注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂及其制备方法

专利名称：：注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂及制备方法，属于医药
技术领域：
。技术背景羟甲卿安Hydroxymethylnicotinamide[Nicotinylmethylamide，Oxymethylnicotinami4](氧甲基;J;llSti安，禾朋旦素)]，本品最初源产自欧洲匈牙利，是欧洲公认的治疗胆囊，旦管炎的首选药物，同时本品还具有良好的側干作用，亦可用于病毒鹏干炎的辅助治疗。药代动力学研赚明它能^鹏旦汁的分泌，防lhff脏棚旨肪变性，免受化学性损害，增加胆汁中&^和胆酸的浓度，且其代谢，中含有一定浓度的甲醛水激(甲醛水激尉共氢体，在人体中起中间逾度作用，不易與虫存在，很容易放出氢，对人体几乎不产生毒副作用)，对胆道、肠纖菌均有抑制作用，从而恢劐朋鍵原有的流体力学性能，长期服用无副作用，不影响肠内正常生理菌群。口服药的大量临^^开赚明:本品对急、慢幽旦囊炎、胆管炎(包JSM流糊旦管炎)、胆结石、月藤切除术后^^M显著疗效，对胃溃疡、十二指肠炎、病毒幽干炎等也有辙子的疗效。目前国内临床上常用的是有羟甲烟胺片、轻甲爛$，无翻狩趣。而羟甲爛安的M^Z症之一的急幽旦囊炎多在夜间突然发作，JJ复航iMU烈绞痛，阵发tiJ瞎，可方划寸至右肩背部^"肩胛骨下角区。常#^恶心呕吐，病M卧不安、^c汗淋漓，随着病瞎的鎌，M^I呈J機或阵发性加剧，范围扩大，甚至呼吸、咳嗽，糊体位亦可働I^加重，说明，已,到胆管周围和腹膜。乡擁时可诱发心绞庸，心电图也有相应改变，即附胃"胆心餘征"。此日賴口果采用口服药进行治疗，就不能即亥懈除急性症状，而翻羟甲烟胺湖剂型4顿，就可ffl3iih住急幽旦囊炎带来的不适反应，解决患者的驗，从临床±*看，翻寸剂即刻m人身体的血縣统，参与循环，起效决，并且临床上证实妊娠合并急倒旦囊炎^^搜索的治疗可以使用羟甲烟胺，皿孕妇无害。羟甲烟胺属于禾鹏药，目前国内禾鹏药剂型单一，以口服为主，避脆急翻人时，让患者和医生^i^择空间。基于战原因及临床上的需求，有必要开发一种會獬决临床危急翻A^f用的禾鹏药，而羟甲爛錢劍多年的临床，娃f扱疗玄娥得到了衞正，检索国内夕卜相关的医药管理当局，至今为止，没见至U羟甲爛安翻摘跑的上市。
发明内容为解决上述一系列问题，本发明的目的在于提供一种临床上使用安全、起效快，能解决肝胆疾病方面危急重病人用药的利胆药的注射剂型。经过多年的研究，我们发明了注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂，这种剂型可静脉注射，或者添加于大输液中进行静脉滴注，可在病人体内迅速起效，并减少了口服药在肝脏方面的首过效应，提高了药物在体内的生物利用度，我们发明的注射用羟甲烟胺冻干粉针剂型生产上冷冻TMS^M下进行，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能f娥原来盼性状并且能更好的傲寺原料的稳定性，千燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解ayi而完全，几乎立即恢^ji来的性状。由^j^B驗真空下謝亍，氧气极少，因此原料不易被氧化顿，并且千燥能排除95-99%以上的7夂份，使千燥后产品能长期保存而:。本品，冻干教货剂型在保存和运输上均更方便，利于工业化大妒和临床上的方便舰。为了达到战目的，本发明的al拥羟甲烟胺冻干私1愤挤晗有作为活〖械分的羟甲卿安和可药用辅料，其中羟甲烟S統冻干私，剂中的重量百分比为50-100%，70-100°/。，更,80-100%。，制剂中的^*范围~#是100-1000mg;，200-800mg;^x^用辅料可以魏自甘露醇、乳糖、明胶、右方繊酐、葡萄糖、氯化钠、糊醇、甘氨酸中的一种^L种，可药用辅料在冻干制剂中的龍百分比可以是0-50%，雌0-30%，更雌0國200/00本发明中，我们需要对处方进行优选，以保证产品的pH值在人体可接受的范围之内。根据羟甲烟胺原料的性质它的pH值在7.2左右，考虑到添加不同的冻干的药用辅料，pH值可能会有变化，根据注射剂的pH值范围，我们将pH值范围定在68，如果不在此范围内，可加0.lmol/L盐^^皿者0.lmol/L織化钠溶M3t衍周节，以使溶液的PH值范围驗68之间。根据试验本发明的制备工艺可能通过下列步骤(1)、称艰占制剂总錢的50-10(P/殺甲爛安，加入继寸用水溶解，,均匀；(2)、称取占帝跻U总龍的0-5(F。顺用辅料，加入至IJJ^羟甲烟胺溶液中，搅拌至，溶解，加继寸用7K至一定^f只，调节溶液的PH^1^6-8，搅拌均匀；(3)、力口入il^溶液总^f只的0.05~0.3%的针用活性碳，10-30併中，将溶M^,Mffi过滤除炭，再用微孔滤膜精滤，離甲烟胺溶液；(4)、取羟甲爛安溶液测定pH值、含量，滤液检查合格后，根l^Si十算灌装溶液的驢，无菌灌驟晒林瓶中；(5)、将灌^l刊勺西林i^夂到冻干机中，冷冻千燥，真空腿，对i!S后中间产品车虚，即f群2甲烟胺冻干私，剂。本发明的制备步骤(3)中采用0.05~0.3%的针用活性:滤可除热原及色素，保证样品溶液的澄親M鄉菌内毒氣翻的微孔滤膜精滤孔径为0.22pm,可保证本品的无菌，本发明的制备关键步骤应在百级净化的无菌条件下生产，特别是精滤、灌装、冻干环节，以保证本品的无菌水平。制备流程图见图l。图1为工艺制备流程图图2为实施例1冻干曲线图3为安全性试验中血管刺激性试验药后14天注射用羟甲烟胺组(5cm)图4为安全性试验中血管刺激性试验药后14天注射用羟甲烟胺组(lcm)图5为实施例1空白辅料液相色谱6为实施例2空白辅料液相色谱7为实施例4空白辅料液相色谱8有关物质系统适用性液相色谱9酸降解试验液相色谱10碱降解试验液相色谱11溶液加热降解试验液相色谱12氧化降解试验液相色谱13最低检测限试验液相色谱14实施例1有关物质液相色谱15实施例2有关物质液相色谱16实施例3有关物质液相色谱17实施例4有关物质液相色谱18羟甲烟胺含量线性关系图具敝施力式下列实施例仅为了进一步说明本发明，而不是限制本发明。实施例1处方羟甲烟胺250g甘露醇_25g注射用水加至5L制备工艺在百级净化的无菌条件下进行制备羟甲烟胺冻干制剂。(1)称取羟甲烟胺250g至混合罐中，加入4000ml的注射用水到混合罐中，搅拌使主药完全溶解；(2)称取甘露醇25g至上述混合罐中，搅拌使完全溶解，加注射用水到5000ml，测定溶液pH值6.31，在6-8范围之内，不需要调节，搅拌均匀；(3)加入上述溶液总体积的0.1%的针用活性碳，搅拌30分钟，将溶液采用钛棒减压过滤除炭，再用0.22nm微孔滤膜精滤，得羟甲烟胺溶液；(4)、取羟甲烟胺溶液测定pH值、用HPLC法测定含量，滤液检査合格后，根据所得^4i十算灌装溶液的驢，^f瓦含羟甲烟胺500mg，无菌灌驗晒林瓶中；(5)、将灌装好的西林并肪妙條干机中，冷冻千燥，真空腿，对HS后中间产品车L^，即f群5甲烟胺冻干^^十剂。冷冻千願牛①.预冻测定溶液的低共熔点，榭阁板驢控制在比低共熔点低2crc，实际控帝脏-35'C至-4CTC，制品《驢超U-35'C以下时，从可见视窗看见冻结成冰；在-30'C以下5小时左右；②.升^B喿前期缓厦升温到制品全白(-25'C左右)，然后升^iM可稍瞎板温与帝1品相近，i^教勺17小时左右；③.再千燥？鹏升至零上缓慢升温，至样品j^t松状，i^^勺8小时左右；冻干曲线见图2。鄉例2处方羟甲烟胺250g右旋糖苷50g^注射用水加至~~制备工艺在百级净化的无菌条件下进行制备羟甲烟胺冻干制剂。(1)称取羟甲烟胺250g至混合罐中，加入4000ml的注射用水到混合罐中，搅拌使主药完全溶解；(2)称取右旋糖苷50g至上述混合罐中，搅拌使完全溶解，加注射用水到5000ml，测定溶液pH值6.29，在6-8范围之内，不需要调节，搅拌均匀；(3)加入上述溶液总体积的0.2%的针用活性碳，搅拌30分钟，将溶液采用钛棒减压过滤除炭，再用0.22阿微孔滤膜精滤，得羟甲烟胺溶液；(4)、m^甲烟胺溶液测定pH值、用HPLC法测定賴，嫩夜检查合格后，根据所得^i十算灌装溶液的M:，^f瓦含羟甲》鹏500mg，无菌灌驗哂林瓶中；(5)、将灌装好的西林iffi夂到冻干机中，冷冻干燥，真Sil塞，对ffiS后中间产品车LM，即f穀圣甲爛安冻干私，剂。冷冻千燥斜牛，同实施例1斜牛进行冷冻千燥，得合格样品。实施例3处方羟甲烟胺300g注射用水加至5L制备工艺在百级净化的无菌条件下进行制备羟甲烟胺冻干制剂。(1)称取羟甲烟胺300g至混合罐中，加入4500ml的注射用水到混合罐中，搅拌使主药完全溶解；(2)加注射用水到5000ml，测定溶液pH值7.42,在6-8范围之内，不需要调节，微糊匀；(3)加入上述溶液总体积的0.2%的针用活性碳，搅拌30分钟，将溶液采用钛棒减压过滤除炭，再用0.22pm微孔滤膜精滤，得羟甲烟胺溶液；(4)、取羟甲烟胺溶液测定pH值、用HPLC法测定賴，搶液检査合格后，根据所得#+算灌装溶液的，^f瓦含羟甲烟胺600mg，无菌灌驗哂林瓶中；(5)、将灌^f子的西林并肪文到冻干机中，冷冻千燥，真空腿，对腿后中间产品车L^，即辯2甲爛安冻干辦十剂。冷冻千M^f牛，同实施例1割牛进行冷冻千燥，得合格样品。鄉例4处方羟甲烟胺200g乳糖_40g^注射用水加至~~^制备工艺在百级净化的无菌条件下进行制备羟甲烟胺冻干制剂。(1)称取羟甲烟胺300g至混合罐中，加入4500ml的注射用水到混合罐中，搅拌使主药完全溶解；(2)称取乳糖40g至上述混合罐中，搅拌使完全溶解，加注射用水到5000ml，测定溶液pH值为5.38，不在6-8范围之内，加0.1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH值7.13，均匀；(3)加入上述溶液总体积的0.1%的针用活性碳，搅拌30分钟，将溶液采用钛棒减压过滤除炭，再用0.22pm微孔滤膜精滤，得羟甲烟胺溶液；(4)、取羟甲烟胺溶液测定pH值、用HPLC法测定含量，滤液检查合格后，根据所得^i憎灌^^液的^S，^fl含羟甲卿安400mg，无菌灌驟晒林瓶中；(5)、将灌^f刊勺西林并肪文到冻干机中，冷冻千燥，真空腿，对腿后中间产品车虚，即^I5甲烟胺冻干私^十剂。冷冻千M^牛，同实施例1割牛进行冷冻千燥，得合格样品。实验例1对本发明生产的注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂进行安全性试验。本发明生产的注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂过敏性、溶血性和血管刺激性试验的研究资料如下l.注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂的过敏性试验U试验目的观察羟甲烟胺静脉注射对豚鼠有无过敏反应，初步考査本品的安全性。1.2受试药品实施例l所得注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂，规格500mg/瓶、灭菌注射用水、卵白蛋白1.3受试动物豚鼠，体重250-350g，雌雄各半，喂以豚鼠专用颗粒饲料，辅以新鲜蔬菜洗净饲用，自由饮水。饲养室温度24土rC，相对湿度50-60%，自然通风。1.4试验方法试验前，参照羟甲烟胺片的使用说明书确定剂量，取2支注射用羟甲烟胺，加10ml注射用水溶解后使用，取健康豚鼠24只，按体重随机分为4组，每组6只，阴性对照组给予注射用水0.5ml致敏，并以配制好的注射用羟甲烟胺溶液腹腔注射l.Oml进行攻击；阳性对照组预先以1%卵白蛋白溶液0.5ml致敏，并以注射用羟甲烟胺l.Oml溶液腹腔注射进行激发；受试药高剂量组以0.5ml注射用羟甲烟胺溶液致敏，并以该药溶液1.0ml溶液腹腔注射进行激发。受试药低剂量组以上述配制好的注射用羟甲烟胺溶液稀释1倍，采用稀释后的0.5ml腹腔注射致敏，并以该药溶液l.Oml溶液腹腔注射进行激发。各组首先隔日肌肉注射药液，共注射3次。于末次给药后第14天由前肢静脉注射相应药物进行激发，剂量见前。于最后一次致敏和激发当日测定每只动物体重。激发当日按表1症状详细观察每只动物静脉注射药物后30分钟内的反应，症状的出现及消失时间。并按表2判断过敏反应发生程度。计算过敏反应发生率。根据过敏反应发生率和发生程度进行综合判断。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>11-19症状+++过&SJS强阳性20卄卄过ic&iS极强阳性1.5试验结果注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂的高、低剂量组豚鼠分别于末次致敏后第14天用对应剂量药物进行攻击均未发生过敏性反应，评分均为0;而阳性对照组豚鼠于注射后5分钟内出现跳跃、呼吸困难，抽搐倒下，而后死亡，评分均为20，过敏反应均呈极强阳性。阴性对照组6只豚鼠均未发生过敏反应，评分均为0。结果见表3。末次致敏和激发当日各组动物体重没有明显差别。综合以上试验结果，注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂全身主动过敏反应为阴性。表3过敏ttSm微结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.6试验结论在本次试验条件下，注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂对受试豚鼠无致敏作用。2.注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂的溶血性试验2.1试验目的观察注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂对家兔红细胞有无溶血和凝集作用，初步考查本品的安全性。2.2受试药品实施例l所得注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂，规格500mg/瓶、灭菌注射用水、卵白蛋白2.3受试动物家兔，体重2.2kg，雄性。饲养室温度24士rC，相对湿度50-60%，自然通风。2.4试验方法2.4.12%红细胞悬液制备取健康家兔l只，颈动脉取血5ml至洁净干燥小烧杯中，用玻璃棒搅拌去纤维蛋白，加入0.9%氯化钠注射液5ml，离心，弃去上清液，再加10ml0.9。/。氯化钠注射液轻轻摇匀，离心，弃去上清液，如此反复几次至上清液不呈红色为止，然后按所得红细胞容积，用灭菌注射用水配制成2%红细胞悬液，置冰箱备用。2.4.2试验步骤试验前，参照羟甲烟胺片使用说明书确定剂量，取l支注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂，打开西林瓶加入2ml注射用水溶解后备用，取试管7支，1-5管分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml的注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂，并用0.9M氯化钠注射液稀释至2.5ml，于6号、7号试管中分别加入0.9%氯化钠注射液及蒸馏水2.5ml(完全溶血对照)。最后每管均加入2%兔红细胞悬液2.5ml，轻轻摇匀，置37。C水浴中，分别记录15min、30min、45min、lh、2h、3h、4h各管的溶血和凝集情况。溶血结果判断标准为-完全溶血溶液澄清，红色，管底无红细胞残留。部分溶血溶液澄清，红色或棕色，管底尚有少量红细胞残留。不溶血红细胞全部下沉，上层液无色澄明。凝集虽不溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不能分散，或出现药物沉淀。2.5试验结果注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂1-5管在4小时内未引起溶血和凝集反应。2.6试验结论本次试验条件下，注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂对兔红细胞无溶血和凝集作用。表明注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂不引起溶血和凝集反应。3.注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂的血管刺激性试验3.1试验目的观察注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂静脉注射对家兔耳缘静脉的刺激性，为临床安全用药提供依据。3.2受试药品实施例l所得注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂，规格500mg/瓶、灭菌注射用水、卵白蛋白3.3受试动物白色家兔，体重2.0-2.5kg，雌雄各半，饲养室温度24±1°C，相对湿度50-60%，自然通风。3.4剂量设计试验前，根据注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂使用说明书确定剂量，取2支注射用羟甲烟胺，加10ml注射用水溶解后使用，注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂剂量设计为5ml/kg，注射用水为5ml/kg，家兔耳缘静脉注射给予。3.5试验方法家兔8只，采用同体左右侧自身对比法，左侧耳缘静脉作为受试药物组，另一侧作为注射用水对照组。左侧每日耳缘静脉注射受试药物5ml/kg，另一侧耳缘静脉亦每日注射5ml/kg注射用水，每日1次，连续3日，末次给药后48h,肉眼观察试验家兔耳缘静脉，并处死4只动物，剪取距注射部位lcm处和5cm处兔耳，置10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，HE染色。剩余动物继续观察注射部位静脉14天，于观察末期，处死剩余动物，剪取距注射部位lcm处和5cm处家兔耳缘静脉，放于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，HE染色。光镜下观察给药后48小时及末次给药14天后对兔耳血管的刺激性反应。3.5.1肉眼观察标准观察注射部位兔耳静脉有无充血、水肿变性、硬结及坏死现象，记录病变程度及出现血管组织变化的家兔数目，血管充血及水肿程度分为0、I、II、III度，0度为无变化，I度为轻微变化，II度为明显变化，III度为严重变化。3.5.2病理组织学检査标准观察注射部位兔耳静脉血管扩张充血、血栓形成、水肿和炎性细胞浸润等改变，每项内容按病变程度分正常、轻、中、重，分别以一、+、++、+++表示。3.6试验结果3.6.1肉眼观察结果家兔末次给药后48小时肉眼观察给药侧与对照侧有充血、水肿等表现，但两组没有明显差别。末次给药后第14天，剩余家兔给药侧与注射用水对照侧均己恢复正常，无任何异常表现。3.6.2病理组织学检査结果(见图3、4)末次给药后48h，家兔双侧耳缘静脉给药lcm及5cm处均未见充血、水肿及出血，周围血管有轻度的炎性细胞浸润，未见硬结和坏死。给药后第14d，注射用水侧与给药侧均未见充血、出血、水肿及硬结和坏死等病理变化，对照侧与给药侧无明显的差异性，试验结果显示注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂对家兔静脉血管没有明显的刺激性。3.7试验结论本次试验条件下，注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂对家兔耳缘静脉无明显局部刺激反应。从以上安全性试验可知，本发明生产的注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂安全性有保证。实验例2本例为本发明实施例产品的理化常数、纯度检査、含量测定等质量研究工作的试验资料。参考WS-10001-(HD-0277)-2002羟甲烟胺及WS-10001-(HD-0278)-2002羟甲烟胺片的质量标准及中国药典2005年版二部的继摘陏关要^^行本品的质量研究。l.性状实施例l-4均为白色块状物。2.鉴别2丄取本品0.15g，加氢氧化钠试液5ml，加热煮沸，即发生氨臭，能使湿润的红色石蕊试纸变蓝色。结果实施例l-4均呈正反应。2.2.取本品约100mg，加2，4-二硝基氯苯50mg，加热熔融，放冷至室温，加乙醇制氢氧化钠试液2ml，振摇，溶液即显暗红色。结果实施例l-4均呈正反应。2.3.取本品约5mg，加入温热的硫酸5ml与2X变色酸二钠溶液5ml的混合液中，即显紫色。结果实施例l-4均呈正反应。3.检查3.1.装量差异取实施例1-4样品各5瓶，照(中国药典2005年版二部附录IB下注射用无菌粉末的装量差异检查)操作，结果实施例l-4样品装量差异限度均小于士5%，符合规定。3.2.酸碱度取实施例1-4样品各1瓶，分别加10ml水溶解后，按(中国药典2005年版二部附录VIH)操作，pH值结果见表4:实施例1234pH值6.426.357.517.29实施例1-4产品的ph值均在我们规定的6-8范围之内，符合规定。3.3.溶液的澄清度与颜色取实施例1-4样品各5瓶，分别加10ml水溶解后，按(中国药典2005年版二部附录IXA第一法)操作，结果见表5:实施例1234澄清度澄清澄清澄清澄清鹏琉琉趙无色实施例l-4产品的澄清度及颜色均符合规定。3.4.水分取实施例1-4样品各5瓶，M/K:分测定法(中国药典2005年版二二部附录VD1M第一法A)测定，结果见表6:实施例1234水分(％)2.572.492.532.67实施例1-4产品的水分均小于3%，说明冻干的质量较好，水分控制的较小，易于产品的保存。3.5.可见异物按照(中国药典2005年版二部附录IXH可见异物检查法)和药品监督管理局的对注射用无菌粉末的相关规定进行实施例1-4样品的检查，均符合规定。3.6.不溶性微粒取实施例l-4的样品，照(中国药典2005年版二部附录IXC)操作，不溶性微粒均符合规定。3.7.细菌内毒素3.7.1.细菌内毒素限值的确定根据细菌内毒素限值公式L-K/M，L为供试品的细菌内毒素限值，中国药典2005年版规定K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg.h)表示，注射剂K^5EU/(kg.h)，M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或U/(kg.h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足l小时，按l小时计算。参考羟甲烟胺片说明书中临床用法用量中最大用量为lg，计算出的限度为每lmg注射用羟甲烟胺的细菌内毒素不得过0.3EU，根据从严要求的原则，将本品的细菌内毒素的限值规定为每lmg注射用羟甲烟胺的细菌内毒素不得过O.IEU。3.7.2.细菌内毒素的测定根据定好的限值，按照细菌内毒素检査法(中国药典2005年版二部附录XIE)检查，先进行方法学验证，在对鲎i叙U灵Sog复核后，刃在行了干扰，证明方法可行的瞎况下，取^i例14的样品进行测定。取实施例1-4的样品各一瓶，用细菌内毒素检査用水稀释成2.5mg/ml的供试品溶液后，照细菌内毒素检査法(中国药典2005年版二部附录XIE)检查。取鲎试剂(生产厂家湛江安度斯生物有限公司，灵敏度0.25EU/ml、规格0.1ml/支)20支，16支分别加入0.1ml细菌内毒素检査用水溶解后，其中8支加入供试品溶液O.lml作为供试品管(每个批号两管)，8支加入0.1ml供试品阳性对照溶液(用被测供试品溶液将同一支细菌内毒素工作标准品制成2入的内毒素溶液，每个批号两管)作为供试品阳性对照管，剩下的4支中2支加入O.lml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管，2支加入(2A)细菌内毒素工作标准品溶液O.lml作为阳性对照管。将试管中溶液轻轻混匀，封闭管口，垂直放于37士rC恒温器中，保温60±2分钟。依法观察结果，实施例l-4样品细菌内毒素均符合规定，均小于O.lEU/mg。取实施例1-4的样品各20瓶，首先照薄膜过滤法(中国药典2005年版二部附录XIH)进行方法学验证，验证合格后，依法测定样品的无菌。供试品溶液的制备及测定阳性对照大肠埃希菌取实施例1-4的样品各20瓶，每瓶各加0.9%无菌氯化钠溶液10ml使溶解，将每个实施例的样品合并，分成两份，各转移至500ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，备用。按薄膜过滤法过滤至滤筒中(3联虔)，用0.1%蛋白胨水溶液冲洗，每次300ml，共冲洗3次，冲洗后，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内，其中一管加入阳性菌液小于100cfli作阳性对照，另分别做需气菌、厌气菌和真菌的阴性对照，分别按温度要求培养14天。逐日观察，结果实施例l-4样品的无菌均符合规定。根据无菌的结果，说明我们在制备样品时，在百级净化无菌条件下生产的冻干样品无菌均能得到有效保证，这也是注射剂目前最关注的质量品质中最重要的一方面。3.9.有关物质照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VD)测定。有关物质是现在的药品质量标准里严格控制的一个指标，原国家标准羟甲烟胺原料及片的标准里均未收载有关物质项，我们参考武玉敏等的HPLC法测定羟甲烟P3安的含量[《齐鲁药事》2005年第24巻第01期]一文中的条件和方法来建立本发明的产品的有关物质测定方法。文献中的色谱条件色谱柱用十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂流动相以甲醇-磷酸二氢钠(pf^6.0)(10:90)为流动相检测波长261nm参考此条件对实施例1-4的样品进行有关物质的方法学试验及检査。色谱柱kromasilC18(250mmX4.6mm，5um)仪器ShimadzuLC10A-Tvp液相色谱仪样品测定浓度200yg/ml，样品配制溶液流动相进样量20ul3.9丄空白辅料的干扰实施例l、2、4均有可药用辅料，因此需要排除空白辅料的干扰试验，取实施例l、2、4处方比例的空白辅料，加甲醇配制成空白溶液进行检查，结果表明空白辅料无干扰，见图5、6、7。3.9.2.系统适用性试验取实施例3的样品一支，称取20mg细粉，加流动相溶解并稀释至100ml量瓶中，摇匀，取20uHiA液相，记雜谱图，从图中可看出，主峰+贫女大于3000，峰形良好，与相邻杂质分离度大于2，系^OT性良好，见图83.9.3.降解试验取实施例1样品1支，加流动相制成每lml约含2mg的溶液，作为贮备液。A.酸降解试验量取贮备液lml，力CIlmol/L盐酸溶液lml，室温放置30分钟，力Qlmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至中性，加流动相稀释至10ml，摇匀。取20pl注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3倍，见图9。B.碱降解试验量取贮备液lml，加lmol/L氢氧化钠溶液lml，室温放置30分钟，加lmol/L盐酸溶液调节pH值至中性，加流动相稀释至10ml，摇匀。取20ili1注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3倍，见图10。C.溶液加热降解试验量取贮备液lml，加流动相2ml，置80。C水浴加热20分钟，冷却至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，取20|al注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3倍，见图11。D.氧化降解试验量取贮备液lml，加流动相2ml,加30%双氧水5滴，加流动相稀释至10ml，摇匀。取20pl注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3倍，同时进行双氧水空白试验见图12。结论通过对本品的降解试验可以看出，本品在上述各降解条件下，所产生的各降解产物均能与主峰良好分离，主峰与各相邻降解产物的分离度均大于2，系统适用性良好，说明本色谱条件测定有关物质准确可行。3.9.4.最低检测限试验取降解贮备液，加流动相逐步稀释后，取20W注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰峰高约为基线噪声的3倍为止，最低检测限约为20ng/ml，见图13。3.9.5.实施例l-4样品有关物质检测取实施例1-4样品装量差异项下内容物分别混匀，研细，按1-4的处方分别称取适量(约相当于羟甲烟胺20mg)，分别置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取各供试品溶液各lml置100ml量瓶中加流动相稀释后做对照溶液，精密量取各供试品溶液及对照溶液各20pl注入液相色谱仪，记录色谱图至羟甲烟胺主峰保留时间的2倍，按外标法以峰面积计算各实施例样品的有关物质，测定结果见表7，色谱图见图14-17。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.含量测定羟甲烟胺和羟甲烟胺片国家标准均采用的是滴定法测定含量，考虑到处方中有辅料，采用高效液相色谱法测定羟甲烟胺的含量，方法操作更为简便，结果准确，重现性好，灵敏度高，可作为实际生产中质量控制的方法。因此参考有关文献采用和上述有关物质一样的色谱条件和方法测定羟甲烟胺的含量。色谱条件色谱柱用十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂流动相以甲醇-磷酸二氢钠(pH-6.0)(10:90)为流动相检测波长261nm色谱柱kromasilC18(250mmX4.6隱，5wm)仪器ShimadzuLC1OA-Tvp液相色谱仪样品测定浓度200u^ml，样品配制溶液流动相进職20ul4.1.线性关系精密称取羟甲烟胺对照品适量，加流动相溶解并制成每lml含0.5mg的溶液，作为贮备液。精密量取贮备液适量，加流动相制成一系列浓度的溶液。分别取2(^1注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积浓度绘制标准曲线，结果见表8，线性关系见图18:鹏Oig/ml)25.751.3102.7205.3513.3平均峰面积51452410245982121171404662410001220线性方程A=19399C+56324相絲数R20.99994.2.精密度试验取线性关系项下浓度为205.3^ml的溶^^进样6次，i碌峰面积'结果见表9。进样微123456峰面积404662440123864122058403957640752833989712RSD1.164.3.回收率试验实施例l、2、4处方里有药用辅料，实施例3处方里没有添加辅料，测定主药含量需要排除辅料对主药的影响，因此我们通过回收率试验来判断此方法测定含量的准确性。16称取实施例1处方量的辅料，置100ml量瓶中(平行9份)，向每个量瓶中加入羟甲烟胺对照品各约160mg、200mg、240mg(各3份)，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别取5ml置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀至刻度，分别取2(Hil注入液相色谱仪，记录色谱图。另取羟甲'烟胺对照品力口流动相制成每lml含200pg的溶液，作为对照品溶液，同法测定，按外标纟去以峰面积计算回收率及RSD，并取实施例2、4同法操作，结果见表10-12:表10:实施例1回收率结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表ll:实施例2回收率结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表12:实施例4回收率结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>组间RSD(%)_^从以上回收率实验结果可知，各实施例辅料不干扰羟甲烟胺含量测定，加样回收率均在98.0%102.0%之间，组内组间RSD均小于2%，回收率较好。4.4.重复性试验取实施例l装量差异项下样品，配制成200pg/ml的溶液，测定含量，平行6份，计算6次结果的含量和RSD，结果见表13。平行份数123456缝(％)100.399.798.599.799.297.3平i^i(%)99.1RSD1.084.5.含量测定根据上述进行的含量方法学，说明能准确测定实施例1-4中羟甲烟胺的含量。测定法取实施例2、3、4装量差异项下的样品混匀(实施例上述重复性试验中己经测定，不需要重复测定)，研细，精密称取适量(约相当于羟甲烟胺20mg)，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，各平行2份，精密量取注入液相色谱仪，记录色谱图。另取羟甲烟胺对照品加流动相制成每lml含200ng的溶液，作为对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算各样品含量，即得。实施例l-4的测定结果，见表14。实施例1234含量(％)99.11023100.598.7实验例3根据中国药典2005年版二部附录"药物稳定性试验指导原则"的要求，对本发明实施例1样品进行稳定性考察，考査条件包括影响因素试验、加速试验、长期试验；考察项目包括性状、酸碱度、溶液的澄清度与颜色、有关物质、含量。(可见异物、无菌，细菌内毒素在加速试验最后一个月和长期试验最后一个月中考查)。考查条件1.影响因素试验1.1.光照试验(45001x土5001x)取实施例1样品适量置4500k土5001x照度条件下放置10天，于第5，10天取样测定，并与o天数据对比。1.2.高温试验(60°C)取实施例1样品适量6(TC的恒温箱中放置10天，于第5、10天取样测定，并与0天数据对比。1.3.高湿试验(RH92.5%)取实施例1样品适量，打开西林瓶盖，置相对湿度为92.5%(饱和KN03溶液)的容器中放置10天，于第5、IO天取样测定，并与0天数据对比。2.加速试验取本发明的实施例1、3样品各适量(选取一个有浦^4，一个无辅料的处方样品进行)，置加速条件下(40°C，RH75%±5°/。)放置6个月，并于第1、2、3、6月末取样测定，并与0月数据对比。3.长期留样试验取本发明的实施例l、3样品各适量，置室温条f牛下(25°C，RH60%±5%)放置36个月，并于第3、6、9、12、18、24、36月末取样测定，并与0月数据对比。考査结果稳定性结果见表15-19。表15:影响因素i微结果割牛时间田外观性状水分(%)酸繊溶液,青度与鹏有鄉质(%)缠(%)0白色块状物2.576.42澄清雜0.4999.1高温(60。C)5白舰状物2.346.47澄清雜0.5298.710白色块状物2.286.53澄氣琉0.5599.3離(92.5%)5白舰状物2.896.55澄清s琉0.4798.210白激状物2.946.49撒青、趟0.51100.5光照5白激状物2.536.41澄清无色0.6398.1(45001x)10白色块状物2.626.38澄清、趙0.6897.9表16:头施例1力腿微6个月结果时间(月)外观性状水分(%)酸鹏可见鳓〒#细菌内琉歸有鄉质(%)賴(％)0白敏状物2.576.42船规定船规定船规定0.4999.11白色块状物2.546.45///0.5299.52白色块状物2.436.52///0.4799.83白色块状物2.386.49///0.53腦.16白色块状物2.406.38船鹏船规定船规定0.5898.2表17:实施例3力卩速逸验6个月结果-时间(月)外观性状水分(%)可见溯无菌细菌内毒素有鄉质(%)賴(％)0白色块状物2.537.51符合规定符合规定符合规定0.52100.51白激状物2.487.48///0.54101.72白色块状物2.427.54///0.4999.83白色块状物2.397.60///0.5598.96白色块糊2.417.67船规定船规定船规定0.6099.2表18:实施例l长mi^验24个月结果:时间(月)外观性状水分(%)酸鹏可见溯无菌细菌内毒素有鄉质(%)賴(％)0白色块状物2.576.42船规定船规定船规定0.4999.13白舰状物2.436.48///0.5398.86白色块糊2.526.39///0.48100.49白色块状物2.646.45///0.4699.712白色块状物2.556.47///0.5598.218白舰糊2.616.32///0.45100.924白色块状物2.486.40符合规定符合规定符合规定0.5399.6表19:实施例3长其服验24个月结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>稳定性考查结论影响因素试验结论本发明样品在各影响因素条件下10天，在光照试验条件下有关物质略有增加，但是增加的幅度很小，其他各条件各项指标与0天相比基本无明显变化。加速试验结论本发明样品(选取了一个有辅料，一个无辅料的样品)在西林瓶中，在加速试验条件下6个月，各稳定性考査项目与O天相比基本无变化。长期试验结论本发明样品(选取了一个有辅料，一个无辅料的样品)在西林瓶中，在长期试验条件下24个月(室温条件)，各稳定性考查项目与0天相比基本无变化。上述稳定性试验结果表明本发明产品稳定性良好。权利要求1、一种注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂，含有活性或分羟甲烟胺和可药用辅料，其特征在于在冻干粉针剂中是由下述重量百分比的原料及药用辅料制成羟甲烟胺50-100％，其在制剂中的含量范围是100-1000mg；可药用辅料在冻干粉针制剂中的重量百分比为0-50％。2、如权利要求i戶;M的Sit用羟甲'J;邸安冻干^^愤哜U，欺寺征在于羟甲'卿雜冻干辦悄脐U中的驢百分比可以是70-10TO，TO用辅半被冻干^l愤挤l冲的驢百分比可以是0-30%。3、如权利要求1所述的^l拥羟甲烟胺冻干私^愤厠，其特征在于羟甲卿雜冻干辦愤厠中的驢百分比可以是80-100%，可药用辅f被冻干教^愤挤仲的龍百分比可以是0-20°/。。4、如权利要求1戶腿的ai拥羟甲烟胺冻干辦悄挤!j，期寺征在于羟甲烟月统冻干^l愤挤l]中的賴范围是200-800mg。5、如权利要求1所述的^lt用羟甲炬ll安冻干粉^t^剂，欺寺征在于戶，的药用辅料可以选自甘露醇、乳糖、明胶、右方鎌酐、葡萄糖、氯化钠、滩醇、甘氨酸中的一种就种。6、如权利要求1至4戶腿的^|寸用羟甲烟胺冻干辦怖挤[]，欺寺征在于戶腿的药用辅料为甘露醇。7、如权利要求l至4戶脱的ai寸用羟甲烟胺冻干辦愤挤啲制备方法，期寺征在于鄉雄括如下过程(1)、称取占帝跻U总龍的50-IOW殺甲'胭安，加入ait用水溶解，均匀；(2)、称取占审跻脇龍的0-50%可药用辅料，力口入到J^羟甲爛安溶液中，搅拌至顿溶解，力口SI寸用水至一定4祸只，调节溶液的pH值为6-8，搅拌均匀；(3)、加入Jd^溶液总^f只的0.05-0.3%的针用活性碳，IU半10-30併中，将溶^ffl,爐MJBl滤除炭，再用微孔滤膜精滤，離甲烟胺溶液；(4)、取羟甲烟胺溶液测定pH值、賴，滤液检査合格后，根齢:li十算灌装溶液的M，无菌灌装到西林瓶中；(5)、将灌激的西林并肪文到冻干机中，冷冻千燥，真SCT，对J5S后中间产品车虚，即f群5甲'卿安冻干私，剂。8、如权利要求6戶腿的翻拥羟甲烟胺冻干辦怫挤啲审恪方法，期寺征在于臓微孔滤膜孔径是O.22,9、如权利要求6戶脱的、翻拥羟甲烟胺冻干辦愤哜啲制备方法，期寺征在于戶;M步骤(2)中调pHf細0.lmol/L盐酸溶液。10、如权利要求6戶腿的ai寸用羟甲烟胺冻干粉^愤挤啲制备方法，欺寺征在于:戶;M步骤(2)中调pFH細0.1mol/L氢氧化钠溶液。全文摘要本发明提供了一种注射用羟甲烟胺冻干粉针制剂及其制备方法。本发明的冻干粉针剂型生产上冷冻干燥在低温下进行，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能更好的保持原料的稳定性。本品采用冻干粉针剂型在保存和运输上均更方便，利于工业化大生产和临床上的方便使用。本品可静脉注射，或者添加于大输液中进行静脉滴注，可在病人体内迅速起效，并减少了口服药在肝脏方面的首过效应，提高了药物在体内的生物利用度。本品可含有活性成分羟甲烟胺和可药用辅料，是由下述重量百分比的原料及药用辅料制成羟甲烟胺50-100％，其在制剂中的含量范围是100-1000mg；可药用辅料在冻干粉针制剂中的重量百分比为0-50％。文档编号A61K9/19GK101612129SQ200910032158公开日2009年12月30日申请日期2009年7月10日优先权日2009年7月10日发明者燕立波,丽王,陶义华,黄迎春申请人:江苏开元医药化工有限公司;南京赛诺科技有限公司;安徽赛诺医药化工有限公司