专利名称：封闭丙型肝炎病毒包膜蛋白e2与人cd81结合位点的小肽序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种能与丙型肝炎病毒包膜蛋白E2(HCV E2)结合、并能封闭HCV E2与人CD81结合位点的小肽序列，及其筛选方法与用途。
背景技术：
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是血源传播肝炎的主要病原因子之一，对人类健康的危害极大，目前全球HCV感染者约1.7亿，在我国人群的感染率约2-3％，70-80％感染者可发展为慢性肝炎、肝硬化，少数患者可发展为肝癌。目前首选的治疗方法是联合应用α干扰素和利巴韦林，但仅在约30％患者有较好反应，且长期治疗会产生明显的抗药性。因此，迫切需要开发研制新的有效的药物以控制HCV的传播和感染。
HCV基因组全长约9.5Kb，有一开放阅读框架，翻译成一个多聚蛋白前体，在宿主和病毒自身蛋白酶的加工下产生结构蛋白(C，E1和E2)和非结构蛋白(NS3，NS4和NS5等)。试验证实HCV包膜糖蛋白E2在HCV感染宿主细胞中起重要作用。现研究表明，HCV E2能与人细胞表面CD81分子(hCD81)特异性结合，两者相互作用可能是引起HCV感染的起始环节，因此寻找能够与hCD81结合或能与HCV E2结合的小肽以阻断HCV E2-hCD81两者的相互作用，是HCV防治的一项新策略。
噬菌体展示肽库技术的发展为筛选具有潜在药用作用的小肽提供了行之有效的方法。例如，国外学者已从噬菌体肽库中筛选到能与艾滋病毒(HIV)外膜蛋白gp120结合并阻断病毒侵入宿主细胞的小肽[Ferrer M & Harrison SC.(1999)Journal of Virology]。在HCV研究领域，本发明人以表达hCD81的细胞为筛选配基，应用噬菌体随机展示肽库，首次筛选出能与hCD81分子特异性结合，并能阻断HCV E2与hCD81相互作用的HCV E2模拟小肽[Jie Cao，Zhong Tian QI，et al.(2003)Cell Research]。同年，国外学者应用抗HCV E2单克隆抗体，鉴定出两个HCV E2结构域可与hCD81分子结合[Roccasecca R et al.(2003)Journal of Virology]，这些结果为开发研制HCV受体拮抗剂奠定了基础。然而，hCD81分子除介导HCV侵入宿主细胞外，还涉及细胞的粘附、形态、增殖、活化及分化等多种生物学功能，因此筛选能与HCVE2结合阻断病毒侵入宿主细胞的小肽则更具有药物开发价值。
迄今为止，国内该方面研究尚未见报道，国外仅见2篇相关文献，其小肽筛选与获得均通过蛋白构象分析和模拟加以确定，其中1条小肽序列为PSGSNIISNLFKED，并证实具有阻断HCV E2与细胞表达的hCD81结合能力[Dhanasekaran et al.(2003)J Pept Res]，另一篇文献报道未公开有阻断作用的小肽序列[VanCompernolle SE et al.(2003)Virology]，这些研究表明，筛选阻断HCV E2与hCD81结合的小肽不仅有意义，而且具有实际应用价值。本发明采用噬菌体随机展示肽库进行小肽筛选，所用方法与国外文献报道不同。噬菌体随机展示肽库筛选可将外源多肽的基因型、构象与生物学研究有机的结合，它作为一种有效的生物筛选体系，能更实际的反映筛选配基与配体间相互作用关系，本发明筛选获得的是一个新的小肽序列。
发明内容
本发明的目的是筛选出能与HCV E2结合并阻断hCD81与HCVE2结合位点的小肽序列。本发明的另一目的是提供上述筛选方法与用途。
本发明提供一种能与丙型肝炎病毒包膜蛋白E2(HCV E2)结合、并能封闭HCV E2与hCD81结合位点的小肽序列，它是由9个氨基酸组成，其序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO2Ala Thr Trp Val Cys Gly Pro Ser/Cys Thr1 5本发明提供上述小肽序列的筛选方法(1)以具有阻断HCV E2与hCD81特异性结合能力的抗hCD81单克隆抗体JS-81为筛选配基，通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的生物淘洗方法，对噬菌体随机展示9肽库(PVIII9aa)进行3轮筛选；(2)测定每轮筛选的噬菌体产出/投入比，3轮筛选后洗脱的噬菌体数与第1轮相比提高约2个数量级，观察到明显富集效果；(3)随机挑取第3轮筛选后的30株噬菌体克隆进行鉴定，经酶联免疫吸附检测(ELISA)，30株噬菌体克隆中有10株可与抗hCD81 JS-81特异性结合；(4)以HCV E2作为竞争抑制剂，通过竞争ELASA试验证实HCV E2可抑制C5和C9号噬菌体与抗hCD81 JS-81的结合，抑制率分别为18.6％和67.5％，表明这2株阳性噬菌体具有与HCV E2结合的能力；(5)测定2株阳性噬菌体克隆DNA序列，推导所含外源9肽序列，确定共同氨基酸序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
本发明还提供了上述小肽序列在制备抗HCV感染药物方面的用途。经噬菌体随机9肽库筛选及竞争ELASA试验验证，表明该发明小肽具有与HCV E2结合、并封闭HCV E2与hCD81 JS-81结合位点的作用，可作为制备抗HCV感染多肽药物的先导化合物，具有药物开发价值。
图1噬菌体ELISA检测结果图2噬菌体竞争抑制结合试验结果
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述实施例1噬菌体随机肽库筛选抗hCD81单克隆抗体JS-81获得能封闭HCV E2与hCD81结合位点的小肽序列(1)TGl饥饿菌的制备挑取单菌落TG1接种于2ml LB培养液中，37℃摇菌过夜，取250μl接种至25ml LB培养液中，37℃摇菌2.5h，慢摇10min，3000rpm离心10min，弃上清，取1ml NAP缓冲液[80mM NaCl，50mM NH4H2PO4，pH7.0]重悬沉淀物，置4℃保存。
(2)噬菌体随机9肽库(PVIII9aa)筛选用0.1mol/L NaHCO3包被15μg抗hCD81 JS-81至7mm聚苯乙烯培养板，4℃放置过夜。弃包被液，加180μl封闭液[5mg/ml BSA，0.1mol/L NaHCO3]封闭2.5h，用0.1％TBST[50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.1％Tween20]洗涤3次，加2.2×1011TU/μl的PVIII9aa1μl，室反应1h，用0.1％TBST洗涤30次，加100μl洗脱液
洗脱后，用1M Tris-HCl(pH9.0)中和。洗脱噬菌体感染100μlTG1饥饿菌30min，加10mlLB培养液，37℃摇荡30min，各取5、20、80μl接种LB/Amp平板，37℃培养过夜，根据生长菌落数计算噬菌体的转导单位(TransductingUnit，TU)，以最少生长菌落数乘以稀释倍数即为TU值；剩余菌液加3×109TU/μl辅助噬菌体M13KO7 20μl，37℃感染30min，8,000rpm离心10min，沉淀用少量LB重悬后加至25ml LB(含Amp 100μg/ml，Kan 50μg/ml)，37℃摇菌过夜。扩增菌液于4℃、8,000rpm离心15min，取上清，10,000rpm离心10min，取上清加15％(V/V)PEG/NaCl[20％(W/V)PEG 8000，2.5 M NaCl]混匀后于4℃放置过夜。次日，4℃10,000rpm离心15min，弃上清，沉淀用1ml TBS[50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl]重悬，加150μl PEG/NaCl溶液混匀，4℃放置2h，4℃10,000rpm离心l0min，沉淀溶于150μl TBS，8,000rpm离心5min，取上清再用于第2轮筛选。同法共进行3轮筛选。每一轮筛选均测定噬菌体TU值，计算每轮筛选噬菌体的产出/投入比 结果见表1。
(3)ELISA检测用0.1mol/L NaHCO3包被抗hCD81 JS-81至96孔酶联反应板，0.5μg/孔，4℃放置过夜。弃包被液，用180μl封闭液[5mg/ml BSA，0.1mol/L NaHCO3]封闭3h。随机挑取第3轮筛选后的30个噬菌体克隆分别感染TG1菌扩增培养，取噬菌体上清液按1∶1比例与含3％BSA的PBS混合培养1h后，加200μl噬菌体培养液(约5×1011TU/孔)至上述抗体包被板中，37℃反应1h，用0.1％TBST洗涤5次，加1∶5000HRP-anti M13 Ab，200μl/孔，37℃、40min，洗液洗涤5次，TMB显色5min，加2mol/L硫酸终止反应，测定吸光度OD450值。同时以辅助噬菌体M13KO7和原始噬菌体肽库PVIII9aa作阴性对照。结果见图1。
(4)噬菌粒DNA的提取将ELISA检测结果呈阳性的噬菌体对应的菌落接种至2ml LB/Amp培养液中，37℃摇菌过夜，次日按分子生物学常规方法小量抽提噬菌粒DNA。
(5)阳性噬菌体克隆的竞争抑制结合试验将0.5μg/孔抗hCD81 JS-81包被至96孔酶联反应板，加封闭液反应4h，用含3％BSA的PBS洗涤3次。同时将CHO细胞表达的HCV E2蛋白(2μg/ml)分别与阳性噬菌体(约5×1011TU/孔)室温共同孵育1h后，加入上述酶联反应板中。室温轻微振荡反应2h，用0.1％TBST洗涤5次，加1∶5000 HRP-anti M13 Ab，37℃反应40min，洗液洗涤3次后，TMB显色5min，加2mol/L硫酸终止反应，测定吸光度OD450值。同时用不加HCV E2的相应培养孔作试验平行对照，以PVIII9aa作阴性对照。结果见图2。
(6)阳性噬菌体克隆DNA测序及氨基酸序列分析用DNA sequencing kit、ABI PRISM 310型全自动测序仪测定阳性噬菌粒DNA序列。DNAMAN BLAST软件用于外源氨基酸序列的比较分析，寻找有无氨基酸共同序列，并将筛选获得的小肽序列与hCD81序列进行比较。结果见表2、3、4。
结果如下表1噬菌体随机9肽库每轮筛选的噬菌体产出/投入比
由表1可以看出，每一轮筛选后，噬菌体的产出/投入比都有所增加，尽管在2轮筛选后噬菌体富集现象不明显，但在第3轮筛选后，洗脱的噬菌体数目却明显增加，提高了约2个数量级，表明经过多轮筛选不仅可以捕获到与JS-81特异性结合的噬菌体，而且还可使阳性噬菌体得到明显富集。
表2 阳性噬菌体C5和C9核苷酸测序结果[注划线部分为外源9肽核苷酸序列]C5噬菌体测序结果gcttgcagggagtcaaaggccgcttttgcgggatccgtagaagggccgcaaacccatgtcgcgaattcaccctcagcagcgaaagacagcatcggaacgagggtagcaacggctacagaggctttgaggactaaagactttttcatgaggaagtttccattaaacgggtaaaatacggggcttggcgtaatctctagaatagctagatcttgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagC9噬菌体测序结果ggagtcaaaggccgcttttgcgggatccgtacaagggccgcaaacccatgtcgcgaattcaccctcagcagcgaaagacagcatcggaacgagggtagcaacggctacagaggctttgaggactaaagactttttcatgaggaagtttccattaaacgggtaaaatacggggcttggcgtaatctctagaatagctagatcttgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaaca
tacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcat表3阳性噬菌体含外源9肽氨基酸序列
由表3可见，筛选获得的小肽序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
表4 筛选的小肽序列与hCD81序列比较
由表4可见，C9/C5小肽第5位至9位氨基酸序列与hCD81第157位至161位氨基酸序列有60％-80％的同源性，是具有hCD81样的小肽序列。
SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军第二军医大学<120>封闭丙型肝炎病毒包膜蛋白E2与人CD81结合位点的小肽序列<130>说明书，权利要求书<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>1Ala Thr Trp Val Cys Gly Pro Ser Thr1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>2Ala Thr Trp Val Cys Gly Pro Cys Thr1 权利要求
1.一种能与丙型肝炎病毒包膜蛋白E2结合、并能封闭HCV E2与人CD81结合位点的小肽序列，其特征在于它是由9个氨基酸组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
2.权利要求1所述的小肽序列的筛选方法，其特征在于它由以下步骤组成I以具有阻断HCV E2与hCD81特异性结合能力的抗hCD81单克隆抗体JS-81为筛选配基，通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的生物淘洗方法，对噬菌体随机展示9肽库进行3轮筛选；II测定每轮筛选的噬菌体产出/投入比，3轮筛选后洗脱的噬菌体数与第1轮相比提高约2个数量级，观察到明显富集效果；III随机挑取第3轮筛选后的30株噬菌体克隆进行鉴定，经酶联免疫吸附检测，30株噬菌体克隆中有10株可与抗hCD81 JS-81特异性结合；IV以HCV E2作为竞争抑制剂，进一步通过竞争ELASA试验证实HCV E2可抑制C5和C9号噬菌体与抗hCD81 JS-81的结合，抑制率分别为18.6％和67.5％，表明这2株阳性噬菌体具有与HCV E2结合的能力；V测定2株阳性噬菌体克隆DNA序列，推导所含外源9肽序列，确定共同氨基酸序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
3.权利要求1所述的小肽序列在制备抗HCV感染药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种能与丙型肝炎病毒包膜蛋白E2(HCV E2)结合、并能封闭HCV E2与人CD81结合位点的小肽序列，它是由9个氨基酸组成，其序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。本发明提供上述小肽序列的筛选方法及它在制备抗HCV感染药物方面的用途。
文档编号A61P31/00GK1660891SQ200410099230
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者曹洁, 戚中田, 赵平 申请人:中国人民解放军第二军医大学