专利名称：用于向哺乳动物皮肤输送多核苷酸的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及用于向哺乳动物皮肤细胞输送多核苷酸疫苗的方法和装置。更具体地，本发明提供用于使用电波和电击(electroporation)来将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置。
背景技术：
为了本公开的目的，术语“脉冲间隔”意味着从一个脉冲的开始到下一脉冲的开始的时间。
以下讨论以下公开物 美国专利No.6010613； 美国专利No.6603998； 美国专利No.6713291； “Enhancement of Cellular Immune Response to a Prostate Cancer DNAVaccine by Intradermal Electroporation”，Roos等人，在《分子理论》中，第13卷，No.2，2006年2月，320-327页(在此称为Roos等人)； “The Effect of pulse repetition frequency on the uptake intoelectropermeabilized cells in vitro with possible applications inelectrochemotherapy”，Pucihar等人的在Bioelectrochemistry 57(2002)，第167-172页(在此称为Pucihar等人)； Vernhes MC，Cabanes PA，Tessie J.Chinease Hamster ovary cells sensitivityto localized electrical stress，Bioelectrochemistry and Bioenergetics.1999，4817-25； Daskalov I，Mudrov N，Peycheva E.Exploring new instrumentation.Parameters for electrochemotherapy.Attacking tumors with bursts of biphasicpulses instead of single pulses.1999，IEEE Eng.Med.Biol 62-66； Chang DC，Cell poration and cell fusion using an oscillating electric field.1989 Biophys J.56641-652；以及 Tekle E，Astumian RD，Chock PB.Electroporation by using bipolaroscillating electric fieldAn improved method for DNA transfection of NIH 3T3cells.1991Proc.Natl.Acad.Sci.884230-4234。
在此通过参考并入的美国专利No.6010613公开了使用诸如由Cyto Pulse公司、810Cromwell Park Drive，Suite T，Glen Burnie，MD 21061的PA-4000系统(在此称为PulseAgile)提供的具有宽的间隔电波的电击。更具体地，美国专利No.6010613公开了向材料施加一系列至少三个单个、操作员控制的独立编程的DC电脉冲，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有以下特征中的一个、两个或三个(1)至少三个脉冲中的至少两个在脉冲幅度上彼此不同；(2)至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上彼此不同；以及(3)至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔不同于该至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔。
为了在此讨论和公开的目的，上述向物质施加具有特征(1)、(2)和(3)的一系列至少三个单个、操作员控制的独立编程的DC电脉冲，在此被称为“PulseAgile”。
在美国专利No.6010613中公开的说明书和与PulseAgile系统相关的文档提供了脉冲间隔等于或大于0.1秒，即100毫秒。以下，将具有等于或大于100毫秒脉冲间隔的PulseAgile生成的电波称为“宽间隔PulseAgile电波”或“慢PulseAgile电波”。
在美国专利No.6010613中，没有呈现具体证据来证明，所送药的疫苗成功地从基因表达出该疫苗，或提供改进的T细胞应答，包括由于该疫苗的成功基因表达而引起的好蛋白质的分泌得到改善。
在此都通过引用附于此的美国专利No.6603998和美国专利No.6713291都公开了使用宽间隔PulseAgile电波或慢PulseAgile电波来向生物细胞输送多核苷酸疫苗。
Roos等公开了使用宽间隔PulseAgile电波或慢PulseAgile电波来将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中。Roos等还公开了通过检测表达荧光素酶(luciferase)蛋白质的遗传标记来证实多核苷酸疫苗的成功的遗传表达。另外，Roos等公开了通过使用宽间隔PulseAgile电波或慢PulseAgile电波来将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中，存在改进的T细胞应答，包括由于多核苷酸疫苗的成功的遗传表达而引起的好的蛋白质的分泌改善。在Roos等中，T细胞应答用产生PSA特异性IFN(γ)的CD8+T细胞来代表。
除了在Roos等的公开物中公开的有益结果以外，存在通过使用慢PulseAgile电波而观察到的两个不期望的结果。第一个不期望的结果是，每个慢PulseAgile电波送药过程花费大约3.5秒。由于使用刺到哺乳动物皮肤中的针来送药导致不舒适或疼痛，因此对于这3.5秒的送药过程哺乳动物将不得不忍受大约3.5秒的不舒适或疼痛。
在Roos等中公开的第二个不期望的结果是，每个慢PulseAgile电波导致能感知的肌肉收缩。肌肉收缩本身也可能导致不舒适或疼痛。通常，为运送多核苷酸疫苗，将向哺乳动物施加多个脉冲波形。因此，将伴随这这种慢PulseAgile电波而发生具有多次额外的肌肉不舒适或疼痛的多次肌肉收缩。
Pucihar等公开了在其2002年的
公开日之前，已经结合化学疗法药剂使用电脉冲来治疗癌症细胞。早前的电脉冲具有1Hz的频率，从而每个脉冲产生一次相关的强直性收缩(肌肉收缩)。注意，1Hz意味着每个周期1000毫秒。所讨论的电脉冲规程是具有均匀的(uniform)脉冲幅度、均匀的脉冲宽度和均匀的脉冲间隔的脉冲的所有脉冲序列。化学疗法药剂包括小的不渗透的亲水分子。Pucihar等的研究涉及将癌变细胞用非渗透性亲水小分子荧光黄(LuciferYellow)处理后进行体外(而非体内)实验。Pucihar等发表的研究探索了各种脉冲重复频率以便超过强直性收缩的频率(以便使连续的肌肉收缩融入到平稳的运动中)。在Pucihar等中存在如下陈述通过40Hz或更快的刺激频率，使连续的肌肉收缩融入到平稳的运动中。该40Hz脉冲频率使用均匀脉冲幅度、均匀脉冲宽度和均匀脉冲间隔的脉冲。注意，40Hz意味着每个周期25毫秒。
Vernhes等人公开了CHO细胞在体外经0.5到100Hz的脉冲频率电击后，其活力和渗透性很高。
Daskalov等人公开了，对体内肿瘤细胞以1Hz和1kHz输送八个双极性脉冲时，产生类似的对电化学疗法(electrochemotherapy)的应答。
Chang公开了高频正弦波以短脉冲的形式能在体外有效地电击COS-M-6细胞。
Tekle等人公开了以60kHZ到1MHZ的频率输送的单极或双极矩形波脉冲有效地体外转染(transfect)NIH 3T3细胞。
Pucihar、Vernhes等人、Daskalov等人、Chang或Tekle等人的文献中都没有公开与多核苷酸疫苗接种、与多核苷酸疫苗的成功遗传表达、或与T细胞应答改善(包括由于多核苷酸疫苗的成功遗传表达而引起的期望的蛋白质的分泌改善的的任何关系的描述。
鉴于以上，期望提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置，其用少于3.5秒的时间运送多核苷酸疫苗。
另外，期望提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置，其向哺乳动物皮肤施加多个PulseAgile电波并且这多个施加的电波仅导致一次肌肉收缩。
要成功运送多核苷酸疫苗，必须证明所运送的多核苷酸疫苗成功进行遗传表达。另外，所送药的多核苷酸要成功表达，必须证明因多核苷酸疫苗的成功遗传表达而产生了所需蛋白质。
因此，虽然现有技术的上述内容指出使用电击装置是公知的，但上述现有技术不教导或启示具有如下期望的特征的组合的用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置(1)提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置，其用少于3.5秒运送多核苷酸疫苗；(2)向哺乳动物皮肤施加多个PulseAgile电波、并且这多个施加的电波仅导致一次肌肉收缩；(3)给出所送药的多核苷酸疫苗的成功遗传表达的证明；以及(4)给出由于多核苷酸疫苗的成功遗传表达而提供所需蛋白质的证明。前述期望的特征由用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的本发明的特有方法和装置提供，本发明将从以下描述中变得清晰。还将清楚地呈现本发明相对于现有技术的其他优点。
前述期望的特征由用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的本发明的特有方法和装置提供，本发明将从以下描述中变得清晰。还将清楚地呈现本发明相对于现有技术的其他优点。
发明内容
根据本发明的一个方面，一种用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法包括以下步骤 (a.)将多核苷酸疫苗送药到送药点处的皮肤中， (b.)对送药点附近的皮肤施加针电极， (c.)施加一系列至少三个单个、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒的脉冲间隔的窄间隔电波，以通过电击将多核苷酸疫苗输送到皮肤细胞中。该一系列至少三个波形具有以下特征中的一个、两个或三个(1)至少三个波形中的至少两个在波形幅度上彼此不同；(2)至少三个波形中的至少两个在波形宽度上彼此不同；以及(3)至少三个波形中的第一组两个波形的第一波形间隔不同于该至少三个波形中的第二组两个波形的第二波形间隔。
该一系列至少三个单个、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒的脉冲间隔的窄间隔电波在此被称为“快PulseAgile电波”或“窄间隔PulseAgile电波”。
优选地，该窄间隔电波具有少于几毫秒的脉冲间隔。
通过本发明方法的一个实施例，顺序地进行步骤(a.)和步骤(b.)。例如，首先将DNA疫苗注入到皮肤中以形成小泡。然后，将针电极放置到跨骑该小泡的皮肤中。在这方面，可以使用“Derma Vax”系统。
通过本发明方法的另一实施例，使用用多核苷酸疫苗预先涂覆的电极来同时进行步骤(a.)和步骤(b.)。在这方面，可以使用“Easy Vax”系统。
根据本发明的另一方面，提供一种用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的装置，其包括窄间隔电波发生器，其能够施加一系列至少三个单个、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒的脉冲间隔的窄间隔电波，以及已适于接触被施加了多核苷酸疫苗的皮肤的电极。
一系列至少三个波形具有以下特征中的一个、两个或三个特征(1)至少三个波形中的至少两个在波形幅度上彼此不同；(2)至少三个波形中的至少两个在波形宽度上彼此不同；以及(3)至少三个波形中的第一组两个波形的第一波形间隔不同于该至少三个波形中的第二组两个波形的第二波形间隔，且电极被连接到所述窄间隔电波发生器。
通过本发明的装置的一个实施例，在用电极接触皮肤之前就已经向皮肤施加了多核苷酸疫苗。这可以通过使用皮下注射针来实现。
通过本发明的装置的另一实施例，将多核苷酸疫苗预先涂覆在电极上，且在电极与皮肤接触的同时施加给皮肤。
提供快PulseAgile电波或窄间隔PulseAgile电波且使用任何适当的电极来向哺乳动物皮肤施加的装置由Cyto Pulse公司、810 Cromwell Park Drive，Suite T，Glen Bumie，MD 21061制造，且已知为名称“Derma Vax”。
关于Cyto Pulse公司的“Derma Vax”系统的更多信息在以下公开中在互联网上登陆URL网址www.cytopulse.com/dna vaccine.shtml，接下来点击题为“Derma Vax Data Sheet(99Kb)”的链接，就能找到题为“Derma VaxTMClinical Evaluation Intra-dermal System”的信息页。该信息页的直接网址是http://www.cytopulse.com/pdf/Datasheet％20Derma％20Vax.pdf。
提供快PulseAgile电波或窄间隔PulseAgile电波、且使用了适于哺乳动物皮肤施用的预涂覆电极的装置由Cyto Pulse公司制造，且已知为名称“EasyVax”。
提供快PulseAgile电波或窄间隔PulseAgile电波的装置也由Cyto Pulse公司制造，且已知为名称“CCEP-40波形发生器”。如上所述，对于“CCEP-40波形发生器”的说明可参见上述题为“Derma VaxTMClinical EvaluationIntra-dermal System”的信息页。
上述简短描述较宽泛地阐述了本发明的的更重要特征，以便可以更好地理解以下的详细描述，且以便可以更好地理解对现有技术的解释。当然，存在此后描述的本发明的额外的特征，且将用于所附的权利要求的主题。
在这方面，在更详细地说明本发明的原理的一些实施方式之前，应理解本发明在其应用上不局限于该解释的的细节和在以下描述或图中图示的组件的布置。本发明能够实现且以各种方式进行其他实施例。而且，还应理解，在此使用的短语和术语是用于描述的目的，且不应该认为是限制。
如此，本领域技术人员将理解，该公开所基于的概念可以容易地被利用作为用于设计实现本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是，权利要求被看作包括其不脱离本发明的精神和范围的等同解释。
因此，本发明的目的是，提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的新的改进的方法和装置，其用少于3.5秒运送多核苷酸疫苗。
本发明的另一目的是，提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的新的改进的方法和装置，其向哺乳动物皮肤施加多个PulseAgile电波，并且这多个施加的电波仅导致一次肌肉收缩。
本发明的再一目的是，提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的新的改进的方法和装置，其给出所送药的多核苷酸疫苗成功进行遗传表达的证据。
本发明的再一目的是，提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的新的改进的方法和装置，其给出由于多核苷酸疫苗的成功遗传表达而提供所需蛋白质的证据。
在所附且构成本公开的一部分的权利要求中具体地指出了本发明的这些以及其他目的、以及限定本发明的新颖性的各种特征。为了更好地理解本发明、通过其使用而获得的其操作优点和具体目的，应该必须参考附图和其中示出了本发明的优选实施例的描述性主题。
在学习了以下详细的描述之后，将更好地理解本发明，且上述目的以及除了上述目的以外的目的将变得更清楚。这种描述参考附图进行，在附图中 图1例示，用“Derma Vax”仪器电击输送荧光素酶质粒时，施加快PulseAgile电波相比于施加慢PulseAgile电波而引起的荧光素酶表达的比较。
图2例示，用“Derma Vax”仪器电击输送荧光素酶质粒时，施加快PulseAgile电波相比于施加慢PulseAgile电波而引起的、对Dengue 1 DNA疫苗接种的T细胞应答的比较。
图3例示，用“Derma Vax”仪器电击输送荧光素酶质粒时，施加快PulseAgile电波相比于施加慢PulseAgile电波而引起的荧光素酶表达的比较。
具体实施例方式 提供了一种方法和装置用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中，且以下将参考附图描述所述方法和装置。
对于“Derma Vax”和“CCEP-40波形发生器”说明如下 DERMA VAX说明 操作 模式1-由经过训练的护理专家来进行的疫苗输送 触摸屏 打开参数进入窗口 用病人ID进入 用疫苗ID进入 用电极ID进入 接种信息屏幕 SKIN-测量皮肤每秒电阻并显示 READY-接通高压电源 START-启动脉冲(pulsing) DONE-接种完成 模式2-由经过训练的IT专家建立 脉冲参数 下载数据文件 输送电极 疫苗输送量- 2个小泡x 25μl每IDA-4-6 2个小泡x 50μl每IDA-6-6 输送目标-皮肤/真皮 电极 把手(handle)--用酒精清洁后可反复使用 tip- 无菌 单独包装 一次性 IDA-4-4 IDA-4-6IDA-6-6 行间距 4mm 4mm6mm 针/行 R 6 6 针间距 15.mm 1.5mm 1.5mm 针直径 0.3mm 0.3mm 0.3mm 针长度 2mm 3mm3mm V/d最大2500v/cm2500v/cm 1667v/em CCEP-40波形发生器 脉冲 皮肤电阻脉冲-每秒5伏特4μs 脉冲规程参数 在一组中的参数 脉冲宽度 50μs到1ms50到1000伏特 50μs到10ms50到300伏特 脉冲电流行程(trip)26amps 负荷范围 15到1500ohms 脉冲数量 1到10 最大占空因数 50％ 间隔 200μs到1秒(脉冲开始到脉冲开始) 组数量3 脉冲测量 内部数字化器(digitizer) 水平12比特 采样脉冲宽度/8最小100μs 内部存储以及存储在外部USB盘(USB key)上的数据 数据类型 原始数据DV<日期>.xml 日志数据 DV<日期>.txt CSV数据 DV<日期>.csv 所有数据自动地存储在内部存储器中，且可以下载到外部USB盘 存储的且可从内部闪存获得的最大数据日志＞20000 前面板 计算机 操作系统WindowsTM Mobile 6.0 界面触摸屏 具有照明的行/主开关(Line/Mains Switch) 紧急停止按钮(将计算机复位到就绪状态) 触摸屏 USB端口 电极连接器费希尔系列(Fischer Series)4032 后面板 功率条目IEC 320 以太网 RJ45 电气和机械方面 CCEP-40A有把手的箱子 宽度32mm×高度20mm×长度40mm 宽度12.6英寸×高度7.9英寸×长度15.7英寸 重量25磅，11.3kg 工作温度10到40℃ 主电压 100到250vac 保险丝 5A slo blo，5mm×20mm 电源保留＞断电后5分钟 以下阐述使用用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞的本发明装置实施本发明方法的实验。
实验1 目的和范围 该实验的目的是比较(使用Cyto Pulse的“Derma Vax”系统的)快PulseAgile电波与(使用Cyto Pulse的PA-4000系统的)慢PulseAgile电波。新的Derma Vax系统可以比PA-4000更快地输送脉冲。
背景 Anna-Karin Roos医生披露了至少两个在小鼠皮肤中引发良好荧光素酶表达的波形。所使用的系统是PA-4000，且使用慢PulseAgile电波。已经给使用“CCEP-40波形发生器”的Derma Vax系统装配了新能力。一个显著的不同是Derma Vax系统可以输送具有更短脉冲间隔的脉冲。也就是说，通过“DermaVax”系统，可以提供少于100毫秒的脉冲间隔。该实验将评估使用快PulseAgile电波对活体中荧光素酶表达的效果。
方法 使用的质粒来自Aldeveron的gWizLuciferase，在无菌PBS中5mg/ml被稀释到0.5mg/ml。
系统Derma Vax#F2LQ2608851 电极真皮内阵列(4mm间隙，每行6针，2行)平行行电极。
注射用带有呼吸孔的50ml锥管来约束小鼠。将小鼠头向前插入管中。尾巴垂在我的左手食指上。用小剪刀除去尾根的一小块毛发。用27号、0.5英寸的针配结核菌素注射器，在尾根和骶骨右侧真皮内注入20微升。该部位用Sharpee笔标记。将数行针插在注射点周围，使电极间隙从左向右，由此使这些行头尾相连。启动所选的电击方案，移除针。在骶骨左侧重复该过程。
组(即笼)。所有时间以毫秒示出。
方案笼1笼2 V/d 1 1125 1125 V1 450450 PW 10.05 0.05 #1 1 1 PI1 3000.2 V/d21125 1125 V2 450450 PW 20.05 0.05 #2 1 1 PI2 500100 V/d 3 275275 V3 110110 PW 310 10 #3 8 8 PI 330020 将小鼠送回它们的笼。
18-24小时后，使小鼠吸入CO2，实施安乐死。用6mm打孔器从两个注射部位分别切取组织进行活检。用剪刀取皮下组织，向皮肤和皮下组织加入1ml裂解缓冲液。样品在冰上维持直到进行测试。
组织用模型IKA组织匀浆器进行匀浆。向白色测试板中添加1ml匀浆物的50微升样品。将已知量的荧光素酶用裂解缓冲液进行三倍系列稀释，制得标准品。荧光素酶测定试剂盒中的试剂A向每孔加50微升。将该板至于96孔发光计(luminometer)。加50微升试剂B，测量在一秒钟内得到的光。
将数据导入Excell电子数据表，用于数据分析。
结果见图1。快电波方案和慢电波方案的遗传表达在统计学上是等同的。
结果 ng/每个部位 笼1 笼2 PA慢PA快 22 43 464 510 486 283 180 267 197 168 -------------------------------- 平均270 254 SD 200 172 CV 746 8 令人惊讶且未预料的结果是用脉冲间隔少于100毫秒的快PulseAgile电波，可以将多核苷酸疫苗电击到哺乳动物皮肤细胞中、并伴随成功的遗传表达。
更令人惊讶且未预料的结果是用脉冲间隔为数毫秒的快PulseAgile电波，可以将多核苷酸疫苗电击到哺乳动物皮肤细胞中、并伴随成功的遗传表达。而传统认为，脉冲间隔的时间常量在仅数毫秒的水平时，不能实现成功的电击。
实验2 目的和范围 该实验的目的是比较(使用Cyto Pulse的“Derma Vax”系统的)快PulseAgile电波与(使用Cyto Pulse的PA-4000系统的)慢PulseAgile电波而引发的T细胞应答。新的Derma Vax系统可以比PA-4000更快地输送脉冲。更具体地，该研究的目的是，比较用Pulse Agile Derma Vax输送表达prM-E和NS1-NS3的Dengue 1质粒进行DNA免疫而引发的T细胞应答。
背景 Anna-Karin Roos医生披露了至少两个在小鼠皮肤中引发良好荧光素酶表达的波形。所使用的系统是PA-4000，且使用慢PulseAgile电波。已经给使用“CCEP-40波形发生器”的Derma Vax系统装配了新能力。一个显著的不同是Derma Vax系统可以输送具有更短脉冲间隔的脉冲。也就是说，通过“DermaVax”系统，可以提供少于100毫秒的脉冲间隔。该实验将评估使用快PulseAgile电波对活体中T细胞应答的效果。
方法 使用的质粒Dengue 1 prM-E和Dengue 1 NS1-NS3都是5mg/ml，在相同的无菌PBS中分别稀释到0.5mg/ml。
系统Derma Vax#07-0215DV 电极真皮内阵列(4mm间隙，每行6针，2行)平行行电极。
注射用带有呼吸孔的50ml锥管来约束小鼠。将小鼠头向前插入管中。尾巴垂在我的左手食指上。用小剪刀除去尾根的一小块毛发。用27号、0.5英寸的针配结核菌素注射器，在尾根和骶骨右侧真皮内注入20微升。将数行针插在注射点周围，使电极间隙从左向右，由此使这些行头尾相连。启动所选的电击方案，移除针。在骶骨左侧重复该过程。
组(即笼)。所有时间以毫秒示出。
方案 组P 组Q 对照 V/d 1112511250 V1 450 450 0 PW 1 0.050.050 #1 1 1 0 PI 1 0.2 300 0 V/d 211251125 V2 450 450 PW 2 0.050.05 #2 1 1 PI 2 30 300 V/d 3275 275 3110 110 PW 3 10 10 #3 8 8 PI 3 20 100 将小鼠送回它们的笼。
免疫的两周后，小鼠吸入CO2来实施安乐死，收集脾，进行胞内细胞因子测定。
结果 以下示出的结果是伽马干扰素阳性的CD8阳性细胞的百分比。
所述结果已减去未免疫动物的背景值。 快(组P) 慢(组O) 6.424.03 5.386.11 4.353.36 4.282.75 2.062.16 平均 4.503.68 SD1.621.53 测试结果参见图2。对这些测试结果进行Student’s T检验，发现快电波方案和慢电波方案之间存在统计学上不明显的差异。鉴于此，快电波方案和慢电波方案在强化T细胞方面是统计学等同的。
结论 进行活体电击时，Derma Vax”系统输送的快PulseAgile电波与“DermaVax”系统输送的慢PulseAgile电波引起等同的T细胞应答。
表1 用快PulseAgile电波电击比用慢PulseAgile电波电击 减少了能感知到的肌肉收缩。
参数快Pulse Agile 慢Pulse Agile 脉冲的输送次数 1010 总输送时间 0.23秒3.5秒 感知的肌肉收缩次数 1 10 显然，采用快PulseAgile电波(相比于慢PulseAgile电波)，输送时间比3.5秒少得多，且甚至当输送了10个脉冲时仅感知到1次肌肉收缩。
参考图3，如下进行DNA输送(DNA是多核苷酸)。
小鼠用4％异氟烷(Baxter Medical AB，Kista，Sweden)麻醉，免疫期间面罩中维持2-2.5％异氟烷。用29G胰岛素级注射器(Micro-Fine U-100，BDConsumer Healthcare，Franklin Lakes，NJ)，在尾根部附近双侧真皮内，注入20μg DNA的PBS溶液。
随后，在注射区域隆起的皮肤上放置针阵列电极，施加电压(2个脉冲，1125V/cm，50μ秒+8个脉冲，275V/cm，10毫秒)。改变脉冲间隔，以实施快和慢的PulseAgile方案。
所使用的针阵列电极是Cyto Pulse Intradermal array(四针，4mm间隙，两行)(Cyto Pulse Sciences公司，Glen Burnie，MD)。使用Derma Vax电击系统(Cyto Pulse Sciences公司)来进行电击。
从以上清楚看出，本发明通过提供将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的新的改进方法和装置，实现了上述的所有目标，本发明的方法和装置具有使用优势，且施用多核苷酸疫苗的时间少于3.5秒。本发明提供的将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置，向哺乳动物皮肤施加了多个PulseAgile电波，但这多个施加的电波仅导致一次肌肉收缩。本发明提供的将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置，能给出所运送的多核苷酸疫苗成功遗传表达的证据。本发明提供的将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置，能给出由于送药的多核苷酸疫苗成功遗传表达而提供所需蛋白质的证明。
本发明的使用方式和操作方式也是从上述公开的内容可明显体现出的，因此，不需要对使用方式和操作方式进一步讨论。
因此，虽然在附图中示出了本发明且上述结合呈现的事务具体且详细地描述了上述内容确实是本发明的最实际和优选的实施例，但是本领域技术人员将清楚，可以在不脱离在此阐述的原理和概念的情况下进行许多修改，包括但不限于在方法、组件和使用的尺寸、材料、形状、形式、功能和方式上的改变。
权利要求
1.一种用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法，包括以下步骤
(a.)将多核苷酸疫苗送药到送药点处的皮肤中，
(b.)对送药点附近的皮肤施加针电极，
(c.)施加一系列至少三个单个的、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒脉冲间隔的窄间隔电波，以通过电击将多核苷酸疫苗输送到皮肤细胞中，
其中，该一系列至少三个波形具有以下特征中的一个、两个或三个特征(1)该至少三个波形中的至少两个在波形幅度上彼此不同；(2)该至少三个波形中的至少两个在波形宽度上彼此不同；以及(3)该至少三个波形中的第一组两个波形的第一波形间隔不同于该至少三个波形中的第二组两个波形的第二波形间隔。
2.根据权利要求1的方法，其中，顺序地执行步骤(a.)和步骤(b.)。
3.根据权利要求1的方法，其中，使用用多核苷酸疫苗预先涂覆的电极来同时进行步骤(a.)和步骤(b.)。
4.一种用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的装置，包括
窄间隔电波发生器，其能够施加一系列至少三个单个的、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒脉冲间隔的窄间隔电波，其中，该一系列至少三个波形具有以下特征中的一个、两个或三个特征(1)该至少三个波形中的至少两个在波形幅度上彼此不同；(2)该至少三个波形中的至少两个在波形宽度上彼此不同；以及(3)该至少三个波形中的第一组两个波形的第一波形间隔不同于该至少三个波形中的第二组两个波形的第二波形间隔，以及
连接到所述窄间隔电波发生器的电极，其中，所述电极已适于接触被施加了多核苷酸疫苗的皮肤。
5.根据权利要求4的装置，其中，在用所述电极接触皮肤之前已向皮肤施加了多核苷酸疫苗。
6.根据权利要求4的装置，其中，将多核苷酸疫苗预先涂覆在电极上，并在电极与皮肤接触的同时施加到皮肤上。
7.一种用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法，包括以下步骤
(a.)将多核苷酸疫苗送药到送药点处的皮肤中，
(b.)对送药点附近的皮肤施加针电极，
(c.)施加一系列具有少于100毫秒脉冲间隔的窄间隔电波，以通过电击将多核苷酸疫苗输送到皮肤细胞中。
8.一种用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的装置，包括
窄间隔电波发生器，其能够施加一系列具有少于100毫秒脉冲间隔的窄间隔电波，以及
连接到所述窄间隔电波发生器的电极，其中，所述电极已适于接触被施加了多核苷酸疫苗的皮肤。
全文摘要
本发明的目的是提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中的方法和装置，以增加T细胞应答并减少由于长电波的施加以及由于肌肉收缩而导致的疼痛和不舒适。该方法包括(a)将多核苷酸疫苗送药到送药点处的皮肤中，(b)对送药点附近的皮肤施加针电极，(c)施加一系列至少三个单个的、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒脉冲间隔的窄间隔电波，以通过电击将15多核苷酸疫苗输送到皮肤细胞中。
文档编号A61K48/00GK101778643SQ200880025576
公开日2010年7月14日 申请日期2008年5月20日 优先权日2007年5月21日
发明者理查德·E·沃尔特斯, 德林·C·沃尔特斯, 艾伦·D·金, 安娜-卡林·鲁斯 申请人:塞托·帕尔斯科技公司