专利名称：：聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛇毒纤溶酶，其制备方法及其在制备高效低毒的溶栓药物和神经保护药物中的应用，具体地说涉及一种聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶其制备方法及其在制备高效低毒的溶栓药物和神经保护药物中的应用。
背景技术：
：蛇毒纤溶酶(fibrinolyticenzyme)是指从蛇毒中提取的一类蛋白酶，它通过作用于纤维蛋白的a链或e链，在体内外能直接溶解纤维蛋白。迄今已发现30余种蛇毒中含有纤溶酶组份，并有69余种先后得到分离和纯化，其中部分已作为治疗药物应用于临床(SwensonSandMarklandFS.Snakevenomfibrin(gen)olyticenzymes.Toxicon，2005;45:1021-1039)。其中在国内夕卜应用的纤溶酶有来自于爿gh'WrodowcoWo/"WjccowforW;c蛇毒的Fibrolase，来自于江浙尖吻蝮蛇(爿gA:/s化odow)和长白山白眉蝮"gtorodow/ha/ys6rev/caM^seged蛇毒的纤溶酶。这些纤溶酶均为金属蛋白酶，它们的N-末端的氨基酸序列一般为QQRFFPQRYVQLVIV;它们的分子量在21000~31000之间(参见国家食品药品监督管理局国家药品标准纤溶酶)，等电点在47之间。国内外多年的临床实践证明这些来自于蛇毒的纤溶酶在溶栓和改善微循环和神经保护等方面作用明显，治疗效果确切，但是在使用过程中也发现这些药物同样具有蛋白质药物所共有的缺点，如具有免疫原性，半衰期短，稳定性差等。为此，有必要采用蛋白质修饰技术以获得低免疫原性的纤溶酶，从而改善该类药物的药效，降低毒性。目前，在对蛋白质药物进行化学修饰的研究领域中，应用最多，成功率最高的是聚乙二醇(PEG)修饰技术。用于修饰蛋白质药物的PEG有很多种，典型的修饰反应列举如下-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>mPEG-OCH2CH2CH2NH~RA:PEG-醛修饰蛋白质NH2的反应1.)mPEG-0(CH2)nC~0<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>2.)mPEG-0(CH2)mCHC~0Y<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>mPEG-0(CH2)mCHC-NH-RY1)SPA-PEG或SBA-PEG所参与的反应；2)带a-支链的SPA-PEG或SBA-PEG所参与的反应。B:NHS-PEG修饰蛋白质NH2的反应。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>1)为PEG-马来酰亚胺；2)为PEG-乙烯基砜；3)为PEG-碘乙酰胺；4)为PEG-邻-吡啶-二硫醚。C:几种活化的PEG修饰蛋白质巯基的反应修饰研究中大多数是将多肽分子中的氨基作为修饰位点。为克服蛇毒纤溶酶作为药物使用所存在的不足，采用聚乙二醇修饰技术对纤溶酶的氨基进行修饰，以获得聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，应用于临床治疗血栓性疾病。
发明内容本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术制备蛇毒纤溶酶存在免疫原性，半衰期短，稳定性差等缺陷，采用蛋白质修饰技术以提高纤溶酶的稳定性，延长其半衰期，降低其免疫原性，从而改善该蛋白质的药物动力学特性，以提高其耐受性和减少给药次数，更好地满足蛇毒纤溶酶在临床应用方面的需求。本发明的一个目的是提供一种聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，其特征在于，蛇毒纤溶酶的氨基上连接有活化的聚乙二醇或其衍生物链。优选地，所述聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶具有如下通式结构mPEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中m为单甲氧基(monomethoxy)，n=0~6;oT为卩或CH2;R为去除一个氨基(NH2)的蛇毒纤溶酶分子。o当T为^时为一种修饰方法，具体为0mPEG-O(CH2)nC-NH-R当T为CH2时为另一种修饰方法，具体为mPEG-0-(CH2)n-CH2-NH-R所说的蛇毒纤溶酶包括从蛇毒中提取或用基因工程手段制备的重组蛇毒纤溶酶；具体地从江浙尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)蛇毒、江浙蝮蛇(Agkistrodonhalys)蛇毒和长白山白眉蝮(Agkistrodonhalysbrevicaudusstejneger)蛇毒以及Agkistrodoncontortrixcontortrix蛇毒中提取的这四种蛇毒纤溶酶，但并不仅限于这四种蛇毒纤溶酶，这些纤溶酶均为金属蛋白酶，它们的N-末端的氨基酸序列一般为QQRFFPQRYVQLVIV;它们的分子量在2100031000之间(参见国家食品药品监督管理局国家药品标准纤溶酶)，等电点在47之间。所说的活化的聚乙二醇或其衍生物是本领域一般技术人员所公知的，并且描述于例如RobertMJ等，先进的药物传递评论(AdvancedDrugDiliveryReviews)(2002;54:459-476)。最优选地，使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯，也可使用单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛(使用这些醛进行修饰时需在反应液中加入硼氢化钠)，这些修饰剂可采用美国NektarTherapeutics公司生产的产品。所说的聚乙二醇的分子量为2000~200000。优选的聚乙二醇的分子量为3000-30000。本发明的另一个目的是提供聚乙二醇修饰蛇毒纤溶酶的制备方法，包括如下步骤在蛇毒纤溶酶溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5-9.5，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反应温度为4-40°C，反应时间为5~120分钟，反应中活化的聚乙二醇或其衍生物与蛇毒纤溶酶的摩尔比为0.1~100，优选0.110，将反应混合液釆用本领域所公知的离子交换层析技术和凝胶过滤层析技术进行色谱分离。离子交换层析采用阴离子交换层析，流动相为含NaCl的磷酸盐缓冲液，即可得聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶。制备反应按下式进行mPEG-0-(CH2)n-D+R-NH2-^mPEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中R-NH2为蛇毒纤溶酶。mPEG为CH30-(CH2CH20)n.-CH2CH2OH其中m为单甲氧基，n'=44-2200，n=0~6;-h。D为o或—eHR代表代表去除一个氨基(NH2)的蛇毒纤溶酶分子。离子交换层析采用阴离子交换层析进行分离，所使用阴离子交换层析介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如QS印harose系列、DEAESepharose系列、DEAESephacel系列、QAESephadex系列、DEAESephadex系列、SOURCEQ系列等，其中最优的使用SOURCE30Q作为层析介质进行分离，阴离子层析的柱体积为6600ml，流速为0.5~50ml/min;用起始缓冲液平衡3~8倍柱体积；上样量为2~200ml;先用1~5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+1.0mol/LNaCl缓冲液(B)，B从0100%，洗脱20倍CV。起始缓冲液可使用乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥-盐酸缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等，这些缓冲液的pH可从3.0-10.0，其中最优地使用pH为69的Tris-HCl缓冲液。收集各洗脱组份，用SDS-PAGE和反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析，合并聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，待进行下一步的凝胶过滤层析。用截留分子量1000-10000Da的醋酸纤维素膜超滤浓縮，取浓縮液做凝胶过滤层析，所使用的凝胶过滤介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如Sepharose系列、Sephacel系列Sephadex系列和Superdex系列等，其中最优的使用Superdex75pregrade作为层析介质进行分离，凝胶过滤层析柱体积为25-2500ml;流速为0.1~10ml/min;PBS缓冲液平衡1~2倍柱体积；上样量为0.220ml;PBS缓冲液洗脱12倍柱体积。收集各洗脱组份，用SDS-PAGE和RP-HPLC进行分析，合并单聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶。本发明的又一个目的是提供聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶在制备高效低毒的溶栓药物和神经保护药物中的应用，其中药物的制剂形式可以是注射液或冻干粉针。本发明的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶能够基本保持蛇毒纤溶酶的生物效价，同时它比未修饰的蛇毒纤溶酶有较低的免疫原性和更好的稳定性，因此作为药物它比未修饰的蛇毒纤溶酶有更大的优越性。本发明的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶的制备方法，简单易行。具体实施方式实施例1丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)修饰的蛇毒纤溶酶反应温度的选择取1.0mg/ml的纤溶酶溶液(来自于长白山白眉蝮蛇毒的纤溶酶，以下同)2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.6,再加入mPEG-SPA-5000固体2.0mg，溶解，混匀，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4'C、10°C、25'C和37'C反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的纤溶酶，其中25'C的修饰率最高，具体数据见表一。表一不同温度对纤煞芽酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>反应时间的选择取1.0mg/ml的纤溶酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.6，再加入mPEG-SPA-5000固体2.0mg，溶解，混匀，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后于25。C分别反应5、15、30、60、120min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的纤溶酶，其中30min后的修饰率没有明显提高，具体数据见表二。表二不同时间对纤斜享酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>mPEG-SPA-5000同纤溶酶的摩尔比的选择取1.0mg/ml的纤溶酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.6，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别加入0.03、0.3、1.5、3mgmPEG画SPA-5000(相当于mPEG-SPA-5000同纤溶酶的摩尔比在0.1~10)，溶解，混匀，反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的纤溶酶，当mPEG-SPA-5000同纤溶酶的摩尔比在5时修饰率己达到最高，进一步增加mPEG-SPA-20000的量修饰率也没有明显地增加，具体数据见表三。表三不同摩尔比对纤溶酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2聚乙二醇修饰纤溶酶的分离纯化与鉴定取1.0mg/ml的纤溶酶溶液2ml，加约5ml的磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.6，再加入mPEG-SPA-5000固体2.0mg，溶解，混匀，于25。C反应30min，加入3g甘氨酸固体终止反应。取上述反应液，对0.05mol/L，pH7.8的Tris-HCl缓冲液透析，用截流分子量为10000的超滤膜浓縮至5ml，上柱分离。色谱条件如下层析介质SOURCE30Q柱体积5ml流速l.Oml/min柱平衡用0.05mol/L，pH7.8的Tris-HCl(起始缓冲液)平衡5倍柱体积上样量5ml洗脱先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+l，Omol/LNaCl缓冲液(B),B从0100X，洗脱20倍CV收集1.0ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC进行跟踪分析，合并聚乙二醇修饰的纤溶酶，再用截流分子量为10000的超滤膜浓縮至5ml，待做凝胶过滤层析分离。凝胶过滤层析的色谱条件如下层析填料Superdex75pregrade柱规格1.6X60cm流动相0.05MNa2HP04-NaH2P04，pH7.8，含0.15mol/LNaCl流速0.3ml/min检测波长215nm收集0.5ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC进行跟踪分析，合并单聚乙二醇修饰的纤溶酶。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修饰的纤溶酶的纯度在98%以上，具有较高的纯度。聚乙二醇修饰的纤溶酶经MALDI-TOF-MS分析，测得其分子量为28663.8(纤溶酶的分子量为22945.0)，二者分子量相差约5000，同时在28664.8(M+l峰)附近有一系列峰，相邻两峰的分子量相差44，具有聚乙二醇的典型结构特征，这也证实得到的聚乙二醇修饰的纤溶酶为单修饰产物。实施例3修饰产物的生物效价(比活力)保留率的测定(方法参见国家食品药品监督管理局国家药品标准纤溶酶)按照药品标准中纤溶酶的效价测定方法，测定纤溶酶和聚乙二醇修饰的纤溶酶的效价，然后计算样品的比活力(U/mg)。结果见表四。表四降纤酶及聚乙二醇修饰的降纤酶的生物效价<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例4聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶稳定性的研究热稳定性取纤溶酶和聚乙二醇修饰的纤溶酶(在液体状态，无任何保护剂)，分别置于25'C、37。C条件下，定时取样测定其生物效价。结果表明，纤溶酶在37'C下1小时内效价降低了50%，而聚乙二醇修饰的纤溶酶在12小时内降低没有发生明显地变化。在25'C时纤溶酶3天内效价不变，而聚乙二醇修饰的纤溶酶在30天内效价不变。因此，聚乙二醇修饰的纤溶酶可以明显增加纤溶酶的热稳定性。酶稳定性取0.1°/。胰蛋白酶溶液(pH7.8)2.7ml，分别加入0.3ml纤溶酶和聚乙二醇修饰的纤溶酶样品，37'C水浴，于0、0.5、1、2、4h取样0.3ml，测定样品的生物效价。结果表明纤溶酶在0.5h内效价迅速降到原来的20%,而聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶在1.0小时h内效价仅降到原来的40%。因此，聚乙二醇修饰的纤溶酶能明显增加纤溶酶抵抗胰蛋白酶水解的能力。实施例5聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶对实验动物血栓形成的影响按照张骞等公布的蛇毒纤溶酶对实验动物血栓形成的影响的试验方法，以家兔作为实验动物进行试验，方法参见张骞等，中国生化药物杂志，2004;25(3):156-180。纤溶酶和聚乙二醇修饰的纤溶酶这两种样品均为一次给药，剂量为10.0U/kg。试验结果表明家兔体内注射纤溶酶和聚乙二醇修饰纤溶酶这两种样品均能明显抑制血栓的形成。给药15分钟和2小时血栓的湿重均比给药前显著减少(P<0.05~0.001)，其中聚乙二醇修饰纤溶酶组的血栓抑制率为83%，纤溶酶组的血栓抑制率为59%。给药后15分钟两组样品即开始发挥作用，8小时后纤溶酶组的作用基本消失，而聚乙二醇修饰纤溶酶组的作用在14小时后才基本消失。对照组给生理盐水前后血栓的湿重没有明显的变化。这些结果表明聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶在体内不但保留了蛇毒纤溶酶降低溶解血栓的生理作用，而且能延长其作用时间。因此，预期在人体内聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶会有更好的溶栓抗凝作用和神经保护的效果。实施例6聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶对实验动物免疫原性的研究以家兔作为制备抗血清的实验动物，采用福氏佐剂免疫法，并分别以纤溶酶和聚乙二醇修饰的纤溶酶作为抗原，剂量均为100U/kg/次，每周1次，共5次。分别以纤溶酶和聚乙二醇修饰的纤溶酶作为抗原，用双向免疫扩散法测定它们各自抗血清的效价，测定结果为纤溶酶组抗血清的效价为1:16;聚乙二醇修饰的纤溶酶组抗血清的效价测不出。分别以纤溶酶和聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶作为抗原，然后用纤溶酶组的抗血清作为第一抗体，再以辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为第二抗体，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定它们各自的免疫原性，测定结果为纤溶酶组为阳性，聚乙二醇修饰的纤溶酶组为阴性。以上结果表明同蛇毒纤溶酶比较，聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶的免疫原性显著降低，这样更有利用作为治疗药物进行使用。实施例7用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SPA-20000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SPA-30000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯60000(mPEG-SPA-60000)代替实施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了实施例中l-6相似的结果。实施例8用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SBA-20000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SBA-30000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯60000(mPEG-SBA-60000)代替实施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了实施例中l-6相似的结果。实施例9甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)修饰的蛇毒纤溶酶反应温度的选择取1.0mg/ml的纤溶酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.6，再加入mPEG-ALD-5000固体2.0mg，溶解，混匀，再加0.082ml的lmol/LNaBH4，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4。C、IO'C、25'C和37'C反应16h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的纤溶酶，其中25X:的修饰率最高，具体数据见表五。表五不同温度mPEG-ALD-5000对纤溶酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>反应时间的选择取1.0mg/ml的纤溶酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.6，再加入mPEG-ALD-5000固体2.0mg，溶解，混匀，再加0.082ml的lmol/LNaBH4，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后于25。C分别反应0.5、1.0、8.0、16.0、24.0h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的纤溶酶，其中16h后的修饰率没有明显提高，具体数据见表六。表六不同时间mPEG-ALD-5000对纤溶酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>mPEG-ALD-5000同纤溶酶的摩尔比的选择取1.0mg/ml的纤溶酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.6，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别加入0.3、1.5、3.0、6.0mgmPEG-ALD-5000(相当于mPEG-ALD-5000同纤溶酶的摩尔比在1.0-20.0)，溶解，混匀，再分别加0.021ml的lmol/LNaBH4反应16.0h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的纤溶酶，当mPEG-ALD-5000同纤溶酶的摩尔比在10时修饰率己达到最高，进一步增加mPEG-ALD-5000的量修饰率也没有明显地增加，具体数据见表七。表七不同摩尔比的mPEG-ALD-5000对纤溶酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例10聚乙二醇修饰纤溶酶(醛修饰)的分离纯化与鉴定取1.0mg/ml的纤溶酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.6，再加入mPEG-ALD-5000固体4.0mg，溶解，混匀，再加0.082ml的lmol/LNaBH4,反应16h后，加入3g甘氨酸固体终止反应。然后按照实施例2中的方法进行聚乙二醇修饰纤溶酶的分离纯化与鉴定。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修饰的纤溶酶的纯度在98%以上，具有较高的纯度。聚乙二醇修饰的纤溶酶经MALDI-TOF-MS分析，测得其分子量为28649.8(纤溶酶的分子量为22945.0)，二者分子量相差约5000，同时在28650.8(M+l峰)附近有一系列峰，相邻两峰的分子量相差44，具有聚乙二醇的典型结构特征，这也证实得到的聚乙二醇修饰的纤溶酶为单修饰产物。实施例11聚乙二醇修饰纤溶酶(醛修饰)的特性研究按照实施例36中的方法进行mPEG-ALD-5000修饰纤溶酶生物活性、稳定性、对实验动物血栓形成的影响和免疫原性的研究，结果见表八。表八聚乙二醇修饰纤溶酶(醛修饰)的特性研究结果项目生物效价稳定性血栓形成的影响免疫原性检测结果740U/mg37r放置12小时内效价没有发生明显地变化。在25"C放置30天内效价不变。血栓形成抑制率为78%;作用时间12h。阴性实施例12用甲氧基聚乙二醇丙醛2000(mPEG-ALD-2000)、甲氧基聚乙二醇氧基聚乙二醇丙醛10000(mPEG-ALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丙醛20000(mPEG-ALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丙醛30000(mPEG-ALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丙醛60000(mPEG-ALD-60000)代替实施例9中的mPEG-ALD-5000，得到了实施例中9-11相似的结果。实施例13用甲氧基聚乙二醇丁醛2000(mPEG-ButyrALD-2000)、甲氧基聚乙二醇聚乙二醇丁醛10000(mPEG-ButyrALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丁醛20000(mPEG-ButyrALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丁醛30000(mPEG-ButyrALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丁醛60000(mPEG-ButyrALD-60000)代替实施例1中的实施例9中的mPEG-ALD-5000，得到了实施例中9-11相似的结果。权利要求1.一种聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，其特征在于，蛇毒纤溶酶的氨基上连接有活化的聚乙二醇或其衍生物链。2.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，其结构如下mPEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中m为单甲氧基，n=0~6;oT为C或CH2;R为去除一个氨基的蛇毒纤溶酶分子。3.如权利要求l所述的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，其特征在于，所述的蛇毒纤溶酶包括从蛇毒中提取或用基因工程手段制备的重组蛇毒纤溶酶。4.如权利要求3所述的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，其特征在于，所述的蛇毒纤溶酶为从江浙尖吻蝮蛇蛇毒、江浙蝮蛇蛇毒和长白山白眉蝮蛇毒以及^gA;/Wfoab"co"toWn';c蛇毒中提取的蛇毒纤溶酶。5.如权利要求l所述的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，其特征在于，所述的活化的聚乙二醇或其衍生物选自丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛。6.如权利要求l一6任一所述的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量为2000200000。7.如权利要求6所述的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量为300030000。8.制备权利要求1一6任一所述的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶的方法，其特征在于，包括下列步骤在蛇毒纤溶酶溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.59.5，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反应完毕后，将反应混合液进行色谱分离，即可得聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，反应温度为4~40°C，反应时间为5-120分钟。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，活化的聚乙二醇或其衍生物与蛇毒纤溶酶的摩尔比为0.1100。11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，活化的聚乙二醇或其衍生物与蛇毒纤溶酶的摩尔比为0.110。12.权利要求1一7所述的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶在制备溶栓药物和神经保护药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶及其制备方法，其特征在于，蛇毒纤溶酶的氨基上连接有活化的聚乙二醇或其衍生物链。本发明的聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶能够基本保持蛇毒纤溶酶的生物效价，同时它比未修饰的蛇毒纤溶酶有较低的免疫原性和更好的稳定性，从而改善了蛇毒纤溶酶的药物动力学特性，提高了耐受性和减少了给药次数。本发明还公开了聚乙二醇修饰的蛇毒纤溶酶在制备高效低毒的溶栓药物和神经保护药物中的应用。文档编号A61P7/00GK101125205SQ20061003012公开日2008年2月20日申请日期2006年8月16日优先权日2006年8月16日发明者伟公,军冯,赵文杰申请人:上海医药工业研究院