专利名称：治疗或预防hcv感染症的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有多球壳菌素和干扰素作为有效成分、用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物及其应用。
背景技术：
丙型肝炎(HCV)感染症通常引发慢性肝炎，常常导致肝硬化或肝细胞癌。携带者人数目前升高至全世界人口的约3％(～1亿7000万人)。由于HCV通过尚未明确的原因避开宿主的免疫机构，因此即使是免疫机构发达的成人感染时，也大多会发生持续感染，进行至慢性肝炎、肝硬化、肝癌。已知有很多患者即使通过手术摘除也由于在非癌症部位持续引起的炎症而使肝癌再发。
目前，已知对HCV感染症的最有效的治疗方法是PEG化干扰素(PEG-IFN)与利巴韦林(非专利文献1、2)的联合使用。但是，干扰素治疗有效的患者只占全部患者的1/3左右，特别是干扰素对于HCV基因型1b的奏效率非常低。因此，人们希望开发取代干扰素、或者可与其联合使用的抗HCV药物。其中，人们强烈希望开发与通过抗炎症药抑制炎症的对症疗法不同的、在患部肝脏处可以减少或根绝HCV的药物。
HCV是属于黄病毒科的单链RNA病毒。RNA基因组至少产生10个病毒蛋白，其中包含结构和非结构(NS)蛋白。前者参于HCV颗粒的形成。后者在HCV基因组复制中发挥重要作用(非专利文献3)。通常，NS蛋白质的复合物与高尔基体和内质网膜上的脂膜筏(lipid rafts)缔合，在此发生HCV感染(非专利文献4、5)。如上所述，脂膜筏聚合体被破坏，则可能抑制HCV的复制。
多球壳菌素(ISP-1)是鞘脂生物合成路径的第一阶段酶——丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)的特异性抑制剂(
图1，非专利文献6、7)。多球壳菌素由于其与鞘氨醇的结构的类似性而抑制SPT活性，由此引起细胞内鞘磷脂及其中间体二氢鞘氨醇、鞘氨醇、神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇(图1)减少。鞘磷脂是脂膜筏凝聚体的重要成分之一，因此SPT受到多球壳菌素抑制，则最终引发脂膜筏的破坏(非专利文献8)。
最近，Sakamoto等人分离了抑制HCV的亚基因组复制子的复制的化合物NA255(非专利文献9，专利文献1)。NA255与多球壳菌素结构上类似，已知可抑制SPT的酶活性，由此不会对HCV NS3(蛋白酶和解螺旋酶)或NS5B(RNA依赖性RNA聚合酶)的酶活性产生影响，而抑制HCV的复制。这样，HCV亚基因组复制子的复制受NA255抑制，反应出鞘脂、神经酰胺和鞘磷脂的量的减少。这些认识显示NA255破坏与HCV NS蛋白质缔合而成的脂膜筏凝聚体。
上述结果显示多球壳菌素显示抗HCV效果，但是对于多球壳菌素与干扰素的联合使用对于HCV复制的抑制显示怎样的效果，目前尚未明确。
与本申请的发明相关的先行技术文献信息如下所示。
专利文献1WO2006/016657 非专利文献1Glue，P.等人.，Hepatology，32，647～653(2000) 非专利文献2Reddy，K.R.等人.，Hepatology，33，433～438(2001) 非专利文献3Rosenberg，S.，J Mol Biol，313，451～464(2001) 非专利文献4Aizaki，H.等人.，Virology，324，450～461(2004) 非专利文献5Gao，L等人.，J Virol，78，3480～3488(2004) 非专利文献6Fujita，T.等人.，J Antibiot(Tokyo)，47，208～215(1994) 非专利文献7Miyake，Y.等人.，Biochem Biophys Res Commun，211，396～403(1995) 非专利文献8Simons，K.和Ikonen，E.，Nature，387，569～572(1997) 非专利文献9Sakamoto，H.等人.，Nat Chem Biol，1，333～337(2005)
发明内容
发明所要解决的课题 本发明是针对上述状况而设，其目的在于提供用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该组合物是将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物与干扰素组合而成。其目的还在于提供用于治疗或预防HCV感染症的方法，该方法包含将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素给予受治疗对象的步骤。
解决课题的方法 为解决上述课题，本发明人等首先对于在HCV亚基因组复制子细胞FLR3-1中多球壳菌素的抗HCV作用和细胞毒性进行了研究。结果表明，给予多球壳菌素对于细胞存活率或细胞增殖没有影响，但HCV复制活性用量依赖性地减少较多(图2A)。
接着，为了研究鞘脂代谢物与HCV复制的相关性，在多球壳菌素的存在下监控FLR3-1细胞中的鞘脂的从头生物合成。结果，神经酰胺和鞘磷脂的生成均用量依赖性地受到抑制，但作为鞘氨醇代谢产物的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的生成未受到影响(图2B)。为了确认HCV亚基因组复制子复制的抑制是否由于鞘脂的缺失而引发，在鞘脂生物合成途径中间体的存在下，对多球壳菌素的抗HCV效果进行了研究。结果表明，多球壳菌素对HCV复制的抑制是鞘脂生物合成被抑制的原因。
接着，使用具有感染了HCV基因型1a或1b的人源化肝脏的嵌合小鼠，研究多球壳菌素和/或干扰素的抗HCV效果。具体来说，将多球壳菌素和/或干扰素给予嵌合小鼠，检测血清和肝脏中的HCVRNA水平。结果表明，多球壳菌素对于由人源化肝脏表达的h-A1b没有影响，而是抑制HCV的复制。还表明，通过联合使用多球壳菌素和PEG-IFN，显示轻度的肝损伤，同时可协同地抑制HCV的复制。
并且，使用感染HCV基因型1b的嵌合小鼠，按照同样的方法研究式(III)所示的化合物和干扰素的抗HCV效果。结果，即使给予式(III)的化合物，HCV的复制也受到抑制，联合使用(III)的化合物和PEG-IFN，可以协同地抑制HCV的复制。
即，本发明人等发现作为SPT抑制剂的多球壳菌素或式(III)的化合物可以成为HCV感染症的新型治疗药，以及通过联合使用该SPT抑制剂和干扰素，可以获得更高的抑制HCV复制的效果，由此完成了本发明。
本发明更具体地提供以下的(1)～(42)。
(1)用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物是将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素组合而成。
(2)(1)所述的药物组合物，其中，用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物是组合剂。
(3)(1)所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物是将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物与干扰素联合使用。
(4)(3)所述的药物组合物，其特征在于将阻断鞘磷脂的生物合成过程的化合物与干扰素同时或依次给药。
(5)(3)所述的药物组合物，其特征在于将阻断鞘磷脂的生物合成过程的化合物与干扰素分别给药。
(6)用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物作为有效成分，其特征在于将所述组合物与干扰素联合使用。
(7)用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物作为有效成分，其特征在于将所述组合物与干扰素同时给药。
(8)用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物作为有效成分，其特征在于将所述组合物在干扰素给药前或给药后进行给药。
(9)用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有干扰素作为有效成分，其特征在于将所述组合物与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用。
(10)用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有干扰素作为有效成分，其特征在于将所述组合物与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物同时给药。
(11)用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有干扰素作为有效成分，其特征在于将所述组合物在阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物的给药前或给药后进行给药。
(12)(1)～(11)中任一项所述的药物组合物，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是阻断由棕榈酰CoA生物合成鞘磷脂的过程的化合物。
(13)(1)～(11)中任一项所述的药物组合物，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是以下的(a)或(b) (a)抑制参与由棕榈酰CoA生物合成3-酮二氢鞘氨醇的丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物 (b)抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物。
(14)(13)所述的药物组合物，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是多球壳菌素、Sphingofungin、以下式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)
[式中，A表示-(CH2)n-，其中，n表示0～10的整数； B表示-CH2-、-(C＝O)-、-CH(OH)-、-CH(NH2)-或-C(＝NOR)-，其中，R表示氢原子、碳原子数1～8的直链或支链状的烷基(可被氨基取代，该氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代)； D表示-(CH2)m-R’，其中，m表示0～10的整数，R’表示氢原子、直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、环烯基、可被取代的杂环基、可被取代的芳基、可被取代的杂芳基、-OX基(其中，X表示氢原子、或者直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、或可被取代的芳基)或卤素原子； E表示氢原子、或者直链或支链状的烷基； G表示-(CH2)p-J，其中，p表示0～4的整数，J表示氢、OH基、SH基、甲硫基、羧基、氨基甲酰基、氨基、胍基、直链或支链状的烷基、环烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基、或可被取代的杂芳基； 键Q表示单键或双键； R1、R2和R3可以相同或不同，表示羟基、氨基(可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代)、-OL、直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或直链或支链状的炔基，其中，L表示直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或直链或支链状的炔基]。
(15)(13)所述的药物组合物，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是下式(II)～(XII)中任一项所示的化合物或它们的药学上可接受的盐 式(II)
式(III)
式(IV)
式(V)
式(VI)
式(VII)
式(VIII)
式(IX)
式(X)
式(XI)
式(XII)
(16)(13)所述的药物组合物，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物是以下的(a)或(b) (a)与编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物互补的RNA； (b)具有特异性切割编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物的核酶活性的RNA。
(17)(1)～(11)中任一项所述的药物组合物，其中，干扰素是聚乙二醇化干扰素。
(18)(1)～(11)中任一项所述的药物组合物，其中，HCV感染症是丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化、或肝癌。
(19)治疗或预防HCV感染症的方法，该方法包含将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素给予受治疗对象的步骤。
(20)(19)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其特征在于将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素同时给予受治疗对象。
(21)(19)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其特征在于将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素分别给予受治疗对象。
(22)(19)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是阻断由棕榈酰CoA生物合成鞘磷脂的过程的化合物。
(23)(19)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是以下的(a)或(b) (a)抑制参与由棕榈酰CoA生物合成3-酮二氢鞘氨醇的丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物； (b)抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物。
(24)(23)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是多球壳菌素、Sphingofungin、以下式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)
[式中，A表示-(CH2)n-，其中，n表示0～10的整数； B表示-CH2-、-(C＝O)-、-CH(OH)-、-CH(NH2)-或-C(＝NOR)-，其中，R表示氢原子、碳原子数1～8的直链或支链状的烷基(可被氨基取代，该氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代)； D表示-(CH2)m-R’，其中，m表示0～10的整数，R’表示氢原子、直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、环烯基、可被取代的杂环基、可被取代的芳基、可被取代的杂芳基、-OX基(其中，X表示氢原子、或者直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、或可被取代的芳基)或卤素原子； E表示氢原子或者、直链或支链状的烷基； G表示-(CH2)p-J，其中，p表示0～4的整数，J表示氢、OH基、SH基、甲硫基、羧基、氨基甲酰基、氨基、胍基、直链或支链状的烷基、环烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基、或可被取代的杂芳基； 键Q表示单键或双键； R1、R2和R3可以相同或不同，表示羟基、氨基(可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代)、-OL、直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或直链或支链状的炔基，其中，L表示直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或直链或支链状的炔基]。
(25)(23)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是以下式(II)～(XII)中任一项所示的化合物或它们的药学上可接受的盐 式(II)
式(III)
式(IV)
式(V)
式(VI)
式(VII)
式(VIII)
式(IX)
式(X)
式(XI)
式(XII)
(26)(23)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物是以下的(a)或(b) (a)与编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物互补的RNA； (b)具有特异性切割编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物的核酶活性的RNA。
(27)(19)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，干扰素是聚乙二醇化干扰素。
(28)(19)所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，HCV感染症是丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化、或肝癌。
(29)阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用。
(30)阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用，其中该组合物与干扰素联合使用。
(31)阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用，其中该组合物与干扰素同时给药。
(32)阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用，其中该组合物在干扰素给药前或给药后进行给药。
(33)干扰素在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用，其中该组合物与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用。
(34)干扰素在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用，其中该组合物与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物同时给药。
(35)干扰素在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用，其中该组合物在阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物的给药前或给药后进行给药。
(36)(29)～(35)中任一项所述的应用，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是阻断由棕榈酰CoA生物合成鞘磷脂的过程的化合物。
(37)(29)～(35)中任一项所述的应用，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物为以下的(a)或(b) (a)抑制参与由棕榈酰CoA生物合成3-酮二氢鞘氨醇的丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物； (b)抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物。
(38)(37)中所述的应用，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是多球壳菌素、Sphingofungin、下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐 式(I)
[式中，A表示-(CH2)n-，其中，n表示0～10的整数； B表示-CH2-、-(C＝O)-、-CH(OH)-、-CH(NH2)-或-C(＝NOR)-，其中，R表示氢原子、碳原子数1～8的直链或支链状的烷基(可被氨基取代，该氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代)； D表示-(CH2)m-R’，其中，m表示0～10的整数，R’表示氢原子、直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、环烯基、可被取代的杂环基、可被取代的芳基、可被取代的杂芳基、-OX基(其中，X表示氢原子、或者直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、或可被取代的芳基)或卤素原子； E表示氢原子或者、直链或支链状的烷基； G表示-(CH2)p-J，其中，p表示0～4的整数，J表示氢、OH基、SH基、甲硫基、羧基、氨基甲酰基、氨基、胍基、直链或支链状的烷基、环烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基、或可被取代的杂芳基； 键Q表示单键或双键； R1、R2和R3可以相同或不同，表示羟基、氨基(可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代)、-OL、直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或直链或支链状的炔基，其中，L表示直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或直链或支链状的炔基]。
(39)(37)中所述的应用，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是以下式(II)～(XII)中任一项所示的化合物或它们的药学上可接受的盐 式(II)
式(III)
式(IV)
式(V)
式(VI)
式(VII)
式(VIII)
式(IX)
式(X)
式(XI)
式(XII)
(40)(37)所述的应用，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物是以下的(a)或(b) (a)与编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物互补的RNA； (b)具有特异性切割编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物的核酶活性的RNA。
(41)(29)～(35)中任一项所述的应用，其中，干扰素是聚乙二醇化干扰素。
(42)(29)～(35)中任一项所述的应用，其中，HCV感染症是丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化、或肝癌。
附图简述 图1是表示鞘脂的生物合成途径的图。丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)是途径中的起始酶。
图2是表示HCV复制子细胞中多球壳菌素的抗HCV效果的图和照片。(A)是表示在多球壳菌素存在下FLR3-1复制子细胞的萤光素酶活性和细胞存活率的图。实验分别至少进行三次。(B)是表示通过TLC监测鞘脂的从头生物合成的结果的照片。Cer神经酰胺，PS磷脂酰丝氨酸，PE磷脂酰乙醇胺，SM鞘磷脂。
图3是表示在多球壳菌素存在下HCV蛋白质表达的照片。(A)是表示在HCV复制子细胞中加入多球壳菌素时NS3蛋白质的表达受到抑制的蛋白质印迹的照片。(B)是表示在HCV复制子细胞中加入多球壳菌素时NS3蛋白质受到抑制的免疫染色的照片。
图4是表示感染了HCV基因型1b的嵌合小鼠中，多球壳菌素的抗HCV效果的图。(A)是表示嵌合小鼠的血清中HCV RNA水平的图。星号表示未检测出HCV RNA。(B)是表示嵌合的小鼠血清中人白蛋白浓度的图。
图5是表示多球壳菌素处置的嵌合小鼠的肝脏中，HCV RNA和核心蛋白的检测结果的图和照片。HCV RNA和核心蛋白在感染了HCV基因型1a的嵌合小鼠的肝脏中检出。1a-1未处置，1a-2未处置以及未感染，1a-3PEG-IFN处置，1a-4多球壳菌素处置。(A)是表示每1μg总RNA中的HCV RNA拷贝数和1mg总蛋白质中的HCV核心蛋白表达水平的图。星号表示未检测出HCV RNA或核心蛋白。(B)是表示嵌合小鼠肝脏中HCV核心蛋白和人肝细胞的免疫荧光染色结果的照片。由左分别表示人肝脏细胞、HCV核心蛋白以及核的染色结果。
图6是表示感染HCV基因型1b的嵌合小鼠中式(III)化合物的抗HCV效果的图。表示各给药组的嵌合小鼠在第8天和第14天的血清中的HCV RNA水平。
实施发明的最佳方式 本发明涉及用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物是将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物与干扰素组合而成。
本发明中，“用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物是将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物与干扰素组合而成”只要是在HCV感染症的治疗或预防中，为了将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素同时、分别、或依次给药而组合的药物组合物即可。本发明的药物组合物可以是在同一药物组合物中含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素的组合剂，也可以是在分别的药物组合物中含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素。还可以将含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物的药物组合物、与含有干扰素的药物组合物制成试剂盒。
其中，上述的“组合而成的用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物”中，在分别的药物组合物中含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素时，两个分别的制剂的剂型可以相同也可以分别不同。例如其中一方或两方可以是非口服制剂、注射剂、点滴剂、静脉内点滴剂。
如上所述的对于在HCV感染症的治疗或预防中使用的上述组合制剂进一步组合一个以上的制剂而得到的制剂也包含在上述“组合而成的用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物”中。
本发明还涉及用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物作为有效成分，其特征在于将所述组合物与干扰素联合使用。在将本药物组合物与干扰素联合使用时，可以与干扰素同时给药，也可以在干扰素给药前或给药后给予本药物组合物。
本发明还涉及用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该组合物含有干扰素作为有效成分，其特征在于将所述组合物与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用。在将干扰素与本药物组合物联合使用时，可以与本药物组合物同时给药，也可以在本药物组合物给药前或给药后给予干扰素。
本发明中，鞘磷脂生物合成过程更优选由棕榈酰CoA生物合成鞘磷脂的过程(图1)。
本发明中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物只要可直接或间接地抑制参与由棕榈酰CoA生物合成鞘磷脂的过程的生物体内反应即可，可以是任何化合物。可以是抑制参与鞘磷脂生物合成过程的酶的活性的化合物，也可以是抑制参与生物合成的酶的表达的化合物，还可以是生成或增加这些抑制剂的化合物，或者是间接抑制参与生物合成的酶的化合物。
本发明的化合物是否阻断鞘磷脂的生物合成过程，这可以通过测定鞘磷脂生物合成的50％抑制浓度(IC50)值来判断。对该化合物并没有限定，只要是阻断鞘磷脂生物合成过程的结果是最终使通常的鞘磷脂生物合成的IC50值优选1μM以下、进一步优选100nM以下、最优选50nM以下的化合物即可。鞘磷脂生物合成的IC50值可以通过本领域技术人员使用的任意的测定方法来测定，例如使细胞摄取(14C)丝氨酸，测定其在脂类中的量的方法(Nat Chem Biol.2005 Nov；1(6)333～7.Epub 2005 Oct 16)，或者是使用HCV亚基因组复制子细胞，通过萤光素酶分析来测定该化合物抑制HCV RNA复制的活性的方法(实施例1，Nat Chem Biol.2005 Nov；1(6)333～7.Epub 2005 Oct 16)等。
本发明中，参与鞘磷脂生物合成过程的酶例如有丝氨酸棕榈酰转移酶、3-酮二氢鞘氨醇还原酶、二氢鞘氨醇-N-酰基转移酶、二氢神经酰胺去饱和酶、鞘磷脂合成酶等(图1)，优选丝氨酸棕榈酰转移酶。
本发明的化合物例如有阻断鞘脂生物合成过程的初级阶段—由棕榈酰CoA生物合成3-酮二氢鞘氨醇的过程的化合物。阻断该生物合成过程的化合物例如有抑制参与该生物合成的丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物、或抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物。
本发明的抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物只要是抑制该酶活性即可，可以是任何化合物。
本发明的化合物是否抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性，这可通过测定丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的50％抑制浓度(IC50)值来判断。对该化合物并没有限定，只要是使丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的IC50值优选1μM以下、进一步优选100nM以下、最优选50nM以下的化合物即可。丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的IC50值可通过本领域技术人员所使用的任意的测定方法来测定，例如可以使细胞摄取(14C)丝氨酸，测定其在脂类中的量的方法(Nat Chem Biol.2005 Nov；1(6)333～7.Epub 2005 Oct 16)。
本发明中，作为抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物，优选多球壳菌素、Sphingofungin、以下式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
式(I)
式中，A表示-(CH2)n-，其中，n表示0～10的整数； B表示-CH2-、-(C＝O)-、-CH(OH)-、-CH(NH2)-或-C(＝NOR)-，其中，R表示氢原子、碳原子数1～8的直链或支链状的烷基(可被氨基取代，该氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代)； D表示-(CH2)m-R’，其中，m表示0～10的整数，R’表示氢原子、直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、可被取代的杂环基、可被取代的芳基、可被取代的杂芳基、-OX基(其中，X表示氢原子或者、直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、或可被取代的芳基)或卤素原子； E表示氢原子、或者直链或支链状的烷基； G表示-(CH2)p-J，其中，p表示0～4的整数，J表示氢、OH基、SH基、甲硫基、羧基、氨基甲酰基、氨基、胍基、直链或支链状的烷基、环烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基、或可被取代的杂芳基； 键Q表示单键或双键； R1、R2和R3可以相同或不同，表示羟基、氨基(可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代)、-OL、直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或者直链或支链状的炔基，其中，L表示直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或者直链或支链状的炔基。
本发明中，直链或支链状的烷基除本说明书中特别定义的情况之外，是指碳原子数1～12的直链或支链状的烃基，优选碳原子数1～7的直链或支链状的烃基。例如有甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、庚基等。环烷基是指碳原子数3～8的环状烃基。例如有环戊基、环己基、环庚基、环己烯基等。直链或支链状的烯基是指碳原子数2～8的直链或支链状的烃基，至少含有一个双键。例如有乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、2-丁烯基、2-乙烯基-2-丁烯基等。直链或支链状的炔基是指碳原子数2～8的直链或支链状的烃基，含有至少一个三键。例如有乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、3-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、4-己炔基、2-癸炔基、6，6-二甲基-庚-2，4-二炔-1-基等。
本说明书中所述的杂环基是指含有独立选自氮原子、硫原子和氧原子的1～4个杂原子(优选1或2个)作为环元的4～6元单环或7～10元二环的环式基团(优选单环基团)，至少具有一个双键的基团，具体例子有衍生自吡喃、吗啉、四氢呋喃、二氢呋喃、四氢吡喃、二氢吡喃、1，3-二噁烷、哌嗪、哌啶、硫代吗啉等的基团。
本说明书中所述的芳基是指具有芳族性的单环或多环的烃基。具体例子有衍生自苯、萘、蒽、芴等的基团。
本说明书中所述的杂芳基是指具有芳族性、含有独立选自氮原子、硫原子和氧原子的1～4个杂原子(优选1或2个)作为环元的4～6元单环或7～10元二环的环式基团(优选单环基团)。具体例子有衍生自呋喃、噻吩、吡咯、二唑、吡啶、噻唑、咪唑、嘧啶、吲哚、喹啉、噁唑、异噁唑、吡嗪、三唑、噻二唑、四唑、吡唑等的基团。
本说明书中所述的芳烷基是指被上述芳基取代的上述直链或支链状的烷基，具体例子有苄基、苯乙基等。
本说明书中所述的杂芳基烷基是指被上述杂芳基取代的上述直链或支链状的烷基。
本说明书中所述的酰基是指经由羰基键合的上述直链或支链状的烷基、芳基、杂芳基、或杂环基。
本说明书中所述的“可被取代”除本说明书特别定义的情形之外，是指上述附记的基团可被直链或支链状的烷基、直链或支链状的烷氧基、直链或支链状的烯基、直链或支链状的烯氧基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的炔氧基、环烷基、环烷氧基、氰基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、卤素原子、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、芳烷基、芳烷氧基、氨基(可被直链或支链状的烷基一或二取代)、酰基、直链或支链状的烷基磺酰基、氨基甲酰基、直链或支链状的烷硫基、羧基、直链或支链状的烷基羰基、甲酰基、氨基磺酰基等基团取代。这些取代基中所含的芳基和杂芳基部分可以进一步被卤素原子、直链或支链状的烷基、直链或支链状的烷氧基、直链或支链状的烯基、直链或支链状的烯氧基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的炔氧基、环烷基、环烷氧基、氰基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、卤素原子、芳基、芳氧基、杂芳基、芳烷基、芳烷氧基、可被直链或支链状的烷基一或二取代的氨基、酰基、直链或支链状的烷基磺酰基、直链或支链状的烷氧基、氨基甲酰基、直链或支链状的烷硫基、羧基、直链或支链状的烷基羰基、甲酰基、氨基磺酰基等。
式(I)所示的化合物的药学上可接受的盐可通过使该化合物与可用于药物制备的酸或碱接触来制备。上述盐只要是药理学上可接受的即可，没有特别限定，例如有与盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸等无机酸的盐；与乙酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、樟脑磺酸等有机酸的盐；与钠、钾、钙等碱金属或碱土类金属等的盐等。
该盐包含该化合物可形成的水合物或溶剂合物。式(I)所示的化合物以游离体获得时，可按照常规方法变换成该化合物可形成的盐或它们的水合物或溶剂合物的状态。
本发明的式(I)所示化合物可按照国际公开公报WO2004/071503、WO2005/005372或WO2006/016657中所述的方法进行合成。
本发明的式(I)所示化合物的优选例子有以下化合物。
本发明的式(I)所示化合物的更优选的例子可以是式(II)～(XII)中任一项所示的化合物。
式(II)
式(III)
式(IV)
式(V)
式(VI)
式(VII)
式(VIII)
式(IX)
式(X)
式(XI)
式(XII)
本发明的抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物可以是与编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物互补的RNA、或特异性切割该转录产物的核酶。本发明中，对被抑制表达的丝氨酸棕榈酰转移酶的来源没有特别限定，优选来自哺乳动物，更优选来自人。编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA也包含含有SEQ ID NO.3或5(LCB1或LCB2)的核苷酸序列的DNA；编码含有SEQ ID NO.4或6的氨基酸序列的蛋白质的DNA；以及编码含有在SEQ ID NO.4或6的氨基酸序列中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的氨基酸序列的蛋白质的、来自天然的DNA等。“含有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的氨基酸序列的蛋白质”与天然型蛋白质具有同等的功能，且具有高同源性。高同源性是指在氨基酸序列全体中，至少50％以上、更优选70％以上、进一步优选90％以上(例如95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列相同性。
上述来自天然的DNA是与含有SEQ ID NO.3或5的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。杂交的条件可由本领域技术人员适当选择。杂交后的清洗中，例如为42℃、5×SSC、0.1％SDS的条件，优选50℃、5×SSC、0.1％SDS的条件。更优选的杂交条件例如是65℃、0.1×SSC和0.1％SDS的条件。
本发明的“抑制酶的表达”的描述包含抑制基因的转录和抑制翻译成蛋白质。不只包含DNA表达的完全停止，也包含表达的减少。
与编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物互补的RNA更优选SEQ ID NO.1和2所示的siRNA。
本发明的“与编码酶的DNA的转录产物互补的RNA”的一个方式是与编码酶的DNA转录产物互补的反义RNA。
反义核酸抑制靶基因表达的作用存在以下多个因素。即，通过形成三链而抑制转录起始；与通过RNA聚合酶局部形成开环结构的位点形成杂交，由此抑制转录；与正在合成的RNA形成杂交，由此抑制转录；在内含子和外显子的接合点处形成杂交，由此抑制剪切；与形成剪切体的位点形成杂交，由此抑制剪切；与mRNA形成杂交，由此抑制由核向细胞质的转移；与加帽位点或聚(A)附加位点形成杂交，由此抑制剪切；与翻译起始因子结合位点形成杂交，由此抑制翻译的起始；与起始密码子附近的核蛋白体结合位点形成杂交，由此抑制翻译；与mRNA翻译区或核糖体结合位点形成杂交，由此抑制肽链的延伸；与核酸和蛋白质相互作用位点形成杂交，由此抑制基因表达等。这些因子通过抑制转录、剪切或翻译的过程，来抑制靶基因的表达。
本发明中使用的反义序列可以通过上述任何作用抑制靶基因的表达。作为其中的一个方式，如果设计与基因mRNA的5′端附近的非翻译区互补的反义序列，则可以有效抑制基因的翻译。也可以使用与编码区或3′一侧非翻译区互补的序列。因此，用于本发明中的反义DNA不仅包含基因的翻译区、也包含非翻译区的序列的反义序列的DNA。所使用的反义DNA与适当的启动子的下游连接，优选包含转录终止信号的序列与3′一侧连接。这样，所制备的DNA可通过公知的方法转化至所需的植物。反义DNA的序列优选为与要转化的植物所具有的内源性基因或与其一部分互补的序列，只要可有效地抑制基因的表达，也可以完全不互补。所转录的RNA与作为靶的基因的转录产物优选具有90％以上、最优选95％以上的互补性。使用反义序列有效地抑制靶基因的表达时，反义DNA的长度至少为15个碱基以上，优选100个碱基以上，进一步优选500个碱基以上。通常使用的反义DNA的长度比5kb短，优选比2.5kb短。
“与编码酶的DNA的转录产物互补的RNA”的另一个方式是与编码酶的DNA的转录产物互补的dsRNA，包含RNAi技术。RNAi是指将具有与靶基因序列相同或类似的序列的双链RNA(以下称为dsRNA)导入细胞内，则导入的外源基因和目标内源性基因的表达均受到抑制的现象。如果向细胞内导入约40～数百个碱基对的dsRNA，则具有解螺旋酶结构域的被称为Dicer的RNaseIII样核酸酶在ATP存在下分别由3′末端切出约21～23个碱基对的dsRNA，产生siRNA(短干扰RNA)。特异性的蛋白与该siRNA结合，形成核酸酶复合物(RISCRNA诱导的沉默复合物)。该复合物与siRNA同样，识别序列并结合，通过RNaseIII样酶活性，在siRNA的中央部切割靶基因的mRNA。还有与该途径不同的以下途径siRNA的反义链与mRNA结合，发挥RNA依赖性RNA聚合酶(RsRP)的引物的作用，合成dsRNA。该dsRNA再次成为Dicer的底物，生成新的siRNA，使作用放大。
本发明的RNA可通过编码与目标基因mRNA的任何区域所对应的反义RNA的反义编码DNA和编码目标基因mRNA的任何区域的有义RNA的有义编码DNA表达。由这些反义RNA和有义RNA可以制备dsRNA。
在载体等中保有本发明的dsRRNA的表达系统时的构成有以下的情形由同一载体表达反义RNA、有义RNA的情形；由不同的载体分别表达反义RNA、有义RNA的情形。例如，由同一载体表达反义RNA、有义RNA的构成可如下构成分别构建可使分别如pol III系的可表达短RNA的启动子与反义编码DNA和有义编码DNA的上游连接而成的反义RNA表达盒、有义RNA表达盒，将这些盒沿相同方向或相反方向插入到载体中。还可以构成将反义编码DNA和有义编码DNA相反配置，使其在不同的链上相对的表达系统。该构成中，具备编码反义RNA的链和编码有义RNA的链成对构成的一个双链DNA(编码siRNA的DNA)，在其两侧分别相对向具备启动子，可由各链表达反义RNA、有义RNA。这种情况下，为了避免有义RNA、反义RNA的下游附加多余的序列，优选在各链(编码反义RNA的链、编码有义RNA的链)的3′末端分别具备终止子。该终止子可以使用使4个以上A(腺嘌呤)碱基连续的序列等。该回文形式的表达系统中，优选使两种启动子的种类不同。
另外，由不同的载体表达反义RNA、有义RNA的构成例如可以如下分别构建如pol III系的可表达短RNA的启动子与例如反义编码DNA和有义编码DNA的上游分别连接而成的反义RNA表达盒、有义RNA表达盒，将这些盒保持在不同的载体中。
本发明的RNAi中，dsRNA可以使用siRNA。“siRNA”是指在细胞内不显示毒性的范围的含有短链的双链RNA，例如可以制成15～49个碱基对、优选15～35个碱基对、进一步优选21～30个碱基对。或者，转录要表达的siRNA后使最终的双链RNA部分的长度为例如15～49个碱基对、优选15～35个碱基对，进一步优选21～30个碱基对。
RNAi中使用的DNA无需与靶基因完全相同，但至少具有70％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的序列的同源性。
dsRNA中的RNA之间配对的双链RNA的部分无需完全配对，可以含有由于错配(对应的碱基不互补)、凸起(没有对应于其中一条链的碱基)等而形成的不配对的部分。本发明中，dsRNA中的RNA之间配对的双链RNA区域中也包含凸起和错配两种。
本发明的“抑制酶的表达”还可以利用编码核酶的DNA来进行。核酶是指具有催化活性的RNA分子。这些核酶具有各种活性，其中，通过对切割RNA的酶—核酶的研究，可以设计出以RNA位点特异性切割为目的的核酶。核酶例如有I型内含子或在RNaseP中所含的MlRNA的400个核苷酸以上大小的类型，也有具有被称为锤头型或发夹型的40个核苷酸左右的活性结构域的类型。
例如，锤头型核酶的自切割结构域切割G13U14C15的C15的3′一侧，对于活性来讲，U14与第9位的A形成碱基对是很重要的，第15位的碱基除C之外也可以被A或U切割。如果设计成将核酶的底物结合部位与目标位点附近的RNA序列互补，则可以制备识别目标RNA中的UC、UU或UA等序列的限制酶性RNA切割核酶。例如，作为抑制目标的本发明的酶的编码区中有多个可成为目标的位点存在。
发夹型核酶对本发明的目的也是有用的。发夹型核酶例如发现了烟草环斑病毒的卫星RNA的负链(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。该核酶也显示可以设计成发生靶特异性的RNA切割。
设计成可以切割目标的核酶与花椰菜花叶病毒35S启动子等启动子和转录终止序列连接，使其可在植物细胞中转录。但是，此时如果在转录的RNA的5′末端或3′末端附加多余的序列，则核酶的活性丧失。此时，为了从被转录的、包含核酶的RNA中只正确地切出核酶部分，可以在核酶部分的5′一侧或3′一侧配置用于进行修剪的、顺式作用的其它的修剪核酶(K.Taira等人.(1990)Protein Eng.3733；A.M.Dzianott和J.J.Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823；C.A.Grosshands和R.T.Cech(1991)Nucleic Acids Res.193875；K.Taira等人.(1991)Nucleic Acid Res.195125)。另外，将上述构成单元串联排列，可切割目标基因内的多个位点，可以进一步提高效果(N.Yuyama等人.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271(1992))。使用该核酶特异性切割本发明中作为目标的基因的转录产物，则可以抑制该基因的表达。
本发明中，“干扰素”是指具有通过病毒、双链RNA、凝集素等，由动物细胞诱发的抗病毒作用的蛋白质或糖蛋白的总称。除抗病毒作用之外，还具有抑制细胞增殖作用、免疫调节作用。它们根据生成细胞、与特异性受体的结合能力、生物、物理化学性质而被分成多种类型，主要分类为α、β、γ，除此之外还已知存在IFNω、IFNτ。并且已知干扰素α中存在20种以上的亚型。目前不仅有天然型，还有PEG干扰素、组合干扰素等各种基因重组型的制剂也得到开发、上市。
本发明中的干扰素可以是上述类型的任意一种，优选α或γ。本发明中的干扰素只要通过与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用，可以增强抑制HCV增殖的能力即可，可以是天然型、人工变异的基因重组型、天然存在的突变体、融合蛋白或它们的片段等任意形式。另外，本发明的干扰素可以进行PEG(聚乙二醇)化。干扰素的PEG化可按照本领域技术人员公知的方法(日本特许2980569号)来进行。
对本发明中的干扰素的来源没有特别限定，例如可来自人、黑猩猩、猩猩、狗、马、绵羊、山羊、驴、猪、猫、小鼠、豚鼠、大鼠、兔等，但并不限于此，也可以来自其它哺乳动物。优选来自人的干扰素。
人干扰素α或γ的氨基酸序列是公知的，例如干扰素α可以使用GenBankNM_0240013的氨基酸序列，干扰素γ可以使用GenBankNM_000619的氨基酸序列，干扰素α的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，干扰素γ的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，该γ的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。上述干扰素可通过本领域技术人员所公知的方法来制备。例如按照公知的方法如下制备由来自人的干扰素生成细胞制备mRNA，制备cDNA文库，由该cDNA文库中选择在严格条件下与含有SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10的核苷酸序列的全部或部分核苷酸序列的探针杂交的cDNA，使用适当的宿主-载体系统，使该cDNA表达，纯化所得蛋白质。宿主-载体系统可以从后述的可用于抗体制备的宿主-载体系统的例子中选择。或者根据SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10的核苷酸序列，设计引物，以由来自人的干扰素生成细胞制备的mRNA为模板，使用上述引物实施RT-PCR，然后表达所得的cDNA。
上述严格的杂交条件可由本领域技术人员适当选择。一个例子是在含有25％甲酰胺、更严格的条件是50％甲酰胺、4×SSC、50mM HepespH7.0、10×Denhardt溶液、20μg/mL改性鲑鱼精子DNA的杂交溶液中、在42℃下预杂交过夜，然后添加标记的探针，在42℃下保温过夜，进行杂交。之后在清洗中的清洗液和温度条件可以按照“1×SSC、0.1％SDS、37℃”的程度，更严格的条件是“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”的程度，进一步严格的条件是“0.2×SSC、0.1％SDS、65℃”的程度实施。这样，杂交的清洗条件越严格，则越有望分离与探针序列具有高同源性的多核苷酸。但是，上述SSC、SDS和温度条件的组合只是举例，本领域技术人员可以通过适当组合决定杂交的严格性的上述因素或者其它要素(例如探针浓度、探针的长度、杂交反应时间等)，来实现与上述同样的杂交。
利用上述杂交技术分离的多核苷酸所编码的多肽通常是氨基酸序列与本发明人等所鉴定的多肽具有高同源性。高同源性是指至少具有40％以上、优选60％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、更进一步优选至少95％以上、又进一步优选至少97％以上(例如98～99％)的序列同源性。氨基酸序列的相同性可通过例如Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.872264～2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873～5877，1993)确定。根据该算法开发了被称为BLASTX的程序(Altschul等人.，J.Mol.Biol.215403～410，1990)。通过BLASTX进行氨基酸序列分析时，参数例如可以是score(分值)＝50，wordlength(字长)＝3。使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各程序的缺省参数(default parameters)。这些分析方法的具体方法是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
不限于上述序列的干扰素，与上述序列的干扰素类似的多肽只要可通过与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用来增强抑制HCV增殖的能力即可，均适用于本发明。上述多肽有是含有在SEQID NO.7的氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换、附加和/或插入而得到的氨基酸序列的多肽，通过与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用，具有高的抑制HCV增殖的能力；是含有在SEQ IDNO.9的氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换、附加和/或插入而得到的氨基酸序列的多肽，通过与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用，具有高的抑制HCV增殖的能力；是含有由与SEQ IDNO.8的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的多肽，通过与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用、具有高的抑制HCV增殖的能力；是含有由与SEQ ID NO.10的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的多肽，通过与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用、具有高的抑制HCV增殖的能力。
上述多肽可通过本领域技术人员周知的方法来制备。例如，可如下制备以SEQ ID NO.8或10的核苷酸序列的全部或部分作为探针，从由干扰素生成细胞制备的cDNA文库中选择杂交的克隆，使其表达。或者对SEQ ID NO.8或10的核苷酸序列实施PCR的诱变导入法或盒突变法等本领域技术人员所周知的基因变异方法，位点专一性或随机导入突变来制备。或者通过市售的核酸合成装置合成向SEQ ID NO.8或10的核苷酸序列中导入了突变的序列。
本说明书中，“治疗”的术语是指通过对受试者给予本发明的药物，可以消除或者减少HCV，并抑制HCV的扩散，减轻因感染HCV而引起的症状。“预防”的术语是指在感染HCV之前给予受试者，防止HCV的感染、或抑制增殖。因感染HCV而引起的症状有丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝癌等。
本发明中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物与干扰素的联合使用是指将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物与干扰素一起给药或使用(以下简称为“给药”)，给药的顺序或给药间隔等并不受限定。也可以以将本发明的化合物和干扰素组合而成的试剂盒的形式实施。并且，在将本发明的化合物与干扰素联合使用时，与单独使用其中一种相比，可以根据需要减少分别的给药量。
本发明的化合物与干扰素的给药顺序可以是给予该化合物后给予干扰素、同时给予该化合物和干扰素、给予干扰素后给予该化合物的任意顺序。
分别给予本发明的化合物和干扰素时，对于该化合物和干扰素的给药间隔没有特别限定，可以考虑给药途径或剂型等因素来设定。例举给药间隔的一个例子，通常是0小时～168小时，优选0小时～72小时，进一步优选0小时～24小时，更进一步优选0小时～12小时。
对干扰素的给药间隔没有限定，但通常是1日1次～1月1次，优选1周1次。对阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物的给药间隔没有限定，但通常是1日1次～2月1次，优选1日1次～1月1次。
分别给予本发明的化合物和干扰素时，给药方法或每天的给药次数可以相同或不同。并且，对本发明的化合物与干扰素的重量比也没有特别限定。
本发明的化合物可以直接或者是以其药理学上可接受的盐的形式用作药物。上述盐只要是药理学上可接受的盐即可，没有特别限定，例如有与盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸等无机酸的盐；与乙酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、樟脑酸等有机酸的盐；与钠、钾、钙等碱金属或碱土类金属等的盐等。
对上述药物制剂中所含的有效成分化合物的量没有特别限定，可以在广范围内适当选择，例如为0.1～99.5％(重量)，优选0.5～90％(重量)。
可以按照常规方法，以本发明的化合物作为主药，使用赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、溶解助剂、混悬剂、包衣剂等的在药物制剂技术领域中通常使用的已知的助剂来制成制剂。成型为片剂形态时，载体可以广泛使用该领域中以往公知的物质，例如有乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸等赋形剂；水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶溶液、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等粘结剂；干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉末、海带多糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖等崩解剂；蔗糖、硬脂酸、可可脂、氢化油等崩解抑制剂；季铵盐类、月桂基硫酸钠等吸收促进剂；甘油、淀粉等保湿剂；淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶态硅酸等吸附剂；纯化滑石粉、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等润滑剂等。
片剂还可以根据需要制成通常实施包衣的片剂，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶包衣片、薄膜包衣片或双层片、多层片。成型为丸剂的形态时，载体可以广泛使用该领域中以往已知的物质，例如有葡萄糖、乳糖、可可脂、淀粉、氢化植物油、高岭土、滑石粉等赋形剂；阿拉伯树胶粉末、黄蓍胶粉末、明胶、乙醇等粘结剂；海带多糖琼脂等崩解剂等。成型为栓剂的形态时，载体可以广泛使用该领域中以往公知的物质，例如有聚乙二醇、可可脂、高级醇、高级醇的酯类、明胶、半合成甘油等。制备成注射剂时，溶液剂和混悬剂均被灭菌、且优选与血液等渗，成型为这些溶液剂、乳液剂和混悬剂的形态时，可使用在该领域中作为稀释剂所常用的任何物质，例如有水、乙醇、丙二醇、环氧化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯等。这种情况下，可以在药物制剂中含有制备等渗性溶液所足够量的食盐、葡萄糖或甘油，还可以添加通常的溶解助剂、缓冲剂、止痛剂等。可以进一步根据需要含有着色剂、防腐剂、香料、风味剂、甜味剂等或其它药物。
上述药物组合物优选以给药单位的形式给药，可以是口服给药、组织内给药(皮下给药、肌内给药、静脉内给药等)、局部给药(经皮给药等)或经直肠给药。上述药物组合物当然可以以适合这些给药方法的剂型进行给药。
将本发明的化合物等或其制药上可接受的盐作为药物给药时，作为抗病毒剂的用量可以在考虑了年龄、体重等患者的状态、给药途径、疾病的性质和程度等的基础上进行调节，通常对于成人，本发明的有效成分量每天为0.1～2000mg范围。也有低于上述范围的用量即足够的情形，同时也有必须超过上述范围的用量的情形。大量给药时优选每天分数次给药。
上述口服给药可以以固形、粉末或液状的用量单位进行给药，例如可通过粉末制剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、糖浆剂、舌下制剂、其它剂型等进行。
上述组织内给药可通过使用溶液或混悬剂等皮下、肌内或静脉内注射用的液状用量单位形式进行。它们可以是将一定量的本发明的化合物或其制药上可接受的盐例如悬浮或溶解于水性或油性介质等适合注射目的的非毒性的液状载体中，接着对上述混悬液或溶液进行灭菌来制备。
上述局部给药(经皮给药等)可以通过使用例如溶液剂、乳膏剂、粉末制剂、糊剂、凝胶剂、软膏剂等外用制剂的形式进行。它们可以通过将一定量本发明的化合物或其制药上可接受的盐与适合于外用制剂目的的香料、着色剂、填充剂、表面活性剂、保湿剂、皮肤软化剂、凝胶剂、载体、防腐剂、稳定剂等其中的一种以上组合来制备。
上述经直肠给药可以使用栓剂等进行，所述栓剂是将一定量的本发明的化合物或其制药上可接受的盐与含有例如棕榈酸肉豆蔻酯等高级酯类、聚乙二醇、可可脂、它们的混合物等的低熔点固体中混合而制成。
上述给药可通过使用溶液或混悬剂等的皮下、肌内或静脉内注射用的液状用量单位形式进行。它们可以是将一定量的本发明的化合物或其制药上可接受的盐悬浮或溶解于例如水性或油性的介质等适合于注射目的的非毒性的液状载体中，接着对上述悬浮液或溶液灭菌来制备。
本说明书中引用的所有的先行技术文献均作为参照引入到本说明书中。
实施例 以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
[实施例1]SPT抑制剂多球壳菌素的抗HCV作用 本发明人等对于HCV亚基因组复制子细胞FLR3-1中的多球壳菌素的抗HCV作用和细胞毒性进行了研究。
首先，将多球壳菌素(Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国)加入到HCV亚基因组复制子细胞FLR3-1(基因型1b，Con-1，Sakamoto，H.等人.，Nat Chem Biol，1，333～337(2005))的增殖培养基中，使终浓度为0.2、1.0、3.9、15.6或62.5nM。培养72小时后，本发明人等使用Birght-Glo萤光素酶测定试剂盒(Promega，麦迪逊，威斯康星，美国)进行萤光素酶测定。
另外将多球壳菌素加入到FLR3-1细胞中，培养72小时，然后使用Tetra Color One试剂盒(Seikagakukogyo，东京，日本)，按照制备商的说明书测定细胞存活率。
结果表明，多球壳菌素不会对细胞存活率(图2A)或细胞增殖(未给出数据)有影响，而是使萤光素酶活性用量依赖性地大幅降低。最大抑制率是在62.5nM多球壳菌素存在下约为80％(图2A)，50％抑制浓度(IC50)约为5.8nM(表1)。
(表1)多球壳菌素的IC50
在HCV复制中发挥重要作用的NS3蛋白质的减少也同样，可通过免疫印迹分析和免疫荧光染色确认，显示多球壳菌素具有强烈的抗HCV效果(图3)。
[实施例2]鞘脂代谢物与HCV复制的相关性 为了研究鞘脂代谢物与HCV复制的相关性，本发明人等对于在多球壳菌素的存在下的FLR3-1细胞中的从头生物合成鞘脂进行监控。
首先，将FLR3-1细胞在Opti-MEM(Invitrogen)中与[14C]丝氨酸(0.5μCi/mL)一起培养2小时。用0.1％SDS溶解细胞，然后将总脂类用氯仿/甲醇(12v/v)提取。将提取物在硅胶60薄层色谱(TLC)板(Merck，达姆施塔特，德国)上点样，通过乙酸甲酯/1-丙醇/氯仿/甲醇/0.25％KCl(252525109，v/v)进行色层分析。通过BAS 2000检测放射活性点样(Fuji Film，神奈川，日本)。
结果，神经酰胺和鞘磷脂的生成均用量依赖性地受到抑制，而作为鞘氨醇代谢产物的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的生成则未受影响(图2B)。
为了确认对HCV亚基因组复制子复制的抑制是否由于鞘脂的缺失而引发，本发明人等在鞘脂生物合成途径的中间体二氢鞘氨醇、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇的存在下、对多球壳菌素的抗HCV效果进行了研究(图1)。
将FLR3-1细胞与1或2.5μM鞘脂中间体(二氢鞘氨醇、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇)一起培养，加入连续稀释的多球壳菌素。72小时后，通过萤光素酶分析测定各组合的IC50。
由此可知，HCV复制子的复制能力由于鞘脂生物合成的中间体分子的补充而恢复(表1)。该结果表明，多球壳菌素抑制复制的原因是抑制了鞘脂的生物合成。
[实施例3]在感染HCV的嵌合小鼠中多球壳菌素和PEG-IFN的抗HCV效果 使用感染HCR6(基因型1b)、具有人源化肝脏的嵌合小鼠研究多球壳菌素的抑制能力。使用的嵌合小鼠是外购的(株式会社PhoenixBio，广岛，日本)。
具体来说，按照表2，通过腹腔内或皮下注射，将多球壳菌素和/或PEG-IFN(Chugai，东京，日本)给予感染了HCV基因型1b(HCR6，登记编号(accession number)AY045702)的小鼠，采集血液。
(表2)感染HCV基因型1b的嵌合小鼠的给药安排
表2中，B、I和M显示各操作根据需要进行，并显示试剂的给予是从第0天开始。以30μg/kg注射PEG-IFN。注射的多球壳菌素的量根据小鼠的体重进行调节。给药是以1mg/kg(M)开始，体重减少10％时，使用量减少至0.5mg/kg(M1/2)。体重减少20％则终止给药。
接着，使用AGPC法，从由嵌合小鼠采集的1μL血清或肝组织中纯化总RNA。HCV RNA可使用本领域技术人员公知的方法(Takeuchi，T.等人.，Gastroenterology，116，636～642(1999))，通过实时PCR定量。
结果，在多球壳菌素处置组中，HCV RNA水平8天内在血清中由3×106～1×107个拷贝/mL减少至6×105～1×104个拷贝/mL(约减少1/10～1/100倍)。同水平的减少在注射比临床治疗应用时(30μg/kg体重)多10倍量的PEG-IFN的PEG-IFN处置组中可见。并且，通过多球壳菌素与PEG-IFN的联合治疗，HCV RNA水平减少为对照水平的不足1/1000，3只小鼠中有2只(1b-7和1b-9)在第8天完全未检测出HCVRNA(图4A)。
同时，本发明人等对人白蛋白(h-A1b)浓度进行了监控。人白蛋白浓度是使用A1b-II试剂盒(Eiken Chemical，东京，日本)，按照制备商的说明书，在2μL血清中测定。结果，仅限于联合治疗组可见人白蛋白浓度的稍许减少(图4B)。
由这些结果可知，多球壳菌素对于由人源化肝脏表达的h-A1b没有影响，而直接抑制HCV的复制。另外，还明确通过多球壳菌素与PEG-IFN的联合使用，虽然显示轻度的肝损伤，但可以协同性抑制HCV的复制。
[实施例4]嵌合小鼠肝脏中HCV RNA和核心蛋白的检测 为了明确HCV是否由于多球壳菌素而在人源化肝脏中减少，本发明人等对于感染另外一种HCV基因型1a(HCG9)的嵌合小鼠的肝脏进行了研究。该小鼠的血清中的RNA水平达到约1×108个拷贝/mL，比HCVlb(HCR6)的值高10倍(图5A)。由此可认为，肝细胞中的HCV核心蛋白可容易地通过免疫荧光染色检测。本发明人等每天对嵌合1a-4小鼠给予2mg/kg多球壳菌素，共给药6天，然后摘除肝脏。为了进行比较，同样摘除未处置(1a-1)、未感染(1a-2)和PEG-IFN处置(1a-3)小鼠的肝脏。将肝组织在RIPA中匀浆，使用Ortho HCV核心蛋白ELISA试剂盒(Eiken Chemical)，将100μg总蛋白质用作核心蛋白的检测。
接着进行嵌合小鼠肝组织的免疫荧光染色。将来自1a-1和1a-4小鼠的肝切片使用作为一次抗体的生物素化抗HCV核心蛋白单克隆抗体和人肝细胞单克隆抗体(Dako，葛洛斯绰普，丹麦)探测，然后通过链霉亲和素-Alexa 488(Invitrogen)和抗小鼠IgG-Alexa-546(Invitrogen)探测。用DAPI染色细胞核。
通过上述方法确认了多球壳菌素处理对于嵌合小鼠肝脏中HCVRNA和核心蛋白的表达的影响。
结果表明，在多球壳菌素处置后，1a-4小鼠血清中HCV RNA水平减少至1×105拷贝/mL(图5A)。对肝脏中的HCV 1a RNA和核心蛋白的量进行定量时，发现是与血清中的情形同样地减少(图5A)。免疫荧光染色表明，1×108个拷贝/mL血清中的未处置小鼠1a-1的核心蛋白在人肝细胞部分中表达(图5A)，但1a-4小鼠的核心蛋白消失(图5B)。这些结果表明，多球壳菌素不仅使HCV基因型1b减少，也使HCV基因型1a减少，使HCV从肝脏中清除。
[实施例5]在感染HCV的嵌合小鼠中式(III)的化合物和PEG-IFN的抗HCV效果 通过静脉内注射，以106个拷贝/小鼠将HCR6(HCV基因型1b，登记编号AY045702)给予嵌合小鼠。4周后，HCV 1b RNA的水平在小鼠血清内由106达到108个拷贝/mL的水平。
式(III)的化合物和/或PEG-IFN的给予如下进行。
式(III)的化合物是下式所示化合物。
上述化合物可通过WO2005/005372的实施例4的方法合成。
PEG-IFN(Pegasys，PEG化干扰素α-2a)是每周2次皮下给予30μg/kg。式(III)的化合物是每天静脉给予5、10或20mg/kg。式(III)的化合物和PEG-IFN联合使用时，可以皮下给予10mg/kg式(III)的化合物和30μg/kg PEG-IFN。将式(III)的化合物和/或PEG-IFN给予感染了HCV基因型1b的小鼠，随着时间的经过采集血液。
抗HCV活性的评价可通过实时PCR对HCVRNA进行定量来进行。从1μL嵌合小鼠的血清中纯化总RNA，通过实时PCR对HCVRNA进行定量。
处置8天的组中，5mg/kg给药组的HCV滴度减少至-1.0至-1.1log(小鼠1和2)。10mg/kg给药组中，最大效果测定为-1.2至-1.8log(小鼠3～5)。20mg/kg给药组中，HCV滴度减少至-1.8至-2.8log(小鼠6～8)。在只给予PEG-IFN的组中，减少-0.3至-2log(小鼠12～16)，而在将10mg/kg式(III)的化合物和PEG-IFN联合使用的给药组中，减少至-2.6至-4.1log(小鼠9～11)(图6)。这些结果表明，式(III)的化合物通过与PEG-IFN联合使用，对于抗HCV活性显示协同效果。在处置14天的组中，低用量处置时，可见用量依赖性的病毒减少，而在高用量处置组中未见用量依赖性的病毒减少。
产业实用性 本发明人等阐明在体外通过SPT抑制剂抑制HCV复制的机理，明确了SPT抑制剂在具有人源化肝脏的嵌合小鼠模型中抑制HCV的复制。本发明的结果显示SPT可成为设计成抑制HCV复制的药物的有效的靶，以及SPT抑制剂可成为新型抗HCV剂开发中的先导化合物。
还表明通过将SPT抑制剂和干扰素联合使用，可以协同抑制HCV的复制，由此显示含有这两种成分的药物组合物安全性更高、可以获得有效性更高的用于治疗HCV的新型药物。
序列表
<110>财团法人东京都医学研究机构
中外制药株式会社
<120>治疗或预防HCV感染症的药物组合物
<130>C1-A0608P
<150>JP 2006-136992
<151>2006-05-16
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的siRNA序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>n表示dT
<400>1
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的siRNA序列
<220>
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<222>(20)..(21)
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<400>2
<210>3
<211>2742
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(9)..(1550)
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<211>513
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
<210>5
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(189)..(1877)
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<211>562
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
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<211>189
<212>PRT
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<210>8
<211>570
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<211>166
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>9
<210>10
<211>501
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>10
权利要求
1.用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物是将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素组合而成。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中，用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物是组合剂。
3.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物是将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物与干扰素联合使用。
4.权利要求3所述的药物组合物，其特征在于将阻断鞘磷脂的生物合成过程的化合物与干扰素同时或依次给药。
5.权利要求3所述的药物组合物，其特征在于将阻断鞘磷脂的生物合成过程的化合物与干扰素分别给药。
6.用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物作为有效成分，其特征在于将所述组合物与干扰素联合使用。
7.用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物，该药物组合物含有干扰素作为有效成分，其特征在于将所述组合物与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用。
8.权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是阻断由棕榈酰CoA生物合成鞘磷脂的过程的化合物。
9.权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是以下的(a)或(b)
(a)抑制参与由棕榈酰CoA生物合成3-酮二氢鞘氨醇的丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物；
(b)抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物。
10.权利要求9所述的药物组合物，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是多球壳菌素、Sphingofungin、以下式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐
式(I)
式中，
A表示-(CH2)n-，其中，n表示0～10的整数；
B表示-CH2-、-(C＝O)-、-CH(OH)-、-CH(NH2)-或-C(＝NOR)-，其中，R表示氢原子、碳原子数1～8的直链或支链状的烷基，所述烷基可被氨基取代，该氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代；
D表示-(CH2)m-R’，其中，m表示0～10的整数，R’表示氢原子、直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、环烯基、可被取代的杂环基、可被取代的芳基、可被取代的杂芳基、-OX基或卤素原子，其中X表示氢原子、或者直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、或可被取代的芳基；
E表示氢原子、或者直链或支链状的烷基；
G表示-(CH2)p-J，其中，p表示0～4的整数，J表示氢、OH基、SH基、甲硫基、羧基、氨基甲酰基、氨基、胍基、直链或支链状的烷基、环烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基、或可被取代的杂芳基；
键Q表示单键或双键；
R1、R2和R3可以相同或不同，表示羟基、氨基、-OL、直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或直链或支链状的炔基，其中，所述氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代，L表示直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或者直链或支链状的炔基。
11.权利要求9所述的药物组合物，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是下式(II)～(XII)中任一项所示的化合物或它们的药学上可接受的盐
式(II)
式(III)
式(IV)
式(V)
式(VI)
式(VII)
式(VIII)
式(IX)
式(X)
式(XI)
式(XII)
12.权利要求9所述的药物组合物，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物是以下的(a)或(b)
(a)与编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物互补的RNA；
(b)具有特异性切割编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物的核酶活性的RNA。
13.权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，干扰素是聚乙二醇化干扰素。
14.权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，HCV感染症是丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化、或肝癌。
15.治疗或预防HCV感染症的方法，该方法包含将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素给予受治疗对象的步骤。
16.权利要求15所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其特征在于将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素同时给予受治疗对象。
17.权利要求15所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其特征在于将阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素分别给予受治疗对象。
18.权利要求15所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是阻断由棕榈酰CoA生物合成鞘磷脂的过程的化合物。
19.权利要求15所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是以下的(a)或(b)
(a)抑制参与由棕榈酰CoA生物合成3-酮二氢鞘氨醇的丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物；
(b)抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物。
20.权利要求19所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是多球壳菌素、Sphingofungin、以下式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐
式(I)
式中，
A表示-(CH2)n-，其中，n表示0～10的整数；
B表示-CH2-、-(C＝O)-、-CH(OH)-、-CH(NH2)-或-C(＝NOR)-，其中，R表示氢原子、碳原子数1～8的直链或支链状的烷基，所述烷基可被氨基取代，该氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代；
D表示-(CH2)m-R’，其中，m表示0～10的整数，R’表示氢原子、直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、环烯基、可被取代的杂环基、可被取代的芳基、可被取代的杂芳基、-OX基或卤素原子，其中X表示氢原子、或者直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、或可被取代的芳基；
E表示氢原子、或者直链或支链状的烷基；
G表示-(CH2)p-J，其中，p表示0～4的整数，J表示氢、OH基、SH基、甲硫基、羧基、氨基甲酰基、氨基、胍基、直链或支链状的烷基、环烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基、或可被取代的杂芳基；
键Q表示单键或双键；
R1、R2和R3可以相同或不同，表示羟基、氨基、-OL、直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或直链或支链状的炔基，其中，所述氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代，L表示直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或者直链或支链状的炔基。
21.权利要求19所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是以下式(II)～(XII)中任一项所示的化合物或它们的药学上可接受的盐
式(II)
式(III)
式(IV)
式(V)
式(VI)
式(VII)
式(VIII)
式(IX)
式(X)
式(XI)
式(XII)
22.权利要求19所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物是以下的(a)或(b)
(a)与编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物互补的RNA；
(b)具有特异性切割编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物的核酶活性的RNA。
23.权利要求15所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，干扰素是聚乙二醇化干扰素。
24.权利要求15所述的治疗或预防HCV感染症的方法，其中，HCV感染症是丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化或肝癌。
25.阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物和干扰素在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用。
26.阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用，其中该组合物与干扰素联合使用。
27.干扰素在制备用于治疗或预防HCV感染症的药物组合物中的应用，其中该组合物与阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物联合使用。
28.权利要求25～27中任一项所述的应用，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物是阻断由棕榈酰CoA生物合成鞘磷脂的过程的化合物。
29.权利要求25～27中任一项所述的应用，其中，阻断鞘磷脂生物合成过程的化合物为以下的(a)或(b)
(a)抑制参与由棕榈酰CoA生物合成3-酮二氢鞘氨醇的丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物；
(b)抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物。
30.权利要求29中所述的应用，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是多球壳菌素、Sphingofungin、下式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐
式(I)
式中，
A表示-(CH2)n-，其中，n表示0～10的整数；
B表示-CH2-、-(C＝O)-、-CH(OH)-、-CH(NH2)-或-C(＝NOR)-，其中，R表示氢原子、碳原子数1～8的直链或支链状的烷基，所述烷基可被氨基取代，该氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代；
D表示-(CH2)m-R’，其中，m表示0～10的整数，R’表示氢原子、直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、环烯基、可被取代的杂环基、可被取代的芳基、可被取代的杂芳基、-OX基或卤素原子，其中X表示氢原子、或者直链或支链状的烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、环烷基、或可被取代的芳基；
E表示氢原子、或者直链或支链状的烷基；
G表示-(CH2)p-J，其中，p表示0～4的整数，J表示氢、OH基、SH基、甲硫基、羧基、氨基甲酰基、氨基、胍基、直链或支链状的烷基、环烷基、直链或支链状的炔基、直链或支链状的烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基、或可被取代的杂芳基；
键Q表示单键或双键；
R1、R2和R3可以相同或不同，表示羟基、氨基、-OL、直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或者直链或支链状的炔基，其中，所述氨基可被碳原子数1～4的直链或支链状的烷基一或二取代，L表示直链或支链状的烷基、直链或支链状的烯基、或者直链或支链状的炔基。
31.权利要求29中所述的应用，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的酶活性的化合物是以下式(II)～(XII)中任一项所示的化合物或它们的药学上可接受的盐
式(II)
式(III)
式(IV)
式(V)
式(VI)
式(VII)
式(VIII)
式(IX)
式(X)
式(XI)
式(XII)
32.权利要求29所述的应用，其中，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物是以下的(a)或(b)
(a)与编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物互补的RNA；
(b)具有特异性切割编码丝氨酸棕榈酰转移酶的DNA的转录产物的核酶活性的RNA。
33.权利要求25～27中任一项所述的应用，其中，干扰素是聚乙二醇化干扰素。
34.权利要求25～27中任一项所述的应用，其中，HCV感染症是丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化、或肝癌。
全文摘要
本发明人等使用HCV亚基因组复制子细胞FLR3-1或感染HCV的嵌合小鼠，研究SPT抑制剂和/或干扰素的抗HCV效果。结果表明，作为SPT抑制剂的多球壳菌素或式(III)的化合物可成为HCV感染症的新型治疗药，以及通过将该SPT抑制剂与干扰素联合使用，可以获得更高的抑制HCV复制的效果。
文档编号A61K38/21GK101489580SQ20078002663
公开日2009年7月22日 申请日期2007年5月16日 优先权日2006年5月16日
发明者小原道法, 楳原琢哉, 须藤正幸 申请人:财团法人东京都医学研究机构, 中外制药株式会社