 2701999-2002，1995)。迄今为止，已鉴定出六个Arf家族成员(Arf1-Arf6)及其功能(Moss，J.and Vaughan，M.，J.Biol.Chem.27012327-12330，1995)。例如研究表明，Arf6蛋白可以作为细胞骨架的调节剂来改变粘着斑的形态并阻止细胞的扩散，且DDEF2表现出对Arf1的GAP活性。
DDEFL1的过表达增进促生长作用和细胞在低血清条件下的存活。这表明DDEFL1有助于癌细胞在贫营养和含氧量低的条件下生长。DDEFL1在HCC中频繁的上调强调了该基因在肝癌发生中的重要性。
VANGL1的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO3和NO4所示。确定的cDNA序列由1879个核苷酸组成，包含一个编码524个氨基酸的蛋白质(Genbank登录号AB057596)的由1572个核苷酸组成的开放阅读框。
经鉴定斜视(stbm)是决定果蝇突变体具有毛糙眼表型的基因(Wolff T.和Rubin G.M.，Development 1251149-1159，1998)。该基因是维持眼，腿和刚毛的极性所需的，并在果蝇中决定R3和R4光感受器的细胞命运。与stbm同源的小鼠基因Ltap在神经管突变体小鼠Loop-尾中改变，所述小鼠是神经管缺陷(NTD)的动物模型(Kibar Z等，Nat Genet.28251-255，2001)。因此，VANGL1可能还在细胞极性，细胞命运决定和/或组织结构中起重要作用。由于VANGL1在HCC中频繁地上调，并且抑制其表达将显著地减少癌细胞的生长或残留，所以VANGL1可以使癌细胞延长存活时间和/或进行去极化生长。
LGN的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO5和NO6所示。LGN的cDNA由2336个核苷酸组成，编码677个氨基酸的肽。
从前报道LGN蛋白是与抑制性的异源三聚体G蛋白α亚基(Gαi2)相互作用的蛋白)(Mochizuki，N.等，Gene 18139-43，1996)。Gαi2的激活突变曾经在垂体瘤等内分泌肿瘤中有过报道(Hermouet，S.等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 8810455-10459，1991；Pace，A.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.887031-7035，1991；Lyons，J.et al，Science 249655-659，1990)。然而，未见到LGN涉及肿瘤发生或致癌作用的报告。集落形成试验表明LGN可能具有致癌的活性。LGN增强表达可以活化Gαi2并且介导肝癌发生中的致癌信号。
本发明的核酸包括cDNA，基因组DNA，化学合成的DNA和RNA。可以是单链或双链。
此处所用“经分离的核酸”是指一种核酸，其结构不等同于任何天然存在的核酸，或跨越三个以上独立基因的天然基因组核酸的任何片段。因此该术语包括，例如(a)一种DNA，其具有该DNA分子天然状态下所在生物体的基因组中天然基因组DNA分子的一部分序列；(b)一种核酸，其整合到载体或原核或真核生物基因组DNA中，使所得的分子不同于任何天然载体或基因组DNA；(c)单独的分子例如cDNA，基因组片段，由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，或限制性片段；和(d)重组核苷酸序列，作为杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的一部分。具体地说，从这一定义中排除的是下述的核酸，即存在于由不同的(i)DNA分子，(ii)转染细胞，或(iii)细胞克隆形成的混合物中的DNA分子，例如当它们出现在DNA文库，如cDNA或基因组DNA文库中。
在一个实施方案中，本发明的核酸包括，包含DDEFL1或VANGL1的核苷酸序列(具体说来是SEQ ID NO1或NO3)的核酸。
在另一个实施方案中，本发明的核酸包括编码包含DDEFL1或VANGL1的氨基酸序列的多肽(具体说来是SEQ ID NO2或NO4)的核酸。因而，包含基于遗传密码简并性的任意序列的核酸均包括在内。
在又一个实施方案中本发明的核酸包含SEQ ID NO1或NO3的变体核酸序列。所述变体包括含有在严紧条件下可与由SEQ ID NO1或NO3组成的核苷酸序列或其互补链杂交的链的核酸。
此处所用的术语“互补”是指双链核酸的其中一条链的全部碱基均能与另一条链的碱基形成碱基对。另外，“互补”不仅指在至少15个毗连核苷酸形成的连续区域内完全匹配的那些，还包括在该区域内具有至少65％，优选70％，更优选80％，更优选90％，最优选95％或更高同一性的那些。
此处所述两核酸的“百分比同一性”是利用Karlin和Altschul的算法(Proe.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990)经Karlin和Altschul修改(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)后的算法确定的。该算法已并入Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(J.Mol.Biol.215403-410，1990)。BLAST核苷酸检索是利用NBLAST程序进行的，得分(score)＝100，字长(wordlength)＝12。蛋白质的同源检索可在，例如在日本DNA数据库(DDBJ)中通过FASTA程序，BLAST程序等进行。BLAST蛋白质检索是利用XBLAST程序进行的，得分(score)＝50，字长(wordlength)＝3。当两序列间存在缺口(gap)时，利用Gapped BLAST进行，参见Altsuchl等(Nucleic AcidsRes.253389-3402，1997)。运用BLAST和Gapped BLAST程序时，应用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
优选地，该变体包括与SEQ ID NO1或NO3所示的核苷酸序列具有至少65％同一性的核苷酸序列。更优选，该变体与SEQ ID NO1或NO3所示的核苷酸序列具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的同一性。当所述变体在长度上等同于或长于参照序列，如SEQ ID NO1或NO3时，所述比较是基于全长的参照序列作出的。当所述变体比参照序列，例如SEQ ID NO或NO3短时，所述比较是基于参照序列中与变体序列相同长度的节段进行的(排除同源性计算时所需的任何环)。
所述严紧条件杂交定义为在下述条件下进行的平衡杂交42℃，2xSSC，0.1％SDS(低严紧)；50℃，2x SSC，0.1％SDS(中度严紧)；65℃，2x SSC，0，1％SDS(高度严紧)。如果需要通过洗涤达到平衡，所述洗涤利用适合于具体严紧性要求的杂交溶液进行。通常，温度越高在平衡状态下杂交的两条链间的同源性越高。
对本发明的核酸的长度没有限制，但其优选包含至少15，20，30，40 50，100，150，200，300，400，500 1000，1500，2000，2500，或3000个核苷酸。
本发明的核酸包括用作探针或引物的多核苷酸，所述探针或引物可与SEQ ID NO1或NO3或其互补链特异杂交。术语“特异杂交”是指在通常的杂交条件下，优选在严紧条件下与SEQ ID NO1或NO3所示的核苷酸序列杂交，但不与编码其它多肽的DNA交叉杂交。
所述引物和探针包含SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列或其互补序列中的至少15个连续的核苷酸。通常，所述引物包含15到100个核苷酸，优选包含15到35个核苷酸，所述探针包含至少15个核苷酸，优选包含至少30个核苷酸，包含SEQ ID NO1或NO3所示序列的部分或全部。所述引物可用于扩增编码本发明多肽的核酸，所述探针可用于分离或检测编码本发明的多肽的核酸。本发明的引物和探针可利用，例如可商购的寡核苷酸合成仪制备。所述探针也可以通过限制酶处理等方式制备成双链DNA片段。
本发明的核酸包括可与SEQ ID NO1或3的核苷酸序列中任意位点杂交的反义寡核苷酸。本文术语“反义寡核苷酸”不仅指其全部核苷酸均与相应的DNA或mRNA特异区域互补的那些寡核苷酸，还包括具有一个或多个错配的核苷酸的寡核苷酸，只要DNA或mRNA和寡核苷酸能与SEQ IDNO1或NO3的核苷酸序列杂交即可。
优选所述反义寡核苷酸针对SEQ ID NO1或NO3中的至少15个连续的核苷酸。更优选上述的反义寡核苷酸包含上述至少15连续的核苷酸中的起始密码子。
本发明的反义寡核苷酸包括含低级烷基磷酸酯(例如，甲基磷酸酯或乙基磷酸酯)，硫代磷酸酯(phosphothioate)和磷酰胺酸酯(phosphoramidate)的类似物。
本发明的反义寡核苷酸，通过与编码本发明多肽的DNA或mRNA相结合并抑制其转录或翻译，从而作用于产生本发明的多肽的细胞，促进所述mRNA的降解从而抑制本发明多肽的表达。
本发明核酸的制备如下。可例如根据编码本发明多肽的DNA的核苷酸信息(例如SEQ ID NO1或NO3)制备引物，通过噬斑PCR(Affara NA等(1994)Genomics 22，205-210)制备编码本发明多肽的cDNA。利用可商购的“Qiagen基因组DNA试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)的方法制备基因组DNA。所得DNA的核苷酸序列可以利用本领域已知的方法，例如可商购的″染料终止子测序试剂盒″(Applied Biosystems)确定。本发明的核酸，如下文所述可用于生产重组蛋白并检测肝细胞癌。
载体，转化子和重组多肽的生产本发明还涉及插入了本发明核酸的载体。
本发明的载体包括制备本发明重组多肽的载体。任何能够表达本发明多肽的载体均可使用。
表达载体的实例包括细菌(例如大肠杆菌)表达载体，酵母表达载体，昆虫表达载体，和哺乳动物表达载体。在本发明中，哺乳动物表达载体如，pcDNA3.1-myc/His或pcDNA 3.1载体(Invitrogen)均可使用。可利用本领域公知的方法将本发明的核酸插入到载体中。
本发明的载体还包括在体内表达本发明多肽的载体(尤其用于基因治疗)。各种病毒载体和非病毒载体只要其能在体内表达本发明的多肽均可使用。病毒载体的实例包括腺病毒载体，反转录病毒载体等等。阳离子脂质体可作为非病毒的载体的例子。
本发明还提供以可表达的方式带有本发明核酸的转化子。本发明的转化子包括带有插入了本发明核酸的上述表达载体的转化子，以及带有整合了本发明核酸的基因组的转化子。本发明的核酸可以任何形式保留在所述转化子中，只要所述转化子可以表达所述核酸即可。
本发明对插入了所述载体的细胞没有特殊的限制，只要所述载体能在所述细胞中表达本发明的核酸即可。例如大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞和昆虫细胞均能用作宿主细胞。优选的哺乳动物细胞如COS7细胞和NIH3T3细胞。可用本领域已知的方法，如电穿孔法和磷酸钙法将载体引入细胞。
可用本领域的常规方法从转化子中分离纯化所述重组多肽。例如，在收集了转化子并获得了提取物之后可通过离子交换层析，反向层分析法，凝胶过滤，或在柱子中固定了针对本发明多肽的抗体的亲和层析法，或通过这几种柱子的组合，来纯化并制备目的多肽。
当本发明的多肽在宿主细胞(例如动物细胞，大肠杆菌)中作为与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的融合蛋白表达，或作为添加了多个组氨酸的重组多肽表达时，可利用谷胱甘肽柱或镍柱纯化所表达的重组多肽。融合蛋白纯化后还可以根据需要用凝血酶或Xa-因子切除非目的多肽区域。
多肽本发明提供由DDEFL1或VANGL1(例如SEQ ID NO1或NO3)编码的经分离的多肽。在具体实施方案中，本发明的多肽包括由SEQ ID NO1或NO3的核苷酸序列编码的多肽，和包含SEQ ID NO2或NO4所示氨基酸序列的多肽。
所述“经分离的多肽”指基本纯且不含其它生物大分子的多肽。基本纯的多肽是干重至少75％(例如，至少80，85，95，或99％)纯的。纯度可通过任何适宜的标准方法测定，例如通过柱层析法，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或高效液相色谱分析。
本发明的多肽包括SEQ ID NO2或NO4的变体，只要所述变体与SEQID NO2或NO4具有至少65％的同一性即可。所述变体可以是，包含SEQID NO2或NO4所示氨基酸序列、且其中有一个或多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入的多肽。所述变体也可以是由包含在严紧条件下可与由SEQ ID NO1或NO3所示核苷酸序列杂交的链的核酸所编码的多肽。
已知具有在具体氨基酸序列中缺失，添加和/或替代一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列的多肽可保持原始的生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666，Zoller，M.J. & Smith，M.，NucleicAcids Research(1982)10，6487-6500，Wang，A.等，Science 224，1431-1433，Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
通过取代，缺失，添加，和/或插入而突变的氨基酸的数目没有特别的限定。通常，该数目是氨基酸残基总数的10％或更少，优选5％或更少，更优选1％或更少。
将要突变的氨基酸残基优选经过突变成为侧链性质保守的不同氨基酸。氨基酸侧链性质的实例是疏水的氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，以及含有下列侧链的氨基酸脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；包含羟基的侧链(S，T，Y)；含硫原子的侧链(C，M)；含羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；包含碱基的侧链(R，K，H)；和包含芳族的侧链(H，F，Y，W)(括号中的字母是氨基酸的单字母密码)。“保守氨基酸取代”是用上述一组中氨基酸取代同组中的另一氨基酸。
缺失变体包括SEQ ID NO1或NO3所示氨基酸序列的片段。该片段是具有与本发明的上述多肽部分相同但非全部相同的氨基酸序列的多肽。本发明的多肽片段通常由8个或更多氨基酸残基组成，优选由12个或更多氨基酸残基组成(例如，15个或更多氨基酸残基)。优选片段的实例包括下述的截短多肽具有缺失了一组或两组氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，其中所述一组缺失包括氨基末端或羧基末端的缺失，所述两组缺失分别包括氨基末端和羧基末端的缺失。此外，还优选具有结构或功能特点的片段，其包括那些具有α-螺旋和α-螺旋形成区，β-折叠和β-折叠形成区，转角和转角形成区，卷曲和卷曲形成区，亲水区域，疏水区域，α-两亲性区域，β-两亲性区域，可变区，表面成形区域，底物结合区域，和高抗原性指数区域。也优选生物学活性片段。生物学活性片段可以介导本发明多肽的活性，所述片段包括那些具有类似的或改进的活性的片段和减少了不良活性的片段。例如具有通过结合配体将信号转导到细胞内的活性的片段，以及在动物(包括人)中具有抗原性或免疫原性的片段。这些多肽片段优选保持本发明多肽的抗原性。
所述添加变体包括本发明多肽与另一肽或多肽的融合蛋白。融合蛋白可利用本领域技术人员已知的方法制备，例如将编码本发明多肽的DNA与编码其它肽或多肽的DNA相连接，使框架匹配，再将其插入表达载体并在宿主中表达。对与本发明的多肽相融合的肽或多肽没有限制。
已知的肽，例如FLAG(Hopp，T.P.等，Biotechnology(1988)6，1204 1210)，6xHis(包含六个His(组氨酸)残基)，10xHis，流感病毒凝集素(HA)，人C-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7标记，HSV-标记，E-标记，SV40 T抗原片段，lck标记，α-微管蛋白片段，B-标记，蛋白C片段，等等均可用作与本发明的多肽相融合的肽。与本发明的多肽相融合的多肽的例子，如GST(谷胱甘肽-S-转移酶)，流感病毒凝集素(HA)，免疫球蛋白恒定区，β-半乳糖苷酶，MBP(麦芽糖-结合蛋白)等等。
通过将可商购的编码这些肽或多肽的DNA与编码本发明的多肽的DNA相融合，并表达所述融合DNA，可以制备融合蛋白。
变体多肽优选与SEQ ID NO2或NO4所示氨基酸序列具有至少65％的同一性。更具体地说，所述修饰多肽与SEQ ID NO2或NO4所示氨基酸序列具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或以上的同一性。当经修饰的多肽长于或等同于参考序列，例如SEQ ID NO2或NO4时，所述比较是基于全长的参考序列进行的。当经修饰的多肽比参照序列，例如SEQ ID NO2或NO4短时，所述比较是基于参照序列中和变体序列相同长度的节段进行的。
此处所用两个氨基酸序列间的“百分同一性”是应用与上述核酸的描述中同样的方法确定的。
本发明的多肽可应用本领域技术人员已知的方法，通过上述的遗传工程技术制备成天然的多肽或重组多肽。天然的多肽可通过下述方式获得，即用重组多肽免疫小动物获得抗体，将该抗体与柱子偶联，利用这种柱子通过亲和层析提取高水平表达本发明多肽的肝组织或细胞。制备重组多肽可以是，将编码本发明多肽的DNA(例如包含SEQ ID NO或3所示核苷酸序列的DNA)插入到合适的表达载体中，将所述表达载体引入宿主细胞，使所得的转化子表达所述多肽，再回收所表达的多肽。
可以通过已知的方法，例如PCR-介导的定点诱变诱导系统(GIBCO-BRL，Gaithersburg，Maryland)，寡核苷酸-介导的特定区域(sight-directed)-诱变(Kramer，W.and Fritz，HJ(1987)酶学方法(Methods inEnzymol)154350-367)将突变插入到SEQ ID NO1或NO3的氨基酸序列中，来制备变体多肽。
抗体本发明还涉及可与本发明的多肽特异结合的抗体。对本发明的抗体的形式没有特别地限制，其包括多克隆抗体和单克隆抗体。还包括用本发明的多肽免疫动物(如，兔)制备的抗血清，各类多克隆和单克隆抗体，由遗传工程制备的人源化抗体，以及人抗体。
多克隆抗体可通过下述方式制备，即收获用本发明的多肽免疫小动物(如兔)所获得的血清，通过偶联了本发明多肽的亲和层析柱取得仅仅识别本发明多肽的组分，再利用蛋白G或蛋白A柱从上述组分中纯化免疫球蛋白G或M。
制备单克隆抗体是通过下述方式进行的，即用本发明的多肽免疫小动物(如小鼠)，取出所述动物的脾脏，将所述器官匀浆成细胞，再利用试剂，如聚乙二醇将所述细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从融合细胞(杂交瘤)中选择能产生针对本发明多肽的抗体的克隆，将所得的杂交瘤移植到小鼠的腹腔中，提取腹水。所得的单克隆抗体可通过，例如硫酸铵沉淀，蛋白A或蛋白G柱，DEAE离子交换层析，或偶联了本发明多肽的亲和层析柱进行纯化。本发明的抗体可用于纯化和检测本发明的多肽。特别是可用于检测肝细胞癌。
人抗体或人源化抗体可通过本领域技术人员已知的方法制备。例如可用本发明的多肽免疫已将其免疫系统转变为人免疫系统的小鼠来制备人抗体。人源化的抗体可通过下述方法制备，例如从单克隆抗体产生细胞克隆出所述抗体的基因，利用CDR移植方法将所述基因中的抗原识别部位移植到已知的人抗体中。
检测方法本发明还提供利用DDEFL1 VANGL1或LGN多肽作为标记检测肝细胞癌的方法。
所述检测是通过下述方法进行的，测定来自受试者的生物样品中DDEFL1 VANGL1，和LGN多肽至少其中之一的表达水平，将其与非癌样品中的表达水平相比较，确定受试者是否患癌症。
此处所用的生物样品包括来自需要进行肝细胞癌检测的受试者的任何肝组织或细胞。特别是可以使用肝活组织检查样品。所述生物样品还包括由肝组织或细胞制备的mRNA，cRNA或cDNA样品。mRNA和cDNA样品可由常规方法制备。cRNA是指用RNA聚合酶从模板cDNA转录所得的RNA。cRNA可以以连接有T7启动子的cDNA为模板，利用T7 RNA聚合酶来合成。可以利用为获得基于DNA芯片的表达分布图的可商购cRNA转录试剂盒。
在具体实施方案中，可以通过RNA，cDNA或多肽的水平测定DDEFL1，VANGL1或LGN多肽的表达水平。
mRNA的表达水平可以通过例如，利用可与DDEFL1，VANGL1，或LGN的核苷酸序列杂交的探针进行Northern印迹，或利用可与DDEFL1，VANGL1，或LGN的核苷酸序列杂交的引物进行RT-PCR来测定。
用于本发明的检测方法的探针和引物包括可与SEQ ID NO1，NO3或NO5的核苷酸序列或其互补序列特异杂交的核酸。术语“特异杂交”是指在正常杂交条件下，优选在严紧条件下，可与SEQ ID NO1，NO3或NO5的核苷酸序列杂交，而不与编码其它多肽的DNA交叉杂交。
所述引物和探针包含SEQ ID NO1，NO3或NO5的核苷酸序列或它们的互补序列中至少15个连续的核苷酸。通常，所述引物包含15到100个核苷酸，优选15到35个核苷酸，所述探针包含至少15个核苷酸，优选至少30个核苷酸，其包含SEQ ID NO1，NO3或NO5的至少一部分或全部序列。所述引物和探针可通过例如可商购的寡核苷酸合成仪制备。所述探针还可以制备成由限制酶处理所得的双链DNA片段。
cDNA表达水平可通过，例如应用DNA阵列的方法测定(MasamiMuramatsu和Masashi Yamamoto，新遗传工程手册(New Genetic EngineeringHandbook)280-284页，YODOSHA Co.，LTD.)。具体地说，首先提供来自受试者的cDNA样品和固体支持物，其上固定有与DDEFL1，VANGL1或LGN的核苷酸序列杂交的多核苷酸探针。可以利用如上所述探针。可以在所述固体支持物上固定两种以上的探针以检测两种以上的靶多核苷酸。根据需要可对cDNA样品进行标记以用于检测。对于所用的标记并没有特殊地限定，只要其能被检测即可，例如荧光标记，放射性标记等。可通过常规的方法进行标记(L.Luo等，“激光捕获的邻近神经原亚型基因表达分布图(Geneexpression profiles of laser-captured adjacent neuronal subtypes)”，Nat.Med.(1999)117-122页)。
使cDNA样品与固定于固体支持物上的探针相接触，以便使cDNA样品与所述探针杂交。尽管杂交反应溶液和反应条件根据不同的因素，如探针的长度而有所不同，但本领域的技术人员可以通过常规的方法来确定。
cDNA样品和固体支持物上的探针之间的杂交强度，可根据cDNA样品的标记物种类进行确定。例如可通过探测器读出荧光信号来检测荧光标记物。
用不同的荧光标记对实验cDNA样品和对照cDNA样品(例如来自非癌组织或细胞的cDNA)进行标记即可同时测定它们的杂交强度。例如上述的一个cDNA样品用Cy5标记，另一个用Cy3标记。Cy5和Cy3的荧光信号强度说明各cDNA样品的表达水平(Duggan等，Nat.Genet.2110-14，1999)。
在该方法中也可以用cRNA而不是cDNA进行测定。
此外，可利用针对DDEFL1，VANGL1，或LGN多肽的抗体，通过下述方法测定多肽的表达水平，所述方法例如SDS聚丙烯酰胺电泳法，Western印迹，点印迹，免疫分析，例如免疫沉淀，荧光免疫分析，放射免疫分析，酶免疫分析(例如酶联免疫吸附试验(ELISA))，和免疫组化染色等等。
在具体实施方案中，将生物样品与固定于固体支持物上的针对DDEFL1，VANGL1或LGN多肽的抗体相接触，再将所述固体支持物上的抗原-抗体复合物与带有可检测的标记的第二抗体相接触，用适当的方法检测所述标记物。
用于本发明的检测方法的抗体包括任何可与DDEFL1，VANGL1，或LGN多肽，特别是与具有SEQ ID NO2，NO4或NO6的氨基酸序列的多肽结合的抗体，包括用DDEFL1，VANGL1，或LGN多肽免疫动物(如兔)所得的抗血清，各种类别的多克隆和单克隆抗体，由遗传工程制备的人源化抗体，和人抗体。这些抗体的制备如上所述。
将如上述测定的表达水平与在非癌样品中测定的表达水平相比较，确定受试者是否存在肝细胞癌。当在受试者样品中测得的表达水平高于非癌样品中的表达水平时，则可判断受试者患有癌症或具有患所述癌症的危险性。另一方面，当在受试者样品中测得的表达水平不高于非癌样品中的表达水平时，则可判断受试者未患有癌症。具体地说，受试样品是否比非癌样品的表达水平高可根据相对表达比率(受试样品/非癌样品)确定；当所述相对表达比率高于2.0，可以断定其表达水平较高。
检测试剂本发明提供针对肝细胞癌的检测试剂。
在一个实施方案中，本发明的检测试剂包括具有可与DDEFL1，VANGL1或LGN，特别是SEQ ID NO1，NO3，或NO5杂交的至少15个核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可作为探针或引物用于上述本发明的检测方法。用作探针时，包含于本发明的检测试剂中的多核苷酸可以是经过标记的。标记的方法包括，例如通过T4多核苷酸激酶用32P使所述多核苷酸的5’-末端磷酸化的标记方法；以随机的六聚物寡核苷酸等作为引物，通过DNA聚合酶例如Klenow酶引入带有同位素(例如32P)，荧光染料，生物素等标记的底物碱基的方法(随机引导法等等)。
在另一个实施方案中，本发明的检测试剂包含可与DDEFL1，VANGL1或LGN多肽特别是具有SEQ ID NO2，NO4，或NO6的氨基酸序列的多肽相结合的抗体。本发明的抗体用于在上述本发明的检测方法中检测本发明的多肽。所述抗体可用公知的方法进行标记。此外，所述抗体可被固定到固体支持物上。
本发明的检测试剂还可以包含介质或添加剂，包括无菌水，生理盐水，植物油，表面活性剂，脂类，增溶剂，缓冲液，蛋白稳定剂(如牛血清白蛋白和明胶)，保存剂等等，只要其不影响本发明检测方法中的反应即可。
抑制肝细胞癌生长的方法本发明还提供抑制肝细胞癌生长的方法。在一个具体实施方案中，该方法可通过将DDEFL1，VANGL1，或LGN的反义寡核苷酸引入靶细胞来进行。
用于该方法的反义寡核苷酸可与SEQ ID NO1，NO3，或NO5的核苷酸序列内的任意位点杂交。所述反义寡核苷酸不仅包括那些全部的核苷酸均与相应的DNA或mRNA特异区域的核苷酸互补的寡核苷酸，还包括具有一个或多个错配的核苷酸的寡核苷酸，只要DNA或mRNA和寡核苷酸能与SEQ ID NO1或NO3或NO5的核苷酸序列杂交即可。
所述反义寡核苷酸优选针对SEQ ID NO1，NO3，或NO5中至少15个连续的核苷酸。更优选上述的反义寡核苷酸包含上述至少15连续的核苷酸中的起始密码子。
所述反义寡核苷酸包括含低级烷基磷酸酯(例如，甲基磷酸酯或乙基磷酸酯)，硫代磷酸酯和磷酰胺酸酯的类似物。
此处，所述靶细胞可以是哺乳动物细胞，优选人细胞。
所述引入方法可以是体外，体内，或回体(ex vivo)的转移方法。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸可以通过常规的转染方法引入靶细胞。或者，所述引入可通过常规的基因转移技术，利用带有反义寡核苷酸的载体，如腺病毒载体，反转录病毒载体，或阳离子的脂质体进行。
在此引用的任何专利，专利申请，和出版物均并入本申请作为参考。


图1a-1b说明HCC中称作B9362的基因的表达。图1a说明由cDNA微阵列检测的B9362在原始的20个HCC中的相对表达比率(癌/非-癌)。图1b显示对附加的11个HCC病例通过半定量RT-PCR分析的B9362表达情况的照片。GAPDH的表达作为内部对照。
图2a-2d说明DDEFL1的鉴定结果。图2a是DDEFL1在各种人组织中的Northern印迹分析结果。图2b显示DDEFL1的结构。图2c显示预期的DDEFL1蛋白和ArfGAP家族成员之间的相似性。图2d显示DDEFL1和DDEF2中ArfGAP基元氨基酸序列之间的同一性。箭头指示CXXCX16CXXC基元，表示对GAP活性而言必不可少的锌指结构。
图3a-3b显示DDEFL1的亚细胞定位。图3a是Western印迹分析结果的照片，表明cMyc-标记的DDEFL1蛋白在经pcDNA-DDEFL1-myc质粒转染的COS7细胞中表达。图3b是显示所述细胞的免疫细胞化学的照片，表明cMyc-标记的DDEFL1蛋白定位于细胞质。
图4a-4d显示DDEFL1的生长-促进效果。图4a是显示集落形成试验结果的照片，表明DDEFL1促进NIH3T3，SNU423，和Alexander细胞生长。图4b是表明NIH3T3-DDEFL1细胞稳定表达外源DDEFL1的照片。图4c是显示稳定表达外源DDEFL1的NIH3T3-DDEFL1细胞在含10％FBS的培养基中的生长。图4d是显示NIH3T3-DDEFL1细胞在含0.1％FBS的培养基生长的图表(p＜0.01)。
图5a-5b显示经设计能在SNU475细胞中抑制DDEFL1的反义S-寡核苷酸的生长抑制作用。图5a显示反义S-寡核苷酸的设计和显示通过转染AS1或AS5反义S-寡核苷酸使DDEFL1表达降低的照片。图5b是显示AS1和AS5抑制SNU475细胞生长的照片。
图6a-6b显示VANGL1在HCC中的表达。图6a显示由cDNA微阵列检测的VANGL1在原始的20个HCC中的相对表达比率(癌/非-癌)。图6b是显示用附加的10个HCC病例由半定量RT-PCR分析的D3244表达情况的照片。T，肿瘤组织；N，正常组织。GAPDH的表达作为内部对照。
图7a和7b说明VANGL1的鉴定结果。图7a是显示VANGL1在各种人组织中多-组织Northern印迹分析结果的照片。图7b显示预期的VANGL1蛋白质结构。
图8a和8b显示VANGL1的亚细胞定位。图8a是用pcDNA3.1-myc/His-VANGL1转染，用小鼠抗-myc单克隆抗体染色，用偶联了若丹明的抗小鼠IgG第二抗体显现的SNU475细胞的照片。核是DAPI复染的。图8b是经类似染色并观察的模拟细胞的照片。
图9a-9d显示经设计能抑制VANGL1的反义S-寡核苷酸的生长抑制效果。图9a是显示VANGL1在用对照或反义寡核苷酸处理12小时的SNU475细胞中表达的照片。图9b是显示S寡核苷酸抑制SNU423细胞生长的照片。图9c是由MTT试验分析细胞活力的结果图。图9d是显示经正义或反义寡核苷酸处理的细胞的荧光活化细胞分拣(FACS)结果。
图10a和10b显示与相应的非癌活组织相比HCC的LGN基因表达。图10a显示由cDNA微阵列检测的LGN在原始的20个HCC中的相对表达比率(癌/非-癌)。图10b显示用附加的10个HCC病例由半定量RT-PCR分析的LGN表达情况的照片。GAPDH的表达作为内部对照。T，肿瘤组织；N，正常组织。
图11显示LGN的基因组结构。
图12a-12c显示LGN的亚细胞定位。图12a是用pcDNA3.1-myc/His-LGN转染的COS7细胞的照片，其中核是DAPI复染的。图12b是用pcDNA3.1myc/His-LGN转染，用小鼠抗c-myc抗体染色，用偶联了若丹明的抗小鼠IgG第二抗体显示的COS7细胞。图12c是a和b的合并。
图13a和13b显示LGN的生长-促进效果。图13a是显示集落形成试验结果的照片，表明LGN促进NIH3T3，SNU423，Alexander和SNU475细胞的生长。图13b是显示在含10％FBS的培养基中稳定表达外源LGN的NIH3T3-LGN细胞的生长优于模拟(NIH3T3-LacZ)细胞。
图14a和14b显示经设计能抑制LGN表达的反义S-寡核苷酸在人肝细胞癌SNU423细胞中的生长抑制。图14a的照片显示，反义S-寡核苷酸反义3的转染降低了LGN的表达。图4b的照片显示，反义3抑制了SNU423细胞生长。
本发明的最佳实施方式参照下述实施例对本发明进行阐述，但这些实施例不视为对本发明的限制。
实施例11-1.鉴定通常在人肝细胞癌中上调的DDEFL1通过包含23040个基因的基因组范围的cDNA微阵列方法，将20例肝细胞癌(HCC)的表达分布图分别与其相应的非癌肝组织进行了比较。所有的HCC组织和相应的非癌组织都是经肝切除术病人同意由其外科手术样品中获得的。发现具有本国(in-house)登录号B9362的基因(相应于EST，UniGene簇的Hs.44579)在1.57到5.83的范围内过表达(图1a)。在12例HCC中的11例中均观察到其上调的表达(Cy3Cy5强度比＞2.0)，所述12例是可以穿过截留滤光片的病例(cy3和Cy5信号都大于25,000)。由于该基因的开放阅读框编码的蛋白与发育分化增强因子2(DDEF2)具有约60％同一性，本发明人将该基因称作发育分化增强因子样1(DDEFL1)。为了阐明cDNA的微阵列结果，通过半定量RT-PCR检测了另外11例HCC中该转录本的表达。GAPDH的表达作为内部对照。RT-PCR是如下进行的。用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(Life Technologies，Inc.)根据产品说明抽提总RNA。用聚dT12-18引物(Amersham Pharmacia Biotech)和Superscript II反转录酶(Life Technologies)将10微克小份的总RNA反转录成单链cDNA。稀释单链cDNA制剂，以备随后在20μl PCR缓冲液(TAKARA)中，通过标准RT-PCR实验进行PCR扩增。扩增反应是在GeneAmp PCR system 9700(Perkin-Elmer，Foster City，CA)中如下进行的94℃变性4min，然后以94℃30s，56℃30s，72℃45s进行20(对于GAPDH)或33(对于DDEFL1)个循环。GAPDH引物序列为正向5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG(SEQ ID NO7)，反向，5’-GGTCCACCACTGACACGTTG(SEQ ID NO8)；DDEFL1引物序列为正向5’-AGCTGAGACATTTGTTCTCTTG(SEQ ID NO9)，反向5’-TATAAACCAGCTGAGTCCAGAG(SEQ ID NO10)。结果证实DDEFL1的表达在九例肿瘤增加(图1b)。
1-2.新基因DDEFL1的分离和结构DDEFL1的表达是利用DDEFL1的PCR产物为探针，通过多-组织northern-印迹分析检测的。人多-组织印迹(Clontech，Palo Alto)与32P标记的DDEFL1 cDNA杂交。依照供应商的说明进行预杂交，杂交和洗涤。所述印迹用增感屏在-80℃下放射自显影72h。结果表明4-kb的转录本在肺，肝，小肠胎盘和外周血白细胞中表达(图2a)。
由于B9362比在Northern印迹中检测出的小，通过5’RACE实验确定该基因的全部编码序列。5’RACE实验是利用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)依照制造商的说明进行的。利用试剂盒中提供的基因-特异的反向引物(5’-CTCACTTGGCACGTCAGCAGGG(SEQ ID NO11))和AP-1引物扩增DDEFL1 cDNA的5′部分。cDNA模板是由人肝mRNA合成的。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆PCR产物，用ABI PRISM 3700 DNA测序仪(Applied Biosystems)确定其序列。
完整的cDNA由4050个核苷酸组成，具有一个2712个核苷酸的开放阅读框，它编码具有903个氨基酸的蛋白(Genbank登录号AB051853)。第一个ATG的侧翼序列(CCCGCCATGC(SEQ ID NO12))与在真核生物中起始翻译的共有序列相吻合，并在上游带有一个框内终止密码子。在NCBI(国家生物信息中心)数据库中用BLAST程序检索，鉴定出一个已分配到染色体带1p36.12上的基因组序列(Genbank登录号AL357134)。该cDNA与基因组序列的比较显示DDEFL1由25个外显子组成(图2b)。
用简单模块结构检索工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART)检索蛋白基元，结果显示预期的蛋白包含两个卷曲螺旋区(密码子141-172和241-278)，一个PH(Pleckstrin homology)基元(密码子303-396)，一个ArfGAP基元(Arf的GTP酶激活蛋白)(密码子426-551)，和两个锚蛋白重复(密码子585-617和621-653)。这一结构与矢车菊根皮素β1和矢车菊根皮素β2(图2c)类似。特别是DDEFL1具有矢车菊根皮素-家族蛋白的特征，如PH结构域，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸的靶子，和ArfGAP基元。DDEFL1的ArfGAP基元的氨基酸序列与DDEF2中相应部分具有67.8％的同一性。显然，代表对GAP活性必不可少的锌指结构的CXXCX16CXXC基元是完全保守的。
1-3.DDEFL1的亚细胞定位将DDEFL1的编码序列克隆到pcDNA3.1-myc/His载体(invitrogen)中。将所得的表达myc-标记型DDEFL1蛋白的质粒(pDNA-myc/His-DDEFL1)瞬时转染COS7细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC))。通过免疫印迹(Western印迹)检测预期的myc-标记蛋白如下。将用pcDNA3.1-myc/His-DDEFL1转染的细胞用PBS洗两次，再用裂解缓冲液(150mM NaCl，1％Triton X-100，50mM Tris-HCl pH7.4，1mM DTT和1X完全蛋白酶抑制剂混合物(Boehringer))收集。在细胞匀浆后，10,000xg离心30min，使上清液标准化以利用Bradford试验(Bio-Rad)测定蛋白浓度。用10％SDS-PAGE分离蛋白，用小鼠抗myc抗体进行免疫印迹。HRP-偶联的山羊抗小鼠IgG(Amersham)作为第二抗体用于ECL检测系统(Amersham)。结果，用抗myc抗体在western印迹中检测到了DDEFL1蛋白(图3a)。
此外，免疫细胞化学染色是如下进行的。首先，将所述细胞用含4％多聚甲醛的PBS固定15min，然后在RT中，用含0.1％Triton X-100的PBS透析2.5min。然后在4℃将所述细胞用含2％BSA的PBS覆盖24h以封闭非特异性杂交。将小鼠抗myc单克隆抗体(Sigma)以1∶1000稀释，或将小鼠抗FLAG抗体(Sigma)以1∶2000稀释用作第一抗体，与若丹明偶联型抗-小鼠第二抗体(Leinco和ICN)一起孵化，观察所述反应。核用4′，6′-联脒-2′-苯基吲哚二氢氯化物(DAPI)复染。在ECLIPSE E800显微镜下获得荧光图像。显微分析表明该蛋白主要存在于细胞质中(图3b)。DDEFL1也定位在人胚肾(HEK293)细胞(ATCC)的细胞质中。
1-4.DDEFL1对细胞生长的影响将DDEFL1的编码序列克隆到pcDNA 3.1载体(invitrogen)中。将涂布于10-cm平皿(2×105细胞/皿)的NIH3T3细胞(ATCC)，用表达DDEFL1的质粒(pcDNA DDEFL1)和对照质粒(pcDNA-LacZ)转染，在添加了10％胎牛血清和1％抗生素/抗霉菌溶液(Sigma)的Dulbecco改良Eagle’s培养基中培养，并进一步用适当浓度的遗传霉素培养两周。细胞用100％甲醇固定，再用Giemsa溶液染色。用pcDNA-DDEFL1转染的细胞比对照细胞明显产生了更多克隆。用人肝细胞癌SNU423(韩国细胞系库)和Alexander(ATCC)细胞转染也出现类似的集落形成增多现象，其中DDEFL1内源表达极低(图4a)。
为了进一步研究这一生长-促进效应，建立了稳定表达外源DDEFL1的NIH3T3细胞。利用FuGENE6试剂(Boehringer)按照供应商的说明将pDNA-myc/His-DDEFL1转染到NIH3T3细胞中。转染24小时后，向培养基中添加遗传霉素，转染两周后选出单个集落。用半定量RT-PCR确定DDEFL1的表达(图4b)。在含10％FBS的培养基中，NIH3T3-DDEFL1细胞的生长速率在统计学意义上高于模拟细胞(NIH3T3-LacZ)(p＜0.05)(图4c)。在仅含0.1％FBS的培养基中，NIH3T3-DDEFL1细胞存活6天，而在相同条件下，对照NIH3T3细胞在6天内死亡。在该情况下，NIH3T3-DDEFL1细胞在含0.1％FBS的培养基中的生长速率在统计学意义上高于模拟细胞(图4d)(P＜0.01)。
1-5.在人细胞肝癌SNU475细胞中反义S-寡核苷酸对DDEFL1表达的抑制合成下列六对相应于DDEFL1基因的对照(正义)和反义S-寡核苷酸。反义DDEFL1-AS15’-TGCTCCGGCATGGCGG-3’(SEQ ID NO13)；DDEFL1-AS25’-GCTGAACTGCTCCGGC-3’(SEQ ID NO14)；DDEFL1-AS35’-TCCAAGATCTCCTCCC-3’(SEQ ID NO15)；DDEFL1-AS45’-TCTCCTTCCAAGATCT-3’(SEQ ID NO16)；DDEFL1-AS55’-GCGCTGAGCCGGCCTC-3’(SEQ ID NO17)；和DDEFL1-AS65’-CCTCACCTCCTCCCGC-3’(SEQ ID NO18).
对照
DDEFL1-S1 5’-CCGCCATGCCGGAGCA-3’(SEQ ID NO19)；DDEFL1-S2 5’-GCCGGAGCAGTTCAGC-3’(SEQ ID NO20)；DDEFL1-S3 5’-GGGAGGAGATCTTGGA-3’(SEQ ID NO21)；DDEFL1-S4 5’-AGATCTTGGAAGGAGA-3’(SEQ ID NO22)；DDEFL1-S5 5’-GAGGCCGGCTCAGCGC-3’(SEQ ID NO23)；和DDEFL1-S6 5’-GCGGGAGGAGGTGAGG-3’(SEQ ID NO24)。
利用LIPOFECTIN试剂(GIBCO BRL)将合成的S-寡核苷酸转染到SNU475细胞(韩国细胞系库)，在我们检测的六例肝细胞癌细胞系中，上述细胞具有最高的DDEFL1表达水平(未给出数据)。转染12和24小时后，与相应的对照S-寡核苷酸S1和S5相比，反义S-寡核苷酸AS1和AS5显著地抑制DDEFL1的表达(图5a)。转染6天后，用反义S-寡核苷酸AS1或AS5转染的存活细胞明显少于用各自的对照S-寡核苷酸S1或S5转染的细胞(图5b)。在三次独立实验均得到一致的结果。
实施例22-1.鉴定通常在人肝细胞癌中上调的VANGL1实施例1的基因组范围内cDNA微阵列分析还揭示出另一基因，它相应于UniGene簇EST(Hs.122730)的本国登录号D3244。该基因在12例临床HCC的10例中与相应的非癌肝组织对照相比明显上调。这12例肿瘤与相应非癌组织相比的相对表达率在1.5到16.0的范围(图6a)。在12例HCC的10例中均观察到上调的表达(Cy3∶Cy5强度比＞2.0)，这12例病例是可以穿过截留滤光片的病例(cy3和Cy5信号都大于25,000)。在另外10例HCC中，通过用类似于实施例1-1的半定量RT-PCR证实D3244表达的提高，所用引物对为，正向5’-GAGTTGTATTATGAAGAGGCCGA(SEQ ID NO25)；反向5’-ATGTCTCAGACTGTAAGCGAAGG(SEQ ID NO26)(图6b)。
2-2.VANGL1在成人组织中的表达按照实施例1-2的方式，以D3244 cDNA为探针进行多组织northern印迹分析，结果表明1.9-kb的转化子以组织-特异性方式在睾丸和卵巢中大量表达(图7a)。在NCBI数据库检索相应于D3244的基因组序列，发现了被分配到染色体带1p22的两个序列(Genbank登录号AL450389和AL592436)。利用GENSCAN和Gene Recognition以及Assembly Internet Link程序，预测出侯选-外显子序列并进行外显子连接。此外，按照实施例1-2的方式，用反向引物((5’-TGTCAGCTCTCCGCTTGCGGAAAAAAAG(SEQ ID NO27))进行5’RACE，以便确定转录本5’区域的序列。结果获得了1879个核苷酸的组装人cDNA序列，其包含一个1572个核苷酸的开放阅读框(Genbank登录号AB057596)。预期的氨基酸序列与斜视(Van Gogh)和VANGL2分别具有40％和63％的同一性。因此，将相应于D3244的基因称作Van Gogh样1(VANGL1)。简单模块结构研究工具提示，预期的蛋白包含公认的四个跨膜结构域(密码子111-133，148-170，182-204，219-241)(图7b)。
2-3.VANGL1的亚细胞定位将表达c-myc-标记型VANGL1蛋白的pcDNA3.1-myc/His-VANGL1质粒瞬间转染到SNU475细胞(韩国细胞系库)中。按照实施例1-3的方式进行免疫细胞化学染色。结果表明所述经标记的VANGL1蛋白存在于细胞质中(图8a和8b)。
2-4.用经设计能降低VANGL1表达的反义S-寡核苷酸抑制肝细胞癌细胞的生长为测试VANGL1的抑制是否可以导致HCC细胞的细胞周期阻滞和/或死亡，合成了下述四对反义和对照(正义)S-寡核苷酸，并将其转染到SNU475细胞中。
反义反义1 5’-GTATCCATAGCAATGG-3’(SEQ ID NO28)；反义2 5’-TGGArTGGGTATCCAT-3’(SEQ ID NO29)；反义3 5’-TAAGTGGATTGGGTAT-3’(SEQ ID NO30)；和反义4 5’-ACTCCTACCTGCCTGT-3’(SEQ ID NO31).
对照正义1 5’-CCATTGCTATGGATAC-3’(SEQ ID NO32)；正义2 5’-ATGGATACCCAATCCA-3’(SEQ ID NO33)；正义3 5’-ATACCCAATCCACTTA-3’(SEQ ID NO34)；和正义4 5’-ACAGGCAGGTAGGAGT-3’(SEQ ID NO35).
含起始密码子的反义S-寡核苷酸(反义3)在SNU475细胞中显著地降低VANGL1内源表达(图9a)。
用3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)试验评价细胞活力如下。将细胞以5×105细胞/100mm皿的浓度涂平皿。接种24小时后将细胞用经设计能抑制VANGL1的正义或反义S寡核苷酸进行一式三份地转染。转染72小时后，将所用培养基替换为含500μg/ml 3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)(Sigma)的新鲜培养基，在37℃继续培养4小时。然后加入1ml 0.01N HCl/10％SDS以便裂解细胞，并用ELISA读板仪在570nm测试波长(参考波长，630nm)测定裂解物的吸光度。用与对照细胞相比所得的相对吸光度表示所述细胞的活力。
与对照的正义S寡核苷酸正义3相比，反义S-寡核苷酸反义3的转染显著地减少存活细胞的数量(图9b和9c)。这一结果在三次独立实验中得到确认。
此外进行了如下的流式细胞术分析。将细胞以1×105细胞/100mm平皿的浓度涂皿，在给定的时间内用胰蛋白酶处理，然后用70％冷乙醇固定。经RNase处理后，将细胞用碘化丙啶(propidium iodide)(50μg/ml)的PBS溶液染色。在Becton Dickinson FACScan上进行流式细胞术分析，然后用CellQuest和ModFit软件(Verity Software House)进行分析。在至少20,000个未经选通(ungated)的细胞中，确定了核在细胞周期的G0/G1，S和G2/M期和任意的亚G1群中的百分比。
FACS分析表明，VANGL1抑制显著增加了亚G1期细胞的数目(图9d)。这些结果提示，VANGL1可以对肝细胞癌的细胞生长和/或存活起重要作用。
实施例33-1.人肝细胞癌中LGN通常增加通过实施例1-1的微阵列分析还选出另一个通常上调的基因D3636，它相应于LGN(Genbank登录号U54999)，且与相应的非癌活组织相比在12例临床HCC的10例中显著上调。这12例肿瘤相对于非癌组织的相对表达式比率在0.7到16.0的范围。在12例HCC的10例中均观察到LGN的已上调的表达(Cy3∶Cy5强度比＞2.0)，这些病例是可以穿过截留滤光片的病例(cy3和Cy5信号都大于25,000)(图10a)。在另外10例HCC中，通过用类似于实施例1-1的半定量RT-PCR证实LGN表达也存在上调，所用引物对为，正向5’-ATCTGAAGCACTTAGCAATTGC(SEQ ID NO36)，反向5’-CTGTAGCTCAGACCAAGAACC(SEQ ID NO37)(图10b)。
3-2.LGN的基因组结构
LGN的cDNA由2,336个核苷酸组成，编码677个氨基酸的肽。将该cDNA序列与基因组cDNA序列比较，表明LGN基因由14个外显子组成(图11)。
3-3.LGN的亚细胞定位用表达c-myc-标记型LGN蛋白的pcDNA3.1-myc/His-LGN质粒瞬间转染COS7细胞。按照实施例1-3的方式进行免疫印迹分析，检测到相应于myc-标记型LGN蛋白的72kDa带(图12)。类似地，按照实施例1-3进行免疫细胞化学染色，结果显示标记的LGN蛋白存在于细胞质和细胞核中。
3-4.LGN基因转移可以促进细胞生长为分析LGN对细胞生长的作用，如实施例1-4一样用表达LGN的质粒(pcDNA3.1-myc/His-LGN)转染NIH3T3，SNU423，Alexander和SNU475细胞进行集落形成试验。与对照质粒(pcDNA3.1-myc/His-LacZ)相比，pcDNA3.1-myc/His-LGN在这些细胞中产生明显更多的集落(图13a)。这一结果在三次独立实验中得到确认。
为进一步研究LGN对细胞生长的作用，建立了稳定表达外源LGN的NIH3T3细胞(NIH3T3-LGN细胞)。与对照NIH3T3 LacZ细胞相比，NIH3T3-LGN细胞显示较高的生长速率(图13b)。
3-5.LGN的反义S-寡核苷酸抑制人肝细胞癌SNU475细胞的生长合成下述五对相应于LGN的对照(正义)和反义S-寡核苷酸，然后转染到SNU423细胞中。
反义反义1 5’-CCATCGAGTCATATTA-3’(SEQ ID NO38)；反义2 5’-TTCCTCCATCGAGTCA-3’(SEQ ID NO39)；反义3 5’-AAATTTTCCTCCATCG-3’(SEQ ID NO40)；反义4 5’-AGTCTTACCTGTAACG-3’(SEQ ID NO41)；和反义5 5’-GCTTCCATTCTACAAA-3’(SEQ ID NO42).
正义正义1 5’-TAATATGACTCGATGG-3’(SEQ ID NO43)；正义2 5’-TGACTCGATGGAGGAA-3’(SEQ ID NO44)；正义3 5’-CGATGGAGGAAAATTT-3’(SEQ ID NO45)；正义4 5’-CGTTACAGGTAAGACT-3’(SEQ ID NO46)；和正义5 5’-TTTGTAGAATGGAAGC-3’(SEQ ID NO47).
转染12小时后，与对照S寡核苷酸(正义3)相比，跨起始密码子的反义S-寡核苷酸(反义3)显著地抑制LGN的表达(图14a)。转染6天后，经反义3转染的存活细胞的数目显著地少于经对照正义3转染的存活细胞的数目(图14b)。在三次独立实验中均得到一致的结果。
工业实用性本发明提供DDEFL1，VANGL1或LGN的cDNA核苷酸序列和多肽氨基酸序列，已发现这些基因在肝细胞癌中通常上调。因此这些多肽可以作为标记用于确定是否存在肝癌。这些核苷酸序列信息使得能设计探针和引物来检测或扩增DDEFL1，VANGL1或LGN基因。还使得能合成抑制DDEFL1，VANGL1或LGN多肽表达的反义核苷酸序列。氨基酸序列信息使得能制备与DDEFL1，VANGL1或LGN多肽结合的抗体。所述探针引物以及抗体可用作检测肝细胞癌的试剂。此外，本发明人证实，用反义寡核苷酸抑制DDEFL1，VANGL1或LGN的表达，能显著地降低HCC细胞的生长。由此，所述反义寡核苷酸可用于抑制HCC细胞的生长。本发明还有助于进一步阐明肝细胞的致癌作用机制，并发现可用于开发肝癌治疗的有效药物的分子靶。
序列表<110>东京大学总长代表日本国(JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THEUNIVERSITY OF TOKYO ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)<120>肝细胞癌-相关基因和多肽，以及检测肝细胞癌的方法<130>SEN-A0121P<140>
<141>
<150>US 60/324,261<151>2001-09-25<150>CA<151>2002-08-23<160>47<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4050<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gtgccccccg cgctccgctc cggcagctcc acgctcgcgc ccgccatgcc ggagcagttc60agcgtcgccg agttcctggc cgtcaccgcg gaggacctca gctccccggc tggggccgcc120gccttcgccg ccaagatgcc ccggtaccga ggggcggcgc tggcgcggga ggagatcttg180gaaggagacc aagccatcct gcagagaata aagaaggctg tgcgggcaat ccatagctcc240ggccttggcc atgtggagaa tgaagagcag taccgagagg ccgtggaatc cttaggcaac300agccacctgt cccagaacag ccatgagctg tccacaggct tcctaaactt ggccgtgttc360acccgcgagg ttgctgcgct cttcaagaac ctgattcaga acttgaacaa cattgtctct420ttccccctgg acagtctgat gaaggggcag ctgagggacg gtcgacagga ttccaaaaaa480cagctggaga aggcatggaa ggactatgaa gccaaaatgg ccaagctgga gaaggagcgc540
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Leu Asp Ser Arg Asp Arg Asn Tyr Gln Gly Ile Val Gln Tyr Ala Val210 215 220Ser Leu Val Asp Ala Leu Leu Phe Ile His Tyr Leu Ala Ile Val Leu225 230 235 240Leu Glu Leu Arg Gln Leu Gln Pro Met Phe Thr Leu Gln Val Val Arg245 250 255Ser Thr Asp Gly Glu Ser Arg Phe Tyr Ser Leu Gly His Leu Ser Ile260 265 270Gln Arg Ala Ala Leu Val Val Leu Glu Asn Tyr Tyr Lys Asp Phe Thr275 280 285Ile Tyr Asn Pro Asn Leu Leu Thr Ala Ser Lys Phe Arg Ala Ala Lys290 295300His Met Ala Gly Leu Lys Val Tyr Asn Val Asp Gly Pro Ser Asn Asn305 310 315 320Ala Thr Gly Gln Ser Arg Ala Met Ile Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg325 330 335Asp Ser Ser His Asn Glu Leu Tyr Tyr Glu Glu Ala Glu His Glu Arg340 345 350Arg Val Lys Lys Arg Lys Ala Arg Leu Val Val Ala Val Glu Glu Ala355 360 365Phe Ile His Ile Gln Arg Leu Gln Ala Glu Glu Gln Gln Lys Ala Pro370 375 380Gly Glu Val Met Asp Pro Arg Glu Ala Ala Gln Ala Ile Phe Pro Ser385 390 395 400Met Ala Arg Ala Leu Gln Lys Tyr Leu Arg Ile Thr Arg Gln Gln Asn405 410 415Tyr His Ser Met Glu Ser Ile Leu Gln His Leu Ala Phe Cys Ile Thr420 425 430Asn Gly Met Thr Pro Lys Ala Phe Leu Glu Arg Tyr Leu Ser Ala Gly435 440 445
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actttttcag ccttatttta cggtcccagg gaaagagaat ggatgaacag agagttcttt2100tacaaagaga tcaaaacaga gacactgact ttgggctaaa ggactttttg caaaataatg2160ctttgttgga gtttaaaaat tcagggaaaa aatcggcaga ccattagtta ctatggattt2220attttttttc ctttcaaaca cggtaaggaa acaatctatt acttttttcc ttaaaaggag2280aatttatagc actgtaatac agcttaaaat atttttagaa tgatgtaaat agttaa2336<210>6<211>677<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Met Arg Glu Asp His Ser Phe His Val Arg Tyr Arg Met Glu Ala Ser1 5 10 15Cys Leu Glu Leu Ala Leu Glu Gly Glu Arg Leu Cys Lys Ser Gly Asp20 25 30Cys Arg Ala Gly Val Ser Phe Phe Glu Ala Ala Val Gln Val Gly Thr35 40 45Glu Asp Leu Lys Thr Leu Ser Ala Ile Tyr Ser Gln Leu Gly Asn Ala50 55 60Tyr Phe Tyr Leu His Asp Tyr Ala Lys Ala Leu Glu Tyr His His His65 70 75 80Asp Leu Thr Leu Ala Arg Thr Ile Gly Asp Gln Leu Gly Glu Ala Lys85 90 95Ala Ser Gly Asn Leu Gly Asn Thr Leu Lys Val Leu Gly Asn Phe Asp100 105 110Glu Ala Ile Val Cys Cys Gln Arg His Leu Asp Ile Ser Arg Glu Leu115 120 125Asn Asp Lys Val Gly Glu Ala Arg Ala Leu Tyr Asn Leu Gly Asn Val130 135 140Tyr His Ala Lys Gly Lys Ser Phe Gly Cys Pro Gly Pro Gln Asp Val
145 150 155 l60Gly Glu Phe Pro Glu Glu Val Arg Asp Ala Leu Gln Ala Ala Val Asp165 170 175Phe Tyr Glu Glu Asn Leu Ser Leu Val Thr Ala Leu Gly Asp Arg Ala180 185 190Ala Gln Gly Arg Ala Phe Gly Asn Leu Gly Asn Thr His Tyr Leu Leu195 200 205Gly Asn Phe Arg Asp Ala Val Ile Ala His Glu Gln Arg Leu Leu Ile210 215 220Ala Lys Glu Phe Gly Asp Lys Ala Ala Glu Arg Arg Ala Tyr Ser Asn225 230 235 240Leu Gly Asn Ala Tyr Ile Phe Leu Gly Glu Phe Glu Thr Ala Ser Glu245250 255Tyr Tyr Lys Lys Thr Leu Leu Leu Ala Arg Gln Leu Lys Asp Arg Ala260 265 270Val Glu Ala Gln Ser Cys Tyr Ser Leu Gly Asn Thr Tyr Thr Leu Leu275 280 285Gln Asp Tyr Glu Lys Ala Ile Asp Tyr His Leu Lys His Leu Ala Ile290 295 300Ala Gln Glu Leu Asn Asp Arg Ile Gly Glu Gly Arg Ala Cys Trp Ser305 310 315 320Leu Gly Asn Ala Tyr Thr Ala Leu Gly Asn His Asp Gln Ala Met His325 330 335Phe Ala Glu Lys His Leu Glu Ile Ser Arg Glu Val Gly Asp Lys Ser340 345 350Gly Glu Leu Thr Ala Arg Leu Asn Leu Ser Asp Leu Gln Met Val Leu355 360 365Gly Leu Ser Tyr Ser Thr Asn Asn Ser Ile Met Ser Glu Asn Thr Glu370 375 380Ile Asp Ser Ser Leu Asn Gly Val Leu Pro Lys Leu Gly Arg Arg His385 390 395400
Ser Met Glu Asn Met Glu Leu Met Lys Leu Thr Pro Glu Lys Val Gln405 410 415Asn Trp Asn Ser Glu Ile Leu Ala Lys Gln Lys Pro Leu Ile Ala Lys420 425 430Pro Ser Ala Lys Leu Leu Phe Val Asn Arg Leu Lys Gly Lys Lys Tyr435 440 445Lys Thr Asn Ser Ser Thr Lys Val Leu Gln Asp Ala Ser Asn Ser Ile450 455 460Asp His Arg Ile Pro Asn Ser Gln Arg Lys Ile Ser Ala Asp Thr Ile465 470 475 480Gly Asp Glu Gly Phe Phe Asp Leu Leu Ser Arg Phe Gln Ser Asn Arg485 490 495Met Asp Asp Gln Arg Cys Cys Leu Gln Glu Lys Asn Cys His Thr Ala500 505 510Ser Thr Thr Thr Ser Ser Thr Pro Pro Lys Met Met Leu Lys Thr Ser515 520 525Ser Val Pro Val Val Ser Pro Asn Thr Asp Glu Phe Leu Asp Leu Leu530 535 540Ala Ser Ser Gln Ser Arg Arg Leu Asp Asp Gln Arg Ala Ser Phe Ser545 550 555 560Asn Leu Pro Gly Leu Arg Leu Thr Gln Asn Ser Gln Ser Val Leu Ser565 570 575His Leu Met Thr Asn Asp Asn Lys Glu Ala Asp Glu Asp Phe Phe Asp580 585 590Ile Leu Val Lys Cys Gln Gly Ser Arg Leu Asp Asp Gln Arg Cys Ala595 600 605Pro Pro Pro Ala Thr Thr Lys Gly Pro Thr Val Pro Asp Glu Asp Phe610 615 620Phe Ser Leu Ile Leu Arg Ser Gln Gly Lys Arg Met Asp Glu Gln Arg625 630 635 640
Val Leu Leu Gln Arg Asp Gln Asn Arg Asp Thr Asp Phe Gly Leu Lys645 650 655Asp Phe Leu Gln Asn Asn Ala Leu Leu Glu Phe Lys Asn Ser Gly Lys660 665 670Lys Ser Ala Asp His675<210>7<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>7acaacagcct caagatcatc ag 22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>8ggtccaccac tgacacgttg 20<210>9<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>9agctgagaca tttgttctct tg 22
<210>10<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>10tataaaccag ctgagtccag ag 22<210>11<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>11ctcacttggc acgtcagcag gg 22<210>12<211>10<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>12cccgccatgc10<210>13<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>13tgctccggca tggcgg 16<210>14
<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>14gctgaactgc tccggc 16<210>15<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>15tccaagatct cctccc 16<210>16<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>16tctccttcca agatct 16<210>17<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>17gcgctgagcc ggcctc 16
<210>18<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>18cctcacctcc tcccgc 16<210>19<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>19ccgccatgcc ggagca 16<210>20<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>20gccggagcag ttcagc 16<210>21<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>21
gggaggagat cttgga 16<210>22<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>22agatcttgga aggaga 16<210>23<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>23gaggccggct cagcgc 16<210>24<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>24gcgggaggag gtgagg 16<210>25<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列
<400>25gagttgtatt atgaagaggc cga 23<210>26<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>26atgtctcaga ctgtaagcga agg 23<210>27<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>27tgtcagctct ccgcttgcgg aaaaaaag28<210>28<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>28gtatccatag caatgg 16<210>29<211>16<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>29tggattgggt atccat 16<210>30<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>30taagtggatt gggtat 16<210>31<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>31actcctacct gcctgt 16<210>32<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>32ceattgctat ggatac 16<210>33<211>16
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>33atggataccc aatcca 16<210>34<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>34atacccaatc cactta 16<210>35<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>35acaggcaggt aggagt 16<210>36<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>36atctgaagca cttagcaatt gc 22
<210>37<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>37ctgtagctca gaccaagaac c 21<210>38<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>38ccatcgagtc atatta 16<210>39<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>39ttcctccatc gagtca 16<210>40<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>40aaattttcct ccatcg 16
<210>41<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>41agtcttacct gtaacg 16<210>42<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>42gcttceattc tacaaa 16<210>43<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>43taatatgact cgatgg 16<210>44<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列
<400>44tgactcgatg gaggaa 16<210>45<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>45cgatggagga aaattt 16<210>46<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>46cgttacaggt aagact 16<210>47<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的寡核苷酸序列<400>47tttgtagaat ggaagc 1权利要求
1.选自下述的经分离的核酸(a)包含SEQ ID NO1或NO3所示核苷酸序列的核酸；(b)编码包含SEQ ID NO2或NO4所示氨基酸序列的多肽的核酸；(c)包含在严紧条件下可与由SEQ ID NO1或NO3组成的核苷酸序列或其互补链杂交的链的核酸。
2.选自下述的经分离的多肽(a)由SEQ ID NO1或NO3所示核苷酸序列编码的多肽(b)包含SEQ ID NO2或NO4所示氨基酸序列的多肽；(c)与SEQ ID NO2或NO4具有至少65％同一性的多肽。
3.带有权利要求1所述核酸的载体。
4.带有权利要求1所述核酸或权利要求3所述载体的转化子。
5.生产多肽的方法，该方法包括在培养物中培养权利要求4的转化子，在所述转化子中表达所述多肽，和从培养物中回收所述多肽。
6.可与权利要求2所述多肽特异结合的抗体。
7.检测肝细胞癌的方法，该方法包括下述步骤(a)制备来自受试者的生物样品；(b)测定至少一种选自下组的多肽的表达水平，所述多肽是SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO5所示的多肽；(c)将上述表达水平与在非癌症样品中的测定值相比较；和(d)确定受试者是否患癌症。
8.一种检测肝细胞癌的试剂，其包含一种核酸，该核酸含有在严紧条件下可与由SEQ ID NO1，NO3或NO5组成的核苷酸序列或其互补链杂交的链。
9.检测肝细胞癌的试剂，其包含权利要求6所述抗体。
10.抑制肝细胞癌生长的方法，该方法包括向肝细胞癌中引入至少一种可与SEQ ID NO1，NO3或NO5杂交的反义寡核苷酸。
全文摘要
本发明提供在肝细胞癌中上调的基因，和由这些基因所编码的多肽。还提供载体，转化子和生产所述重组多肽的方法。还提供这些基因的探针和引物以及针对所述多肽的抗体。所述探针，引物和抗体可用作检测肝细胞癌的试剂。还提供利用所述试剂检测肝细胞癌的方法。还提供这些基因的反义核苷酸序列，其可用于抑制肝细胞癌的生长。
文档编号A61K31/7088GK1592793SQ0282331
公开日2005年3月9日 申请日期2002年9月25日 优先权日2001年9月25日
发明者中村佑辅, 古川洋一 申请人:东京大学总长代表日本国, 肿瘤疗法科学股份有限公司