专利名称：互补型高容量腺病毒载体系统及其构建的疫苗和基因治疗产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种互补型高容量腺病毒载体系统及其衍生物，该系统包括一对 互补的腺病毒载体。本发明还涉及基于互补原理的其他病毒载体系统。该系统可 以作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗和基因治疗载体，适用于携带多种外源 基因的多价疫苗以预防传染性疾病，也适用于携带多个治疗基因的基因治疗产
背景技术：
腺病毒(Adenoviruses, Ad)是一种特征性的二十面体病毒壳体，它的基因 组是线性的双链DNA，约34kb到43kb。 Ad的宿主范围很广。人源Ad可分为6 个亚群，约51种血清型。Ad可将外源基因高效的递送到细胞核中进行表达，因 而Ad载体系统作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗和基因治疗载体备受胄睐。
目前开发的腺病毒载体主要以5型腺病毒(Ad5)为主，Ad5载体系统作为 基因转移载体有诸多优点。
1. 安全性
1) 腺病毒基因组的遗传背景比较清楚；
2) 5型腺病毒比较温和，正常人感染后可以自愈；
3) 通过删除、置换E1区，可造成腺病毒的复制缺陷，并且避免了E1基因 对细胞的转化作用，因此更加安全。
2. 有效性
1) 腺病毒可以高效的感染处于分裂期与静息期的细胞，而且携带的外源基
因可以长时间高水平地表达；
2) 重组腺病毒载体可以经口服以及鼻吸用药，这种用药途径不仅方便，而 且还大大减少了注射用药造成的交叉感染。
3. 生产易得性
1) 腺病毒可以在宿主细胞中复制增长到很高的滴度(达到1X10"pi'u/ral)， 适于重组疫苗的大规模生产；
2) 腺病毒的物理化学性状比较稳定，可以冷冻保存数月不失去感染能力， 所以可以方便地运输、储存重组腺病毒疫苗成品。
腺病毒载体经历了三个发展阶段。
1、 第一代腺病毒载体去除了腺病毒基因组的El和(或)E3区，其增殖必须 在能够反式提供E1区表达蛋白的互补细胞株中完成。目前可以提供E1区表达产 物的细胞株有293， 911， N52. E6和PER. C6。丧失了在非El互补细胞中复制能 力的第一代腺病毒载体不能在活体内复制，安全性大为提高。其携带外源基因的 最大能力仅为7-8Kb。
2、 第二代腺病毒载体是在第一代腺病毒载体的基础上去除了更多的早期基 因，如E2区、E4区等，载体可容纳14kb的外源基因序列。然而，去除了相关 基因的第二代腺病毒载体的生产必须在提供相应功能的互补细胞株中完成。腺病 毒基因的表达对细胞本身是一种毒性，使得这种细胞中病毒产量较低，不利于大 规模生产。
3、 第三代腺病毒载体去除了所有病毒编码基因，仅保留了5'和3'末端反 向重复序列(ITR)与腺病毒的包装信号(v)。其可以容纳36kb的外源基因，故也 称其为辅助病毒依赖(helper dependent)高容量腺病毒。该系统的弊端是， 高容量载体的生长完全依赖于辅助病毒，缺乏选择生长优势，故产量很低。第三 代腺病毒载体需要在辅助病毒的帮助下才能够在细胞株中生产，在大规模生产和 纯化中辅助病毒的去除工作使得生产和纯化成本大大提高。
此外，在第三代腺病毒载体中，大量的异源填充物片段的选择也是一个难题。 众所周知，腺病毒外壳的包装范围为整个腺病毒基因组的75-105%，通常情况下 构建的第三代辅助病毒依赖高容量腺病毒载体骨架区长度较短，即使加上作为抗 原或者治疗性的外源基因片段，其长度也达不到腺病毒的包装范围。因此需要借 助填充物来实现高容量腺病毒载体的正常包装。目前，报道的填充物主要有X-噬菌体、酵母、细菌和非编码的高等动物来源(包括人来源)的DNA片段。然而， 研究表明1 )携带X-噬菌体DNA填充片段的高容量腺病毒载体应用于动物试验时， 机体产生了针对这些填充物编码的l噬菌体蛋白的CTL反应，使得这些载体被体
内的免疫系统迅速清除，同时X-噬菌体DNA在病毒生产过程中不稳定，易于导致 自动的缺失与重组。2)选用人的基因组非编码区(例如，包含基质附着区元件 的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列)作为填充物可以提高DNA的稳定 性，且不会引起免疫反应，但是这些方法存在着填充片段介导的外源基因重组到 人类基因组中的潜在危险。
发明内容
本发明涉及一种基于互补原理的腺病毒载体系统，该系统将人类5型腺病毒 的基因组按不同的方式分布在两个载体中(参见附图2)，由于分别提供了病毒复 制和/或包装所必需的基因，两个载体在生长过程中互相依存。这两个载体在本发 明中分别被命名为互补型高容量腺病毒载体I (以下在本发明中简称为CHCAdI ) 和互补型高容量腺病毒载体II (以下在本发明中简称为CHCAdII )。整个系统中. 在缺少其中任意一个载体的情况下，另一个载体不能自己单独生长扩增。其特征 在于两个载体可以单独或者共同携带外源基因，使得携带外源基因的能力可以达 到整个基因组的长度。
本发明术语"腺病毒"指本领域技术人员己知的任何腺病毒亚型，分离株或 其他动物来源的腺病毒。具体地，可以是人类2型或者5型腺病毒。本发明优选地， 但不限于此优选方案，使用5型腺病毒来构建新型载体系统。
将5型腺病毒的基因组中的复制包装必需元件合理地分配在两个载体中，依 照彼此制约、共同生长的原理，将对腺病毒复制包装必需的基因平均或不平均地 分开，使得任何单独一个病毒载体都不能独自复制包装。只有两种互补的病毒载 体共同存在时，才能互相利用对方携带的另外一部分必需基因产物进行复制包 装。在本发明中通过实施例，最优选地将这些必需元件以附图2中所示的组合分 配在两个载体中。然而，本发明不限于这些最优选的分配方案。
腺病毒基因组中的各区域的主要功能是本领域熟悉技术人员所已知的(参见
附图l)。具体地，如下所述
1、腺病毒基因组的两端各有一段103bp的反向末端重复序列UTR)，是复制 的起始位点。在左端lTR的3'侧有一段长约300bp的包装信号(v)，介导腺病毒基 因组包装入病毒衣壳。2、 El区基因表达产物
可以进一步分为E1A和E1B。 E1A编码蛋白的主要功能是调节细胞周期，使细 胞对病毒复制更易感。ElB19K与细胞Bc1--2基因的表达产物同源，可以通过灭活 和清除Bax家族成员来防止细胞发生凋亡或坏死。ElB55K基因产物可以下调p53 基因的转录水平，并与病毒复制、病毒晚期mRNA的转录以及病毒RNA的转运有关。
3、 E2区基因表达产物
可分为E2A和E2B。其中，E2A即DNA结合蛋白(DBP， DNA Binding Protein): E2B主要产物有两种，分别是末端蛋白前体(pTP)和病毒DNA聚合酶(poi)。三 种蛋白与细胞内复制因子相互作用，启动腺病毒DNA复制以及病毒晚期基因的转 录和翻译过程。
4、 E3区基因表达产物 主要功能是破坏宿主的免疫防御机制。
5、 E4区基因表达产物
E4区的基因产物通常被称为orf l—orf6/7，主要与病毒信使RNA的代谢有关， 还有促进病毒DNA复制以及关闭宿主蛋白合成与抑制调亡的功能。
6、 晚期转录单位(L1一L5)
大部分晚期基因的转录是以一个共同的主要晚期启动子(MLP， Major Late Promoter)调控的。晚期基因主要编码腺病毒的结构蛋白。病毒结构蛋白在细胞 核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒， 并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。
由上述资料可以看出对腺病毒复制包装的顺式元件包括反向末端重复序列 (1TR)和包装信号(i|/);反式作用因子包括El基因、E2基因与E4基因表达产 物以及晚期基因的表达产物。因此在本发明中通过实施例，且不限于所述的试验 方案，将这些必需元件以不同的组合分配在两个载体中。
在可选的实施方案之一是CHCAd I携带的必需元件包括ITR、包装信号、E2 基因、E4基因及晚期转录基因L4和L5。 CHCAdll携带的必需元件包括ITR、包装信 号及晚期转录基因L1—L3。
在更优选的实施方案是CHCAd 1携带的必需元件包括ITR、包装信号、E2基
因及晚期转录单位。CHCAdII携带的必需元件包括ITR、包装信号及E4基因。
在这些实施例中CHCAd I和CHCAdll所必需的El基因产物由互补细胞系293细 胞提供。
本领域熟练技术人员已知构建携带外源基因的基于本发明的重组腺病毒的 方法。为验证本发明的载体系统中两种互补载体的比例以及稳定性，在实施例中 CHCAd I携带了红色荧光蛋白报告基因，CHCAdII携带了绿色荧光蛋白报告基因。
此外该系统还可以作为重组疫苗载体、基因治疗载体以及哺乳动物细胞表达 载体。在可选的实施例中，且不限于这些实施例，该系统可适用于构建携带多种 HIV抗原基因的多价疫苗。详细资料参见专利"携带HIV基因的腺病毒载体疫苗"。
该系统也适用于携带多个治疗基因的基因治疗产品，亦适用于携带大片段外 源基因的哺乳动物细胞表达载体。
本发明还涉及高容量腺病毒载体中填充物的优化选择。本发明中对填充物进 行了优化选择。可选方案之一是用X-噬菌体基因组片段作为填充物。但同先前研 究相比，本发明中所采用的l噬菌体基因组片段是经过优化选择的。这包括尽量 避开或打乱基因阅读编码框，以及通过对X-噬菌体整个基因组扫描找出GC含量与 腺病毒基因组相近的区域。
在更优选的方案中，采用了来自腺病毒的基因组片段。用来自腺病毒的基因 组片段作为填充物可以最大程度模拟腺病毒基因组序列的天然性。具体地，填充 物可以是人类2型、5型或者其他血清型腺病毒基因组的片段。本发明最优选的方 案(但不限于此优选方案)是人类2型腺病毒基因组片段作为填充物。
本领域熟练技术人员已知得到本发明的人类2型腺病毒的基因组片段的方 法。不必拘泥于本发明实施例的方法，本领域熟练技术人员可以从包含人类2型 腺病毒基因组的病毒、质粒或片段中得到这些片段。本发明实施方案中那些来自 人类2型腺病毒的基因组片段被分成若千小片段区域，具体地，最优选的方案中 分成了8个片段，然而本发明不限于这些最优选的方案。这些小片段中缺失了2 型腺病毒相应基因的起始密码子，这些获得的经过改造的小片段再以不同于原来 顺序的排列串连起来作为填充物。其目的在于通过合理的排列组合避免互补病毒 间的重组，即使互补载体之间发生重组，得到的重组产物也由于长度小于包装范 围或大于包装范围而不能被成功包装，子代重组病毒没有生长优势。
四
图1是人类5型腺病毒整个基因组的组成。
图2是互补型高容量腺病毒载体的示意图。 图3是互补型高容量腺病毒载体I的构建流程图。 图4是成功构建的互补型高容量腺病毒载体I的酶切鉴定图谱。 图5是互补型高容量腺病毒载体II的构建流程图，其中以l噬菌体基因组片 段作为填充物。
图6是互补型高容量腺病毒载体II骨架的酶切鉴定图谱。 图7是入-噬菌体基因组片段的获得示意图。
图8是互补型高容量腺病毒载体II的构建流程图，其中以人类2型腺病毒基因 组片段作为填充物。
图9是人类2型腺病毒基因组片段填充物的来源示意图。
图10是人类2型腺病毒基因组8个片段的PCR扩增结果。
图11是人类2型腺病毒基因组片段的连接示意图。
五具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例l
互补型高容量腺病毒载体I (CHCAd I )构建
CHCAdI中对腺病毒复制包装所必需的元件包括ITR、包装信号、E2基 因及晚期转录单位。它的获得方案如下本实验室已有的第一代5型腺病毒载体 中已经去除了 El基因和E3基因，因而在此基础上再去除E4基因即可获得 CHCAdI载体。具体地讲，先把所要删除的E4基因左右两侧的序列扩增出来， 得到E4-L和E4-R片段。这两个片段按照附图3中的方向和顺序先后插入到 pVAXl中得到pVAXl —E4-L-R。 EcoRI酶切线性化的pVAXl —E4-L -R产物和 Sbfl部分消化的pAd5 El-E3-产物共同转化BJ5183菌，重组即可得到pAd5 E1-E3-E4-(含有卡那霉素抗性基因)。如果卡那霉素抗性基因对下游的试验有影 响可进一步将其删除，因为在设计扩增E4-L和E4-R片段的引物时候，己经在 其两端引入了 Swal位点。这样在pAd5El-E3-E4-的卡那霉素抗性基因两端存在 了 Swal位点，该位点在pAd5 E-E3-E4-其他区域不存在。因此用Swal酶切pAd5 E1-E3-E4-(含有卡那霉素抗性基因)质粒再向连即可得到CHCAd I载体。这种 "部分酶切，双抗性筛选"的方法经本实验室证实是一种十分有效的删除病毒、 细菌或者其他微生物中任意基因或者任意片段(这些基因或者片段中不要求必需 存在单个酶切位点)的技术。该技术的详细介绍参见本实验室的另外专利。 具体的实验流程见附图3。
实施例2
互补型高容量腺病毒载体II (CHCAdIl)构建
CHCAdII中对腺病毒复制包装所必需的元件包括ITR、包装信号及E4基 因。它的获得方案如下从第一代5型腺病毒载体(来自Stratagene公司的 AdEasy Adenoviral Vector System或其他)中已经去除E2基因及晚期转录单位， 仅保留E4基因即可到CHCAdlI载体骨架。具体地，用BstZm和Hpal双酶切 pAd5 El-E3-回收带有质粒骨架和E4基因的片段再自连即得CHCAdlI载体骨 架。
X-噬菌体基因组片段作为填充物
以入-噬菌体基因组片段作为填充物的具体试验流程见附图4。具体地讲，先 把所选择的X-噬菌体基因组片段左右两侧的序列扩增出来，得到XA和XB片段。 这两个片段按照附图4中的方向和顺序先后插入到pVAXl载体中得到pVAXl — XA B。酶切XA B片段连到CHCAdII载体骨架中得到pAdE4-XA B质粒。Swal 线性化得pAdE4-AA B和Xbal与Xhol酶切消化的X-噬菌体基因组产物共同转化 BJ5183菌，重组即可得到CHCAdIl (以X-噬菌体基因组片段作为填充物)。
Ad2基因组片段作为填充物
以Ad2基因组片段作为填充物的具体试验流程见附图5。具体地讲，先从人 类2型腺病毒的基因组片段分别通过PC:R扩增出8个片段。其中S5和S8先按 照附图5中的方向和顺序先后插入到pVAXl中得到pVAXl—S5S8。酶切S5S8 片段连到0^^(111载体骨架中得到？八(:旧4- S5S8质粒。S12345片段与BstZ171 酶线性化的pA犯4-S5S8共同转化BJ5183菌，重组即可得到pAdE4- S123458。 S5678与Swal线性化的pAdE4- S123458共同转化BJ5183菌，同源重组得到 pAdE4-Sl2345678，即CHCAdII (Ad2基因组片段作为填充物)
其中SI2345片段的连接方案如下
1.S1 (HindlII+BamHI酶切)，S5c (XhoI + Spel酶切)，S2 (BamHI+Hpal 酶切)，S4 (Notl+Xho1酶切)和S3 (Scal+Notl酶切)片段依次连入pVAXl 中，得到pVAXl-S 12345。
2.用Swal酶切(在PCR扩增Sl和S5两个片段时，己在Sl左端和S5右端 引入了 Swal位点)卸出S12345片段，备用。
其中S5678片段的连接方案如下
1. S5 (HindlII+BamHI), S6 (BamHI+EcoRD， S7 (EcoRI+Hpal)禾[i S8 (用平端DNA聚合酶扩增得到的S8片段与EcoRV酶切的pVAXl-S5S6S7连接)
片段依次连入pVAXl中，得到pVAX卜S5S6S7S8。
2. 用SnaBI酶切(在PCR扩增S5和S8两个片段时，已在S5左端和S8右 端引入了SnaBI位点)卸出片段S5678，备用。
实施例3
1-噬菌体基因组片段作为填充物的优化选择
在CHCAdII载体构建过程中共删除了 5型腺病毒基因组的23583bp的片段， 此片段的平均GC含量为58 % 。用在线软件geneGC calculater (http:〃pl加tst.genomics.purdue.edu/plantst/cgi-bin/geneGC.cgi)通过对X-噬菌体全 基因组分析，选取了 X-噬菌体基因组得149-21749区间的片段作为填充物，该片 段长度为21601bp，平均GC含暈为56.7% 。
实施例4
Ad2基因组片段作为填充物的优化选择
来自人类2型腺病毒的基因组(invi加gen， Catalog Number: 15270-010)片 段被分成了 8个片段通过PCR扩增出来见参见附图9和附图10。各个片段对应 于人类2型腺病毒基因组(genebank: AC—000007)人类5型腺病毒基因组 (genebank: AC_000008)的位置分别为
SI: Ad5 genome (4435-5711 bp)
S2: Ad2 genome (31057-32716bp)
S3: Ad2 genome (18851-24072bp)
S4: Ad2 genome (24110-28165bp)
S5: Ad2 genome (28222-28616bp)
S6: Ad2 genome (11082-14019bp)
S7: Ad2 genome (14161-18618bp)
S8: Ad2 genome (28669-31016bp)
通过引物设计，这些小片段中缺失了 2型腺病毒相应基因的起始密码子和下 游操作过程中所用到的酶切位点，这些获得的经过改造的小片段再以不同于原来 顺序的排列卑连起来作为填充物(参见附图ll)。其目的在于通过合理的排列组 合使得互补病毒间的重组尽量被避免，即使重组发生，产生的重组产物也由于长 度太短或太长不会被包装起来。
实施例5
携带报告基因的互补型高容量腺病毒载体构建
CHCAd I与pGAl-RFP共同转化BJ5183菌，重组得到CHCAd I -RFP。. CHCAd I -RFP用Pad酶切，即得到CHCAd I -RFP病毒基因组。
CHCAd II与pGAl -EGFP共同转化BJ5183菌，重组得到CHCAd II -EGFP 。 CHCAd II-EGFP用PacI酶切，即得到CHCAd II-EGFP病毒基因组。
将CHCAd I -RFP病毒基因组和CHCAd II -EGFP病毒基因组的产物共转染 Trex293细胞即可拯救得到CHCAd I -RFP和CHCAd II -EGFP病毒。
权利要求
1、一种互补型高容量腺病毒载体系统，包括一对互补的人类5型腺病毒载体， 其特征在于将人类5型腺病毒的基因组以不同的组合分配方式分布在两个载 体中。
2、 根据权利要求1所述的腺病毒载体系统，其特征在于分配方式为两端的ITR、 包装信号、早期E2基因及晚期转录基因L4和L5在一个载体上;两端的ITR、 包装信号及晚期转录基因L1， L2， L3，在另一个载体上。
3、 根据权利要求1所述的腺病毒载体系统，其特征在于分配方式为两端的ITR、 包装信号、E2基因及晚期转录单位在一个载体上；两端的ITR、包装信号及 E4基因在另一个载体上。
4、 根据权利要求1所述的腺病毒载体系统，其特征在于它们可以单独或者共同 携带外源基因，两个载体的容量之和最大可以达到40kb。
5、 根据权利要求1或4所述的腺病毒载体系统，其特征在于高容量腺病毒载体 中用优化的X-噬菌体基因组片段以及已有的非编码基因序列与非功能性序列 作为填充物。
6、 根据权利要求1或4所述的腺病毒载体系统，其特征在于高容量腺病毒载体 中用优化的X-噬菌体基因组片段以及人类基因组中非编码的基因序列与非功 能性序列作为填充物。
7、 根据权利要求1或4所述腺的病毒载体系统，其特征在于高容量腺病毒载体 中用合理排列组合的且优化过的人类2型腺病毒基因组DNA以及其它种属其 它血清型腺病毒基因组片段作为填充物。
8、 权利要求1所述载体系统构建的携带多种抗原基因的多价疫苗。
9、 权利要求1所述载体系统构建的携带治疗性基因的基因治疗产品。
10、 权利要求1所述载体系统构建的哺乳动物细胞表达载体。
全文摘要
本发明描述了一种互补型高容量腺病毒载体系统及其构建的疫苗和基因治疗产品。系统包括一对互补的腺病毒载体。该系统将人类5型腺病毒复制包装所必需的基因分布在两个载体中，它们相辅相成，协同彼此的复制与包装。它们可以分别或共同携带外源基因，两个载体外源基因容量之和最大可以达到40kb。该系统可以作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗载体以及基因治疗载体，适用于携带多种外源基因的多价疫苗以预防传染性疾病，也适用于携带多个治疗基因的基因治疗产品。本发明还优选了互补病毒中的填充序列，提高了腺病毒的包装效率和稳定性。
文档编号A61K47/46GK101363028SQ20071002657
公开日2009年2月11日 申请日期2007年1月26日 优先权日2007年1月26日
发明者锋 李, 凌 陈 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院