专利名称：：一种纳米地龙口服制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属于中药制药领域，具体涉及一种纳米地龙口服制剂及其制备方法。
背景技术：
：纳米中药主要是指运用纳米技术制造的，径粒小于IOO纳米的中药有效成分、有效部位、原药及复方制剂。生物机体对药物的吸收、代谢是一个复杂的过程，中药制剂产生的药理效应不能仅仅归之于药物特有的化学组成还与该制剂的物理状态密切相关。因此，改变药物制剂的物理状态是新药研制的一种有效方法。在改变物理状态方面，改变药物的单元尺寸是十分有效的。当颗粒尺寸进入纳米量级时由于量子尺寸效应和表面效应，纳米粒子呈现出新奇的物理化学和生物学特性。这就是应用纳米技术于中药研究可能使药物活性和生物利用度提高乃至产生新的特性依据所在。纳米中药的制备是研究纳米中药最基础的，也是最重要的问题。将纳米技术引入中药的研究时，必须考虑中药组方的多样性、中药成分的复杂性，例如中药单味药可分为矿物药、植物药、动物药和菌物药等，中药的有效部位和有效成分又包括无机化合物和有机化合物、水溶性成分和脂溶性成分等。因此，针对不同的药物，在进行纳米化时必须采用不同的技术路线。纳米中药与中药新制剂关系十分密切，如何在中药理论的指导下进行纳米中药新制剂的研究，将中药制成高效、速效、长效、计量小、低毒、服用方便的现代制剂，也是进行中药纳米化时必须考虑的问题。目前，纳米技术在中药研究中存在的问题也不能忽视的。一.纳米中药的制备困难我国虽己制备一些纳米级的中药，可是由于中药品种繁多，成分复杂，不同的成分由于其作用部位、作用机制及作用缓急的不同而要求其粒径大小、载体成分及给药剂量均有可能不同。同时纳米中药应该有它自己的一套质量标准，使其生产规范化；二.纳米中药的毒副作用药物制成纳米微粒，其物理性质和化学性质均发生了显著的变化，这些变化对人体是否有毒副反应均未有有关的研究报道。但由于纳米材料的特殊性，除了可穿透皮肤，还会进入细胞器内，是否会直接参与或作为催化剂扰乱机体正常的化学反应，均未见有关报道。此外，纳米中药还可以通过机体的屏障系统，那它是否会影响中枢神经系统，精子的生成及其活力、胎儿的发育等，这些问题均无法回避；三.中药在纳米级粉碎后，纳米微粒表面积变大，由于纳米微粒表面的活性使他们很容易团聚在一起，这给纳米微粒的收集及其药效的稳定性带来很大的困难。现代中药的研究就是要在继承中药传统的基础上，充分利用现代科技手段，使中药具有先进的生产工艺和现代剂型，做到"有效、安全、可控"，将纳米技术应用于中药领域是现代中药发展的重要方向之一。纳米中药一般不是简单地将中药材进行粉碎至纳米量级，而是针对组成中药方剂的某味药的有效部位甚至是有效成分进行纳米技术加工处理，赋予传统中药以新的功能，如提高生物利用度，增强靶向性；降低毒副作用；呈现新的药效，拓宽原药的适应证；丰富中药的剂型选择；减少用药量，节省中药资源等。同传统中药相比，纳米中药具有以下特点①提高了药物的利用度，减少用药量。②增强药物的靶向性。③具有缓释功能，将中药纳米粒进行一定的表面修饰后，可能使中药具有缓释作用。④呈现新的药效，拓宽原药适应症，中药加工至纳米尺寸时，由于其量子尺寸等效应导致其物理、化学特性的改变，从而可使中药呈现出新功能。⑤丰富中药的剂型选择，提升传统给药途径。徐辉碧等检索了1998年2000年美国专利中涉及纳米科技的专利，发现该类专利与生物医学相关的专利占总数的80%以上，杨孟君在2001年一年内申请了9多件纳米中药的专利，但其申请的大部分都是中药原料药进行纳米粉碎，其专利实用性不强。目前纳米中药的研究主要集中于利用纳米技术对少数成分比较明确的单体有效成分进行纳米处理制成纳米制剂，或将原料药直接粉碎成纳米级，对大部分中药的纳米制剂研究还很少，主要是因为中药有效成分和有效部位特别是中药复方中有效部位本身就是一个"黑匣子"，中药中真正起药理作用的有效成分或有效部位研究本身就是一个难题，而且由于中药成分比较复杂，所以将其制备成纳米制剂需要克服的困难较多，因此，中药纳米制剂及技术是医药科研工作者的重要研究课题。地龙味咸、性寒，具有活血化瘀通络的作用，地龙的有效部位主要为多肽类成分，其生物活性大、生理作用强，但其还具有稳定性差、体内半衰期短、清除率高、生物膜透过性差、有免疫原性等缺点，因此，作为医药科研工作者应在研究中解决上述缺点；查阅文献和专利，未检索到纳米地龙口服制剂的资料。
发明内容基于上述原因，我们经过长期的实验研究，将地龙有效部位(蚓激酶)与药用载体组合，制备成纳米地龙口服制剂，可以很好的通过血脑屏障，加强了其治疗作用，在增强药理作用的同时，并没有增加药物的毒副作用。本发明在于提供一种纳米地龙的口服制剂；本发明还在于提供一种纳米地龙口服制剂的制备方法；本发明还在于提供纳米地龙口服制剂的应用；本发明通过以下技术方案实现的。一种纳米地龙口服制剂，其特征在于其组成包括地龙有效部位(蚓激酶)25一35重量份，药用载体312—875重量份；其中纳米地龙口服制剂中纳米粒径为30—130纳米。纳米地龙口服制剂在制备治疗缺血性脑血管疾病、心血管疾病、因高血压、糖尿病、肝病、肾病等引发的血管血流障碍性疾病、周围血管血流障碍性疾病、视网膜血管阻塞、高血脂、高血粘度、高凝血症的药物中的应用。一.工艺制法地龙纳米技术处方为地龙有效部位(蚓激酶)25—35重量份，药用载体312—875重量份。纳米技术制备方法一取天然纳米载体和单硬脂酸甘油酯溶于有机溶剂(氯仿一正己垸l:1)中，加入地龙有效部位(蚓激酶)水溶液，25X:水浴超声，加入附加剂(DSPE—PEG2000)混匀，25'C减压旋转蒸发，呈胶态后，继续减压蒸发，除去有机溶剂，得到混悬液，干燥，得到干燥物；本专利应用的天然纳米载体卵磷脂、神经鞘髓磷脂、二硬脂磷脂酰胆碱、琼脂糖、海藻酸盐、淀粉、葡聚糖、明胶、白蛋白、纤维蛋白、壳聚糖。本专利应用的合成纳米载体聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚内酯、聚酐、聚丙烯酰胺(高交联度)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、硅酮弹性体。制剂制备取上述干燥物，按照口服制剂的常规要求制备成药物制剂。二.质量标准检测依据根据《中华人民共和国药典》(2005年版，二部附录XIXE微囊、微球与脂质体制剂指导原则)进行的纳米质量检测。实验仪器H-7000型透射电镜仪(日本Hitachi公司)；Zetamaster光子相关光谱仪(英国Malvern公司)；LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)；TGL-18G型台式高速离心机。1.形态观察及粒径将本专利纳米药物在透射电镜下进行形态观察，可见呈圆球体，大小较均匀，表面光滑，无粘连。根据纳米药物的光学显微照片测定了3000个，平均粒径为70士15nm，最大粒径为130nm，最小粒径为30nm，且粒径分布符合正态分布规律。2.包封率和载药量测定采用反相高效液相色谱法进行含量测定，并用下述公式计算包封率和载药量:包封率(％)=(投药量一游离药物量)/投药量xlOO。/。；载药量(％)=(投药量一游离药物量)/纳米药物的重量xlOOn/。。结果包封率为91.2%，载药量为4%—8%。3.稳定性考察将纳米药物分别置于小瓶内，密封。于冰箱(3-5°C)、室温(20-25°C)和37°C(RH75%)的环境中放置，于0、1、2和3月观测纳米药物的外观、大小、再分散性等。结果均未见明显变化，3种条件下的纳米药物再分散性保持良好，无聚合现象的发生。结果见表l。表1稳定性实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>发明工艺具有实际意义。三.检测分析实验地龙口服制剂的检测分析采用高效液相色谱法对地龙有效部位(以黄嘌呤计)进行检测。实验仪器waters600E型高效液相色谱仪，996PDA检测器，色谱柱日本TOSOHTSK2000SW7.5*300实验药物本发明冻干粉针剂(北京药物开发有限公司实验室提供)色谱条件工作站millenniumchromatogvaph流动相0.01mol/L、PH值7.2的磷酸缓冲溶液(配制方法按照中国生物制品主要原辅材料质控标准2000年版，中国生物制品标准委员会编，化学工业出版社，P13—14配置)。样品制备取本发明纳米地龙口服制剂(粉针剂加入注射用水溶解完全)，用多肽纯化离心管，进行离心分离，取离心液体即为样品。上样取上述处理的样品用微量注射器吸取定量液体，注入进样器进行检测。实验结果见表2。表2本专利纳米地龙口服制剂含量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结论通过检测分析实验表明，本专利工艺具有实际意义。四.活性保持时间比较实验药物本发明纳米地龙口服制剂(北京药物开发有限公司实验室提供)，疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)实验方法将不同制剂放置在相同条件下O个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月，按照上述实验三的方法进行比活检测(以地龙活性为准)，检测结果见表3.表3不同制剂的比活比较组别o个月的比活au/mg)3个月的比活(IU/mg)6个月的比活(IU/mg)12个月的比活(IU/mg)18个月的比活(lU/mg)24个月的比活(lU/mg)本发明纳米地龙片210.9207.6203.2200.7197.4192.1剂本发明纳米地龙胶208.7206.9202.1199.4195.3191,8囊剂本发明纳米地龙颗208.9207.2202.5199.7195,8192,3粒剂疏血通注射液132.1122.9跳790.378.264.8结论本发明纳米地龙口服制剂在24个月时保持90。/。的活性，而疏血通注射液只保持了49%的活性，充分说明本发明纳米工艺具有实际意义。五.刺激性实验实验药物本发明各组纳米地龙制剂(北京药物开发有限公司实验室提供)实验动物健康大耳家兔，雌雄兼用。实验方法取健康大耳家兔3只，将动物固定于兔箱内，用酒精将皮肤消毒后，于右侧耳缘静脉处使用本专利纳米地龙口服制剂，于另一侧对应部位注射同一体积的等渗葡萄糖水作为对照。每日注射1次，连续3次，观察兔耳缘静脉反后将兔放血处死，取下两耳，用10%甲醛溶液浸泡，距注射部位l-4cm处，解剖取出静脉，做组织切片检査，观察注射部位的反应。实验结果试验过程中，肉眼观察两耳静脉注射部位处，未见红肿、热等刺激表现。表明给药组切片部位组织形态无明显差异，未见本品毒性所致的病理形态学改变(血管结构正常，无内皮细胞损伤，无血栓形成及其他病理性变化)。五.毒理实验实验l溶血毒性考察实验药物本发明各组纳米地龙制剂(北京药物开发有限公司实验室提供)实验方法2%红细胞混悬液的制备取兔耳缘静脉取血10-20ml，放入盛有玻璃珠的锥形瓶中，振摇IO分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血。加IO倍量的生理盐水溶液，摇匀，离心，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水溶液洗涤2-3次，至上清液不呈红色时为止。将所得的红细胞用用生理盐水配成浓度为2%的混悬液，即得。试验方法取试管6支，按表3中的配比量依次加入2%红细胞混悬液和生理盐水溶液，混匀，于37。C恒温箱中放置30分钟，分别加入不同量的本发明纳米地龙口服制剂(以第6管为空白对照)，摇匀后，置37i:恒温箱中，开始每隔15分钟观察1次，l小时后，每隔l小时观察l次，共观察2小时。表4各组别配比量试管编号2%红细胞混悬液(ml)生理盐水溶液(ml)药液(ml)13,03.01.023.03.10.833.03.20.643.03.30.453.03.40.263.03.50实验结果以第3试管为准，各管均未染有红色，显微镜下观察未见有红细胞破裂，说明本专利纳米地龙口服制剂不溶血，安全性好。实验2急性毒性实验实验药物本发明各组纳米地龙制剂(北京药物开发有限公司实验室提供)实验动物健康小鼠18—22g，，雌雄各半。实验方法取小鼠，分为市售地龙注射液组、本专利纳米地龙片剂组、胶囊剂组、颗粒剂组，注射给药尾静脉给药，给药剂量按照人给药剂量的20倍，口服制剂灌胃给药，给药剂量按照人给药剂量的80倍，按照体表面积换算成小鼠给药剂量，本专利纳米地龙注射剂与市售地龙注射液给药量相同，每天给药1次，连续7天，观察小鼠死亡情况，记录数据，实验结果见表5:表5小鼠用药、存活情况比较组别动物数死亡数死亡率只只%地龙注射液201470本专利纳米地龙片剂20210本专利纳米地龙颗粒剂20315本专利纳米地龙胶囊剂组20210结论通过上述实验表明，本专利纳米地龙口服制剂具有很好的安全性六.药理实验实验1透过血脑屏障实验脑脊液中药物浓度的测定实验药物本发明各组纳米地龙制剂(北京药物开发有限公司实验室提供)，疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)11实验动物新西兰家兔，体重约2.5kg，雌雄不限。实验方法取新西兰家兔，分为市售疏血通注射液组、本专利纳米地龙片剂组、胶囊剂组、颗粒剂组，注射液耳缘静脉给药，口服制剂灌胃给药，给药量各组按地龙生药量计算相同，给药量为2g地龙/kg，在不同时间抽取0.8ml左右脑脊液进行实验，取样吋间分别为注射药物后的120、150、160、180、200min，240min。取脑脊液0.25ml加适量溶剂混悬15min后，静置15min，以10000r/min离心1min，取上清液2(Hil进样，计算地龙有效部位(以黄嘌呤计)。结果见表6。表6脑脊液中药物浓度的测定(ug/ml)组别120min150min160min180min200min240min250min市售疏血通注射液组9.812.27.63.0一——本发明纳米地龙片剂组18.620.217.914.310.87.94.5本发明纳米地龙颗粒组19.120.8]8.214.61.18.34.4本发明纳米地龙粉胶囊剂组19.120.918.314.510.78.04.4结论通过上述实验表明，本发明纳米地龙口服制剂可以很好的通过血脑屏障。实验2各组制剂对大鼠脑梗塞的保护作用实验药物本发明纳米地龙口服制剂(北京药物开发有限公司实验室提供)，疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)实验动物SD大鼠,250300g，雌雄各半。实验方法取大鼠，水合氯醛300mg/kgip麻醉,颈部切口，分离并结扎右侧颈总动脉，缝合肌肉皮肤后，右侧位固定，在右耳和右眼外眦连线中点切开皮肤，分离颞肌，暴露颧突及颞骨,在颧突的头端12mm处开一约3x3mm的骨窗，暴露大脑中动脉(MCA),将MCA灼断，缝合切口。参考Bederson法给药，处死动物，取右大脑半球，切成5片,置于2g/LNPT中37。C温育15min染色，仔细挖取并称重未被染成兰色的白色梗塞脑组织，实验结果见表7。表7不同制剂对大鼠脑梗塞保护情况组别给药剂量(以地龙生药量计算)g/kg动物数只脑梗塞组织重量mg生理盐水10125.9±〗0.1疏血通注射液4.51088.6±21.5**本发明纳米地龙片剂4.51064.7±15.1**#本发明纳米地龙颗粒剂4.51062.8±17.0**#本发明纳米地龙胶囊剂4.51062.4±16.4**#注与生理盐水组比较"PO.Ol,与阳性对照组比较弁P0.05实验3对家兔视网膜静脉的影响实验药物本发明各组纳米地龙制剂(北京药物开发有限公司实验室提供)疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)高分子右旋糖酐(70)(桂林市第三制药厂生产)实验动物家兔，雌雄兼用。实验方法对家兔球视网膜毛细血管叉网点数影响试验取家兔，雌雄兼用，随机分成疏血通注射液组、本发明纳米地龙片剂组、颗粒剂组、胶囊剂组。以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,自耳缘静脉注入10%高分子右旋糖酐生理盐水溶液15ml/kg,造成急性微循环障碍模型。在注射后20min用显微镜观察兔左眼球视网膜上的微血管,通过带有测量面积装置(lmxlmm方格)的目镜选择观察球视网膜上固定面积范围内的毛细血管交叉网点数(药前值)，然后再每组分别给药，给药100min后同法观察测量固定部位的毛细血管交叉网点数(药后值),以差值(药后值-药前值)为指标,给药组与对照组进行组间比较(t或t'检验),结果如表8。表8地龙对家兔球视网膜毛细血管叉网点数影响H动物数11Fl只生理盐水50.58±0.69市售疏血通注射液51.53士0.39<0.05本发明纳米地龙片剂52.96士0.88<0.01本发明纳米地龙颗粒剂52.87士0.90<0,01本发明纳米地龙胶囊剂52.91±0.89<0.01实验4利用血栓法测定本发明制剂对大白鼠血栓形成的影响。实验药物本发明各组纳米地龙制剂(北京药物开发有限公司实验室提供)疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)高分子右旋糖酐(70)(桂林市第三制药厂生产)实验动物wistar大鼠，雌雄不限，体重250士45g。实验方法将给药的大白鼠麻醉(戊巴比妥钠30~40mg/kg，ip)，仰卧位固定，分离气管，插入一塑料套管，并分离右颈总动脉及左颈外静脉，在聚乙烯管的中段放入一根长6厘米的丝线，以肝素生理盐水溶液，充满聚乙烯管，当聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确的注入肝素抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉，开放血流15分钟后断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即得血栓重量。将空白组和另外两组给药组的动物血栓湿重进行记录，进行计算，如表9所示表9各给药组的血栓重量组别给药剂量(以地龙生药量计算)g/kg动物数只心脏梗塞组织重里mg生理盐水102.12士0.23市售疏血通注射液3.5101.47±0.18**本发明纳米地龙片剂3.5100.62±0.06**#本发明纳米地龙颗粒剂3.5100.67士0.07"弁本发明纳米地龙胶囊剂3.500.69±0.06**#注与生理盐水组比较"PO.Ol，与阳性对照组比较弁P0.05结论通过药理实验表明，本专利纳米地龙口服制剂具有很好的药理作用。七.制备实施例实施例1处方为地龙有效部位(蚓激酶)25克，药用载体312克。纳米技术制备取天然纳米载体卵磷脂312克和单硬脂酸甘油酯187克溶于有机溶剂(氯仿一正己烷l:1)中，加入地龙有效部位(蚓激酶)25克水溶液，25"水浴超声，加入附加剂(DSPE^PEG2000)1克混匀，25。C减压旋转蒸发，呈胶态后，继续减压蒸发，除去有机溶剂，得到混悬液，干燥，得到干燥物。制剂制备取上述干燥物，按照口服制剂的常规要求制备成药物制剂。制剂进行纳米检测，其纳米粒径为30—130nm实施例2处方为地龙有效部位35克，药用载体875克。纳米技术制备取天然纳米载体海藻酸盐875克和单硬脂酸甘油酯525克溶于有机溶剂(氯仿一正己烷l:1)中，加入地龙有效部位(蚓激酶)35克水溶液，25X:水浴超声，加入附加剂(DSPE—PEG2000)2g混匀，25。C减压旋转蒸发，呈胶态后，继续减压蒸发，除去有机溶剂，得到混悬液，干燥，得到干燥物。制剂制备取上述干燥物，按照口服制剂的常规要求制备成药物制剂。制剂进行纳米检测，其纳米粒径为30—130nm实施例3处方为地龙有效部位30克，药用载体500克。纳米技术制备取天然纳米载体壳聚糖500克和单硬脂酸甘油酯300克溶于有机溶剂(氯仿一正己烷l:1)中，加入地龙有效部位(蚓激酶)30克水溶液，25匸水浴超声，加入附加剂(DSPE—PEG2000)1.5克混匀，25'C减压旋转蒸发，呈胶态后，继续减压蒸发，除去有机溶剂，得到混悬液，干燥，得到干燥物。制剂制备取上述干燥物，按照口服制剂的常规要求制备成药物制剂。制剂进行纳米检测，其纳米粒径为30—130nm实施例4处方为地龙有效部位28克，药用载体400克。纳米技术制备取天然纳米载体卵磷脂、神经鞘髓磷脂400克和单硬脂酸甘油酯240克溶于有机溶剂(氯仿一正己烷l:1)中，加入地龙有效部位(蚓激酶)28克水溶液，25匸水浴超声，加入附加剂(DSPE^PEG2000)L2克混匀，25。C减压旋转蒸发，呈胶态后，继续减压蒸发，除去有机溶剂，得到混悬液，干燥，得到干燥物。制剂制备取上述干燥物，按照口服制剂的常规要求制备成药物制剂。制剂进行纳米检测，其纳米粒径为30—130nm实施例5处方为地龙有效部位32克，药用载体640克。纳米技术制备取天然纳米载体神经鞘髓磷脂、琼脂糖、海藻酸盐、葡聚糖共640克和单硬16脂酸甘油酯384克溶于有机溶剂(氯仿一正己烷1:1)中，加入地龙有效部位(蚓激酶)32克水溶液，25X:水浴超声，加入附加剂(DSPE—PEG2000)1.7克混匀，25'C减压旋转蒸发，呈胶态后，继续减压蒸发，除去有机溶剂，得到混悬液，干燥，得到干燥物。制剂制备取上述干燥物，按照口服制剂的常规要求制备成药物制剂。制剂进行纳米检测，其纳米粒径为30—130nm权利要求1.一种纳米地龙口服制剂，其特征在于其组成包括地龙有效部位(蚓激酶)25—35重量份，药用载体312—875重量份；其中纳米地龙口服制剂中纳米粒径为30—130纳米。2.根据权利要求1所述的一种纳米地龙口服制剂的制备方法，其特征为纳米技术制备取天然纳米载体和单硬脂酸甘油酯溶于有机溶剂(氯仿一正己垸l:1)中，加入地龙有效部位(顿激酶)水溶液，25t:水浴超声，加入附加剂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇2000(DSPE—PEG2000)混匀，25。C减压旋转蒸发，呈胶态后，继续减压蒸发，除去有机溶剂，得到混悬液，干燥，得到干燥物。制剂制备取上述干燥物，按照口服制剂的常规要求制备成药物制剂。3.根据权利要求1所述的纳米地龙口服制剂在制备治疗缺血性脑血管疾病、心血管疾病、因高血压、糖尿病、肝病、肾病等引发的血管血流障碍性疾病、周围血管血流障碍性疾病、视网膜血管阻塞、高血脂、高血粘度、高凝血症的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种纳米地龙口服制剂及其制备方法，其特征在于地龙有效部位(蚓激酶)与药用载体组合，制备成纳米地龙口服制剂；其特征还在于本发明口服制剂中地龙有效部位(蚓激酶)25-35重量份，药用载体312-875重量份；其特征还在于纳米地龙口服制剂中纳米粒径为30-130纳米；药理实验结果表明，本发明纳米口服制剂应用安全，与市售地龙注射液比较具有更好的药理作用。文档编号A61P7/00GK101530430SQ20081010175公开日2009年9月16日申请日期2008年3月12日优先权日2008年3月12日发明者伟李,王爱民申请人:北京卓越同创药物研究院