专利名称：非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因治疗领域，特别是指一种辅助乳腺癌诊断、治疗方案制定及估计预后的相关基因--非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法及其用途。
背景技术：
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，近年来，国内外乳腺癌发病呈上升趋势。目前，对于乳腺癌还没有较好的诊断方法。肿瘤标志物在乳腺癌的早期诊断、治疗方案选择、病情复发和转移监测、疗效评价和预后估价以及群体随访观察和普查等方面有重要意义。一种新的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk(Spleentyrosine kinase)，是B细胞激活信号转导过程中最重要的激酶，也是促进乳腺上皮生长的强力因子，已证明，在乳腺癌发生过程中，CpG岛超甲基化作用可导致许多癌症相关基因失活。CpG岛超甲基化作用是一种在突变、缺失、异位等序列变异之外的非序列性变化。很多肿瘤的发生都涉及基因组的甲基化改变，包括抑癌基因的超甲基化和原癌基因的去甲基化。在乳腺癌逐渐发生的过程中，Syk基因频繁的失活。因为Syk可作为肿瘤抑制因子，它在乳腺癌中表达缺失与肿瘤的侵袭性有关。异常的Syk基因甲基化可导致其蛋白表达缺失，从而导致肿瘤侵袭性生长。Syk在正常的乳腺腺体和上皮组织及非侵袭性乳腺癌细胞株中很容易检测到Syk的表达，而在侵袭性乳腺癌细胞株中则表达降低或缺失，是乳腺癌细胞生长和转移的重要抑制因子。因此，可将Syk的多克隆抗体应用于乳腺癌的检测。
发明内容
本发明的内容在于提供一种非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法及其用途用于辅助乳腺癌诊断、治疗方案制定及估计预后。
本发明的整体技术构思是非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，包括以下工艺步骤A、细胞株及细胞培养Sf21细胞株应用Grace′s培养基进行培养，将细胞调整到1×109/L的密度，用培养瓶于恒温摇床(80-100转/分、26-28℃进行培养)经胎盼蓝染色检测活细胞百分率应为95％-100％；B、应用Bac-to-Bac方法进行制备重组Syk基因的杆状病毒；
C、纯化baconid Syk DNA应用脂质体介导技术，将转染Syk基因的Sf21细胞于28℃培养4-6天，用cellfectin试剂(Gibco-BRL)进行选择培养，收集细胞制备Syk DNA；应用噬菌体纯化法纯化病毒颗粒，经培养一些孔形成噬菌斑，将这些阳性培养孔细胞经SDS-PAGE检测Mr为72×103蛋白条带的存在；D、Sf21细胞的大量制备于培养瓶中加入1L呈对数生长期的Sf21细胞悬液[(1.0-1.2)×106/mL]，加入病毒贮存液(≈2.5×108pfu/mL)，于恒温摇床(80-100转/分、28℃)培养48小时进行病毒感染(病毒感染率约为6)和细胞增殖；E、Syk的分离、纯化收集细胞悬液进行低速离心，将细胞沉淀物(2.5×109)与细胞裂解液共同培养30分钟，于冰浴中用超声波破碎仪振荡裂解3次，每次30秒，将细胞裂解液于4℃超速离心，收集上清液并过滤，将滤液加入活化的Yellow-3层析柱(2.5×10cm，Sigma)，用两倍体积的缓冲液和1倍体积的含有200mmol/L NaCl的缓冲液冲洗层析柱。Syk蛋白用3.5倍体积的含200mmol/L-1mol/L NaCl的缓冲液洗脱。
非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的用途是非受体型酪氨酸蛋白激酶(Spleentyrosine kinase)Syk制备兔抗Syk抗体。具体用法是将Syk蛋白(0.25g/L)0.4mL与福氏完全佐剂0.5mL混匀后，注射于小兔腹股沟和后脚掌；15小时后，将同样量的Syk蛋白与福氏不完全佐剂0.5mL混匀后，进行第二次免疫兔，注射部位为小兔腹股沟和后脚掌；30小时后进行加强免疫，取Syk蛋白(0.5g/L)0.2mL用0.6mL生理盐水稀释后，于背部皮下多点注射，45小时后再耳静脉注射加强免疫1次，剂量同加强免疫；于初次免疫2星期后，开始采静脉血，用ELISA法(以0.05mol/L pH9.5 CRS稀释的Syk蛋白包被)检测兔抗Syk抗体的效价；基础免疫后于第2、3、5、6wk分别采取静脉血，用间接ELISA法检测抗Syk血清的效价；于第2次加强免疫后第4天，颈动脉放血、分离血清。
本发明中各相关步骤的工艺条件是A步骤中Sf21细胞株来源于黏虫卵巢组织(Spodoptera frugiperda，由美国Inritrogen提供)。
E步骤中低速离心的转速为500g，离心时间7min。细胞裂解液为由20mmol/L磷酸钠pH7.4，1mmoL/L EDTA，1mmol/L EGTA，1mmol/L DTT，1mL/LTriton-100，200μg/mL抑蛋白酶肽，50μg/mL亮抑蛋白酶肽，10mmol/L焦亚硫酸钠组成的混合溶液。超速离心的转速100000g，离心时间为60分钟。两倍体积的缓冲液为由20mmol/L Na-Pi，pH7.4，1mmol/L EDTA，1mmol/LEGTA，1mmol/L DTT组成的混合溶液。
本发明所具有的实质性特点和取得的显著技术进步是本发明所采用的制备方法整体设计合理，所制备的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk采用免疫组化方法检测乳腺组织中Syk的蛋白表达情况；采用RT-PCR的方法检测乳腺组织中Syk基因表达情况；其在乳腺癌发生中的作用机理研究采用MSP方法检测乳腺组织中Syk基因的甲基化情况。对其在乳腺癌发生、发展中的作用机理进行了研究，明确了Syk是促进乳腺上皮生长的强力因子，在正常的乳腺腺体和上皮组织及非侵袭性乳腺癌细胞株中很容易检测到Syk的表达，而在侵袭性乳腺癌细胞株中则表达降低或缺失，是乳腺癌细胞生长和转移的重要抑制因子。很多肿瘤的发生都涉及基因组的甲基化改变，包括抑癌基因的超甲基化和原癌基因的去甲基化。在乳腺癌逐渐发生过程中，Syk基因由于CpG岛超甲基化作用而频繁的失活。因为Syk可作为肿瘤抑制因子，它在乳腺癌中表达缺失与肿瘤的侵袭性有关。异常的Syk基因甲基化可导致其蛋白表达缺失，从而导致肿瘤侵袭性生长。
本发明的附图有图1是Yellow-3柱层析纯化Syk结果示意图。
图2是SDS-PAGE分离结果显示示意图。
图3是免疫印迹结果显示示意图。
图4是Syk层析成分进一步用Toyopearl AF-Heptin-650M层析柱分离的结果示意图。
图5是Syk另一层析成分进一步用Toyopearl AF-Heptin-650M层析柱分离的结果示意图。
图6是Syk蛋白的等电聚焦分析(IEF)结果示意图。
图7是Syk在不同乳腺组织中表达的免疫组化检测将正常乳腺组织和乳腺癌组织切片进行免疫组化染色，正常乳腺组织细胞胞浆中可见棕黄色颗粒。
图8是Syk在不同乳腺组织中表达的免疫组化检测将正常乳腺组织和乳腺癌组织切片进行免疫组化染色，在原位癌细胞胞浆中颗粒颜色变浅。
图9是Syk在不同乳腺组织中表达的免疫组化检测将正常乳腺组织和乳腺癌组织切片进行免疫组化染色，在浸润性乳腺导管癌组织的细胞浆中不着色。
图10是不同Syk样品经SDS-PAGE分离结果示意图。
图11是不同Syk样品经CBB染色和抗Syk抗体免疫印迹结果示意图。
由图1可知将从Sf21细胞提取的蛋白质，用Yellow-3层析柱分离得到两个Syk层析成分，(图1黑色区域，表示23-33和34-41两个层析成分的峰值)，析出两个Syk的盐浓度梯度(虚线)分别在420-500mmol/L和550-650mmol/L NaCl之间。
图2中SDS-PAGE分离结果显示，23-33和34-41两个层析成分均含有单一的蛋白条带，Mr为72×103。
图3免疫印迹结果显示两种蛋白质均为Syk。
由图4可知经Yellow-3凝胶层析分离的23-33层析成分进一步用Toyopearl AF-Heptin-650M层析柱分离，得到了单一的蛋白质峰。
图5同样，34-41层析成分经Toyopearl AF-Heptin-650M层析柱分离，得到了单一的蛋白质峰。
由图6可知经Toyopearl AF-Heptin-650M纯化的用两个Syk成分免疫印迹分析虽显示相同结果，但经IEF分析，这两个Syk具有不同的pI值。
由图10、11可知经SDS-PAGE分离，CBB染色结果显示，细胞裂解产物出现多条蛋白条带(图10泳道1)。细胞裂解产物经100000g离心后的上清液也出现多条蛋白条带(图10泳道2)。但经Yellow-3凝胶层析(泳道A3)，并进一步用Toyopearl AF-Heptin-650M层析纯化后，显示单一的Syk特异性蛋白条带(泳道A4)。免疫印迹结果显示，Mr72×103的蛋白质为Syk(图11)。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施例做进一步描述非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，包括以下工艺步骤A、细胞株及细胞培养Sf21细胞株(来源于黏虫卵巢组织(Spodopterafrugiperda，由美国Inritrogen提供)。应用Grace′s培养基进行培养，将细胞调整到1×109/L的密度，用培养瓶于恒温摇床(80-100转/分、26-28℃进行培养)经胎盼蓝染色检测活细胞百分率应为95％-100％。
B、应用Bac-to-Bac方法进行制备重组Syk基因的杆状病毒。
C、纯化baconid Syk DNA应用脂质体介导技术，将转染Syk基因的Sf21细胞于28℃培养4-6天，用cellfectin试剂(Gibco-BRL)进行选择培养，收集细胞制备Syk DNA；应用噬菌体纯化法纯化病毒颗粒，经培养一些孔形成噬菌斑，将这些阳性培养孔细胞经SDS-PAGE检测Mr为72×103蛋白条带的存在。
D、Sf21细胞的大量制备于培养瓶中加入1L呈对数生长期的Sf21细胞悬液[(1.0-1.2)×106/mL]，加入病毒贮存液(≈2.5×108pfu/mL)，于恒温摇床(80-100转/分、28℃)培养48小时进行病毒感染(病毒感染率约为6)和细胞增殖。
E、Syk的分离、纯化收集细胞悬液进行低速离心(500g，7min)，将细胞沉淀物(2.5×109)与细胞裂解液(20mmol/L磷酸钠pH7.4，1mmoL/L EDTA，1mmol/L EGTA，1mmol/L DTT，1mL/L Triton-100，200μg/mL抑蛋白酶肽，50μg/mL亮抑蛋白酶肽，10mmol/L焦亚硫酸钠)共同培养30分钟，于冰浴中用超声波破碎仪振荡裂解3次，每次30秒，将细胞裂解液于4℃超速离心(100000g，60分钟)，收集上清液并过滤，将滤液加入活化的Yellow-3层析柱(2.5×10cm，Sigma)，用两倍体积的缓冲液和1倍体积的含有200mmol/L NaCl的缓冲液(20mmol/L Na-Pi，pH7.4，1mmol/L EDTA，1mmol/LEGTA，1mmol/L DTT)冲洗层析柱。Syk蛋白用3.5倍体积的含200mmol/L-1mol/L NaCl的缓冲液洗脱。
非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的用途是非受体型酪氨酸蛋白激酶(Spleentyrosine kinase)Syk制备兔抗Syk抗体。具体用法是将Syk蛋白(0.25g/L)0.4mL与福氏完全佐剂0.5mL混匀后，注射于小兔腹股沟和后脚掌；15小时后，将同样量的Syk蛋白与福氏不完全佐剂0.5mL混匀后，进行第二次免疫兔，注射部位为小兔腹股沟和后脚掌；30小时后进行加强免疫，取Syk蛋白(0.5g/L)0.2mL用0.6mL生理盐水稀释后，于背部皮下多点注射，45小时后再耳静脉注射加强免疫1次，剂量同加强免疫；于初次免疫2星期后，开始采静脉血，用ELISA法(以0.05mol/L pH9.5 CRS稀释的Syk蛋白包被)检测兔抗Syk抗体的效价；基础免疫后于第2、3、5、6wk分别采取静脉血，用间接ELISA法检测抗Syk血清的效价；于第2次加强免疫后第4天，颈动脉放血、分离血清。
权利要求
1.非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，其特征在于它包括以下工艺步骤A、细胞株及细胞培养Sf21细胞株应用Grace′s培养基进行培养，将细胞调整到1×109/L的密度，用培养瓶于恒温摇床(80-100转/分、26-28℃进行培养)经胎盼蓝染色检测活细胞百分率应为95％-100％；B、应用Bac-to-Bac方法进行制备重组Syk基因的杆状病毒；C、纯化baconid Syk DNA应用脂质体介导技术，将转染Syk基因的Sf21细胞于28℃培养4-6天，用cellfectin试剂(Gibco-BRL)进行选择培养，收集细胞制备Syk DNA；应用噬菌体纯化法纯化病毒颗粒，经培养一些孔形成噬菌斑，将这些阳性培养孔细胞经SDS-PAGE检测Mr为72×103蛋白条带的存在；D、Sf21细胞的大量制备于培养瓶中加入1L呈对数生长期的Sf21细胞悬液[(1.0-1.2)×106/mL]，加入病毒贮存液(≈2.5×108pfu/mL)，于恒温摇床(80-100转/分、28℃)培养48小时进行病毒感染(病毒感染率约为6)和细胞增殖；E、Syk的分离、纯化收集细胞悬液进行低速离心，将细胞沉淀物(2.5×109)与细胞裂解液共同培养30分钟，于冰浴中用超声波破碎仪振荡裂解3次，每次30秒，将细胞裂解液于4℃超速离心，收集上清液并过滤，将滤液加入活化的Yellow-3层析柱(2.5×10cm，Sigma)，用两倍体积的缓冲液和1倍体积的含有200mmol/L NaCl的缓冲液冲洗层析柱。Syk蛋白用3.5倍体积的含200mmol/L-1 mol/L NaCl的缓冲液洗脱。
2.根据权利要求1所述的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，其特征在于所述的A步骤中Sf21细胞株来源于黏虫卵巢组织(Spodopterafrugiperda，由美国Inritrogen提供)。
3.根据权利要求1所述的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，其特征在于所述的E步骤中低速离心的转速为500g，时间为7min。
4.根据权利要求1所述的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，其特征在于所述的E步骤中细胞裂解液为由20mmol/L磷酸钠pH7.4，1mmoL/LEDTA，1mmol/L EGTA，1mmol/L DTT，1mL/L Triton-100，200μg/Ml抑蛋白酶肽，50μg/mL亮抑蛋白酶肽，10mmol/L焦亚硫酸钠组成的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，其特征在于所述的E步骤中超速离心的转速100000g，离心时间为60分钟。
6.根据权利要求1所述的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，其特征在于所述的E步骤中两倍体积的缓冲液为由20mmol/L Na-Pi，pH7.4，1mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA，1mmol/L DTT组成的混合溶液。
7.根据权利要求1所述的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的用途，其特征在于利用非受体型酪氨酸蛋白激酶(Spleen tyrosine kinase)Syk制备兔抗Syk抗体。
8.根据权利要求7所述的非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的用途，其特征在于所述的将Syk蛋白(0.25g/L)0.4mL与福氏完全佐剂0.5mL混匀后，注射于小兔腹股沟和后脚掌；15小时后，将同样量的Syk蛋白与福氏不完全佐剂0.5mL混匀后，进行第二次免疫兔，注射部位为小兔腹股沟和后脚掌；30小时后进行加强免疫，取Syk蛋白(0.5g/L)0.2mL用0.6mL生理盐水稀释后，于背部皮下多点注射，45小时后再耳静脉注射加强免疫1次，剂量同加强免疫；于初次免疫2星期后，开始采静脉血，用ELISA法(以0.05mol/LpH9.5 CRS稀释的Syk蛋白包被)检测兔抗Syk抗体的效价；基础免疫后于第2、3、5、6wk分别采取静脉血，用间接ELISA法检测抗Syk血清的效价；于第2次加强免疫后第4天，颈动脉放血、分离血清。
全文摘要
本发明属于基因治疗领域，特别是指一种辅助乳腺癌诊断、治疗方案制定及估计预后的相关基因——非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法及其用途。主要包括细胞株及细胞培养、应用Bac－to－Bac方法进行制备重组Syk基因的杆状病毒、纯化baconid Syk DNA、Sf21细胞的大量制备、Syk的分离、纯化等工艺步骤。利用非受体型酪氨酸蛋白激酶(Spleen tyrosine kinase)Syk制备兔抗Syk抗体。本发明解决了乳腺癌的早期诊断、治疗方案选择、病情复发和转移监测、疗效评价和预后估价以及群体随访观察和普查等方面的问题，具有工艺设计合理，可辅助乳腺癌诊断、治疗方案制定及估计预后等优点。
文档编号A61K38/45GK1557951SQ20041000517
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月11日 优先权日2004年2月11日
发明者马洪, 单保恩, 马 洪 申请人:单保恩