专利名称：：荜拔酰胺类化合物抗血小板聚集的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药成分的新用途，具体的说，涉及荜拔酰胺类化合物在抗血小板聚集方面的用途。
背景技术：
：心脑血管疾病是当今世界上威胁人类健康的最严重的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤而跃居世界第一。2005年中国卫生部公布的资料显示中国人口的总死亡率中，心脑血管疾病死亡率高居首位，城市居民脑血管死亡率达21.2%，心脏病死亡率17.9%;而农村居民脑血管死亡率也达21.2%，心脏病死亡率11.8%，每年有大约260万人死于心血管疾病。动脉粥样硬化、斑块破裂、血栓(thrombus)的形成是心脑血管疾病突发的直接原因，血栓类疾病已经成为人类健康的第一杀手。目前认为血栓形成是复合因素所引起的，其中血管壁、血小板、血流速度、血液黏度和凝血活性等均有重要作用。近期的研究表明在血栓性疾病中，血小板活化与血栓形成存在密切关系。血小板在止血与血栓形成中，通过下面两种机制发挥作用①血小板是栓子中的主要组成成分，特别是在动脉血栓形成中，以及在微小血管的微血栓子形成中；②通过其促栓作用及释放产物，有利于血小板聚集，栓子形成，刺激白细胞以及损伤内皮细胞，促进血液凝固，有利于血栓形成。例如，在冠心病中，血小板外形变化为刺激型(血小板伪足形成)增多，血小板黏附性和血小板对各种聚集诱导剂(ADP，肾上腺素，胶原或花生四烯酸)的聚集反应增强，血浆中血小板释放产物(ADP、5-ΗΤ、β-TG,ΤΧΑ2等)浓度增高，血小板α颗粒膜蛋白(GMP-140)在血小板表面及血浆中浓度增强，这些研究都表明血小板活化是血栓形成的重要病理机制之一。导致血小板活化的基本原因有两点①特殊流场下导致血小板活化；②各种刺激物，包括药物，生物活性物，化学物以及免疫抑制剂等，在临床研究中已报道了导致血小板活化的原因。血栓的形成机制表明作用于血小板黏附、激活、聚集和血栓形成中的任何环节可能对血栓栓塞性疾病起预防和治疗作用.因此，抗血小板聚集治疗是预防血栓类疾病的最有效方法之一，尤其在白色血栓如动脉血栓形成中。阿司匹林(aspirin)是目前唯一有大量循证医学证据，可应用于一级、二级预防领域的抗血小板药物，它是环氧化酶(C0X-1)相对选择性的抑制剂，能使C0X-1的活性部位的丝氨酸乙酰化，从而导致C0X-1永久失活，C0X-1是花生四烯酸生成血栓素A2(thromboxaneA2，TXA2)和前列腺素H2(prostaglandinH2，PGH2)等前列腺素合成过程中的关键限速酶。血栓素是强效的血管收缩因子和促血小板聚集因子。这种抑制作用在血小板是不可逆的，一次口服剂量后抑制作用持续47天(血小板寿命仅710天)，血小板无DNA，本身不能再合成环氧化酶。大量临床试验显示，阿司匹林在高危患者发生心肌梗死、缺血性脑血管病的一级预防中是一种有效的抗血小板药物。但是大量的临床证据也表明有10%20%的接受阿司匹林治疗病人在5年内又再次发生血管事件的经历。这种阿司匹林不能预防血栓形成事件的发生，或不能有效抑制血小板聚集和血栓素形成的现象，称为阿司匹林抵抗(aspirinresistance,AR)。AR可能与血小板激活的替代途径、阿司匹林对血栓素的生物合成不敏感、药物间的相互作用以及阿司匹林剂量过低等多种因素相关。很难用某一种机制解释清楚所有的AR现象，但不可否认的是AR存在一定的群体特征，也就是在不同的人群当中，不同的原因可能导致相同的特征结果。研究表明大约5%60%的人群具有不同程度的阿司匹林抵抗现象，对于已出现AR的人群，一般处理方法是联合其他抗血小板药物如氯毗格雷(clopidogrel)、噻氯匹啶(抵克立得，ticlopidine)等替代。但这些药物也不同程度的存在着类似AR的同样现象。另一方面，两种抗血小板药物联合应用，会使患者严重出血的危险性大大增高，因此联合应用其他抗血小板药物或替代用药也不是一种理想的方法。综合上述，开发一种耐药性低、副作用少的抗血小板药物对于血栓类疾病的治疗具有重要的意义。
发明内容本发明的目的是提供荜拔酰胺类化合物在抗血小板聚集的应用。具体的说，本发明的一个目的提供荜拔酰胺类化合物在制备防治血栓药物及保健品的应用；本发明的另一目是提供荜拔酰胺类化合物在制备防治心脑血管疾病药物及保健品上的应用。荜拔，也称荜茇、荜拔梨、鼠尾等，为胡椒科胡椒属多年生草质藤本植物，原产印度尼西亚、越南等国，在我国云南、广东等地也有栽培。由于荜拔的果实中含有挥发油和胡椒碱，常用作调味品，比如酱卤制品的调香等。中医认为其性热、味辛，归胃、大肠经。据《中国药典》记载其具有温中散寒，下气止痛的功效，用于脘腹冷痛，呕吐，泄泻，偏头痛；外治牙痛。现代医学研究表明荜拔果实富含荜拔酰胺(piplartine，piperlongumine),二S荜拔酉先胺(dihydropiper-longuminine),古月椒酉先胺(piperine,pipercide),棕榈酸(palmiticacid)，四M1古月酸(tetrahydropipericacid)，BlRPjS(piperine)，芝麻素(sesamin)，几内亚胡椒酰胺(guine-ensine)，N-异丁基十八碳_2，4_二烯酰胺(N-isobutyloc-tadeca-2(E)，4(E)-dien-amide)，N-异丁基二十碳_2，4-二烯酰胺(N_isobutyl-eicosa-2(E)_4(E)-dienamide)等多种化学成分。荜拔作为一味传统的中草药，已经有了广泛的应用，CN1096693A提供用于治疗牙痛的组方，CN1128164A提供用于治疗鼻炎的组方，CN1768844A提供用于治疗胃痛的组方，CN1579440A提供用于治疗颈椎病的组方，CN101524508A提供用于防治禽鸟类禽流感的组方等。W02008/147483A2提供了荜拔酰胺及其类似物在治疗海马体损伤引发的神经组织相关疾病的方法，W02009/038684A1提供了荜拔酰胺在一种进行性中枢神经系统多发脱髓鞘病PML(progressivemutifo-calIeukoenc印hathy，进行性多灶性脑白质病)的治疗方法；W02009/114126A1提供了荜拔酰胺及其类似物在治疗癌症方面的应用。本发明人通过研究发现，荜拔酰胺类化合物在对抗血小板聚集方面有显著作用，因此，本发明的目的是提供荜拔酰胺类化合物在制备防治血栓药物及保健品的应用；以及荜拔酰胺类化合物在制备防治心脑血管疾病药物及保健品上的应用。本发明所述的荜拔酰胺类化合物是通式(1)所示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>或通式⑵所示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R选自下述残基中的一种<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>优选的R为下述残基中的一种<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>R1,R2,R3分别独立地表示氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、卤素、-NH2或烷基取代胺基；优选R1,R2,R3分别独立地表示羟基、甲氧基或乙氧基。实验结果表明，上述荜拔酰胺类化合物除了对由凝血酶引起的血小板聚集抑制效率较差外，对胶原蛋白、花生四烯酸与血小板活性因子所引发的血小板聚集有明显的效果，抑制效率好于阿司匹林，而且抑制效率与化合物浓度也成线性关系。这充分说明了荜拔酰胺类化合物作为一类潜在的抗血栓药物有着十分广阔的前景。目前，荜拔酰胺的主要来源还是从荜拔等胡椒科植物的根、茎、叶和果实中ilM(Phytochemistry.1997,44,727.；Phytochemistry.2000,53,51.；BiochemicalSystematicsandEcology2005，33，753.)。荜拔酰胺类化合物的制备主要是通过3，4，5，-三甲氧基肉桂酸与相应的胺基化合物缩合得到(Phytother.Res.2008，22，1195.)由于该类化合物对由各种原因，如胶原蛋白、花生四烯酸与血小板活性因子，也包括由凝血酶所引发的血小板聚集起明显的抑制作用，本发明将荜拔酰胺类化合物用于制备防治血栓的药物及保健品，从而达到防治血栓的目的；另外，该类化合物也可用于制备防治心脑血管疾病药物及保健品，通过抑制血小板聚集达到防治心脑血管疾病的目的。本发明所述的防治血栓或防治心脑血管疾病的药物，是将上述荜拔酰胺类化合物中的一种或多种作为有效成分，以本领域常用的方法，添加本领域常用的各种药用载体制成各种剂型，如注射液、片剂、胶囊剂、颗粒剂等，其施用量可由本领域技术人员根据常识及患者情况决定。本发明所述的防治血栓或防治心脑血管疾病的保健品，是将上述荜拔酰胺类化合物中的一种或多种作为有效成分，以制备保健品的常用方法，添加各种常用的载体制成，其施用量可由本领域技术人员根据常识决定。具体实施例方式下面通过实验例，进一步说明荜拔酰胺类化合物在抗血小板聚集方面的作用，表明荜拔酰胺类化合物可作为防治血栓药物及保健品。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1实验材料实验所用阿司匹林购于AlfaAesar，3，4，5，-三甲氧基肉桂酸购于Acros,5,6-二氢-2(1)-吡啶酮与1,2,3,4-四氢吡啶按照文献合成(Jerchel，Ber.，1943，76B，413J.Org.Chem.1961，26，718;J.Org.Chem.1964，29，2472)，异丁胺，DCC(二环己基碳二亚胺)和常用溶剂购自北京化学试剂公司，溶剂均为分析纯，如无特殊要求，溶剂直接使用。二氯甲烷干燥方法氢化钙重蒸干燥。荜拔酰胺及其衍生物PL，P-I,P-2，P-3均为自行制备(具体结构式如下)OOTTJ、IwH3CO^VO^jH3CO^VOCH3p|_0CH3P-1OOH3CO^^ANCH2Ch2(CH3)2H3CO^VH3CO^VOCH3p_2OCH3p_3荜拔酰胺类化合物的制备荜拔酰胺(PL)的合成3，4，5，-三甲氧基肉桂酸(0.714g,3mmol)溶解在25ml干燥二氯甲烷中，加入5，6-二氢-2(1)-吡啶酮(0.35g，3.6mmol)，反应体系冷却至-20V，加入DCC(0.68g，3.3mmol)，反应体系逐渐回暖至室温，继续反应过夜。反应完全后，反应体系分别用饱和NaHCO3溶液和二次水洗涤，有机相用硫酸镁干燥，浓缩，粗品用硅胶柱分离(淋洗剂石油醚/乙酸乙酯=1/1)得到荜拔酰胺0.6g，产率63%01H-NMR(400MHz，CDCl3,ppm)δ2.45(m，2Η)，3·92(s，9H)，4·05(m，2H)，6·12(m,1Η)，6·80(s，2H)，6·94(m,1Η)，7·37(m，lH)，7.75(m，1Η)·MS—EI(m/z):317(Μ)+。化合物P-I的合成3，4，5，-三甲氧基肉桂酸(0.714g，3mmol)溶解在25ml干燥二氯甲烷中，加入1,2,3,4-四氢吡啶(0.3g，3.6mmol)，反应体系冷却至-20°C，加入dcc(0.68g，3.3mmol)，反应体系逐渐回暖至室温，继续反应过夜。反应完全后，反应体系分别用饱和NaHCO3溶液和二次水洗涤，有机相用硫酸镁干燥，浓缩，粗品用硅胶柱分离(淋洗剂石油醚/乙酸乙酯=1/1)得到目标产物ο.53g，产率58%。1H-Nmr=GoomHz,cdci3，ppm)δ:1.48(m，2H)，2·05(m，2H)，3.90(s，9H)，4·23(t，2H)，5·09(m,1H)，6.81(s，2H)，7.05(m,1H)，7.35(m,1H)，7.73(m,1H)·MS-EI(m/z)303(M)+。化合物P-2的合成三乙胺0.56ml(4mmol)加入溶有3，4，5，-三甲氧基肉桂酸0.72g(3mmol)的干燥二氯甲烷5ml中，溶液冷却至0°C，搅拌20min，并缓慢滴加0.42ml新戊酰氯(3.5mmol)，反应逐渐回暖至室温，继续反应2h，减压除去过量的反应物与二氯甲烷，得到3，4，5，-三甲氧基肉桂酰氯。异丁胺(1.lg，15mmol)与三乙胺(0.38g，4.5mmol)溶解在15ml干燥二氯甲烷中，反应体系冷却至0°C，缓慢滴加溶有3，4，5，-三甲氧基肉桂酰氯(0.77g，3mmol)的IOml二氯甲烷溶液，反应体系逐渐回暖至室温，继续反应4h。反应完全后，反应体系分别用IMHCl溶液和二次水洗涤，有机相用硫酸镁干燥，浓缩，粗品用硅胶柱分离(淋洗剂石油醚/乙酸乙酯=1/1)得到目标产物0.64g，产率73%。1H-NMR:(400MHz,CDCl3,ppm)δ0.89(d,6H),2.12(m，1H)，2·96(m，2H)，3·90(s，9H)，6·81(s，2H)，7.37(m,1H)，7.70(m,1H)，8.06(b,1H).MS-EI(m/z)293(M)+。化合物P-3的合成3，4，5，_三甲氧基肉桂酸4.76g(0.02mol)溶于80ml乙醇中，并加入0.4gl0%Pd/C，反应体系抽真空，并冲入高纯氮，再抽真空，冲入氢气，反复置换三次，保持体系内氢气气压(外接氢气球)，室温反应24h，至原料完全反应，过滤，滤掉催化齐U，用乙醇洗涤滤渣，合并有机相，浓缩得粗品，粗品用CH3OH-H2O重结晶得白色固体4.56g，收率95%。3，，4，，5，，_三甲氧基-3-苯丙酸(0.72g,3mmol)溶解在25ml干燥二氯甲烷中，加入5,6-二氢-2(1)-吡啶酮(0.35g，3.6mmol)，反应体系冷却至-20°C，加入DCC(0.68g，3.3mmol)，反应体系逐渐回暖至室温，继续反应过夜。反应完全后，反应体系分别用饱和NaHCO3溶液和二次水洗涤，有机相用硫酸镁干燥，浓缩，粗品用硅胶柱分离(淋洗剂石油醚/乙酸乙酯=1/1)得到目标化合物0.64g，产率67%。1H-WR=GooMHzADCl^ppm)δ2.31(m,2H)，2.53(m,2H)，2.90(t,2H)，3.47(t,2H)，3.85(s,9H)，6.16(m,1H)，6.54(s,1H)，6.83(m，2H).MS-EI(m/z):319(M)+。实施例2实验动物二级雄性大白鼠由北京大学动物中心提供，实验所需的EDTA，HEPES,KCl,DMS0，牛血清蛋白购自华美生物工程有限公司(中国武汉)。实验仪器库尔特颗粒计数仪(MS3型，Coulter公司，美国)，血小板聚集仪(470-vs,Chrono-Iog公司，美国)实验方法在雄性大白鼠的耳廓处取血，并加入1/10体积的0.的EDTA溶液以防止血凝固。并把血样用230g力的离心机离心10分钟，以获取血小板富集血样(Plateletrichplasma,PRP)；再把血小板富集血样用800g力的离心机离心15分钟，血小板就沉积在离心管壁和底部，收集血小板，并用含有0.35%牛血清蛋白和0.4mMEGTA的HEPES缓冲溶液(137mMNaCl,2.7mMKCl,ImMMgC12，5.6mM葡萄糖溶液and3.8mMHEPES，pH=6.5)冲洗两次；再把血小板悬浮在pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，调节血小板浓度为3XIO8个/ml，并用MS3型库尔特颗粒计数仪(CoulterCounter)计数，血小板聚集度用血小板聚集仪测定。按以上操作处理好的血小板悬浮液在分别加入0.5%DMSO(空白对照组)、各种浓度的荜拔酰胺类化合物(PL，P-I,P-2，P-3)的溶液、各种浓度的阿司匹林溶液(AS对照组)在血小板凝聚计中37°C培养三分钟，再在各血小板培养液中分别加入胶原蛋白(collagen，2mg/ml)，花生四烯酸(AA，IOOmM)，凝血酶(thrombin，。·lunit/ml)，血小板活化因子(PAF，10nM)等加速血小板聚集。十分钟后，利用血小板培养液的透光率来测定血小板的聚集度，计算抑制率抑制率(%)=[(A)-(B)]/(A)X100，其中A=空白对照组聚集度％；B=样品聚集度％。结果见表1-5表1荜拔酰胺类化合物对胶原蛋白引发血小板聚集实验效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2荜拔酰胺类化合物对花生四烯酸(AA)引发血小板聚集实验效果<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表4荜拔酰胺类化合物对血小板活化因子(PAF)引发血小板聚集实验效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>AS:阿司匹林表5各组抑制血小板聚集效率(％)比较结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注各组别所取浓度均为300μΜ。实验结果表明荜拔酰胺类化合物对胶原蛋白、花生四烯酸与血小板活性因子所引发的血小板聚集有明显的效果，抑制效率好于阿司匹林，而且抑制效率与化合物浓度也成线性关系；对由凝血酶引起的血小板聚集也有一定的抑制效果。特别是荜拔酰胺(PL)，对各种因素所引起的血小板聚集均有很好的抑制作用。这充分说明了荜拔酰胺类化合物作为一类潜在的抗血栓药物有着十分广阔的前景。权利要求荜拔酰胺类化合物在抗血小板聚集的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是指荜拔酰胺类化合物在制备防治血栓药物及保健品的应用。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是指荜拔酰胺类化合物在制备防治心脑血管疾病药物及保健品上的应用。4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的荜拔酰胺类化合物是通式(1)所示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R选自下述残基中的一种<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>R1,R2,R3分别独立地表示氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、卤素、-NH2或烷基取代胺基。5.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的荜拔酰胺类化合物是通式(2)所示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R选自下述残基中的一种<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>R1,R2,R3分别独立地表示氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、卤素、-NH2或烷基取代胺基。6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的荜拔酰胺类化合物的通式中，所述R为下述残基中的一种<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>7.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的荜拔酰胺类化合物的通式中，所述R1,R2,R3分别独立地表示羟基、甲氧基或乙氧基。全文摘要本发明涉及荜拔酰胺类化合物在抗血小板聚集的应用，具体的说，本发明所述的应用可将荜拔酰胺类化合物用于制备防治血栓药物及保健品，或用于制备防治心脑血管疾病药物及保健品。实验结果表明，荜拔酰胺类化合物对胶原蛋白、花生四烯酸与血小板活性因子所引发的血小板聚集有明显的效果，抑制效率好于阿司匹林，而且抑制效率与化合物浓度也成线性关系。这充分说明了荜拔酰胺类化合物作为一类抗血栓或防治心脑血管的药物或保健品有着十分广阔的前景。文档编号A61P9/00GK101810612SQ20091024304公开日2010年8月25日申请日期2009年12月22日优先权日2009年12月22日发明者余明辉,高源申请人:北京欧凯纳斯科技有限公司