专利名称：1d05 pcsk9拮抗剂的制作方法
1D05 PCSK9拮抗剂相关申请的交叉引用本申请要求申请日为2008年2月7日的美国临时专利申请61/063，949和申请日 为2008年2月21日的美国临时专利申请61/066，577的优先权。关于联邦政府资助研发的相关声明不适用。微缩胶片附录的引用不适用。
背景技术：
枯草溶菌素转化酶9(下文称为“PCSK9”)，亦称作神经细胞凋亡调节转化酶 1("NARC-I")是蛋白酶K样的枯草杆菌酶，经鉴定为分泌性枯草杆菌酶家族中的第9个成员 (见 kidah 等人，2003PNAS100 :928-933)。PCSK9 基因位于人类染色体 lp33-p;34. 3 (Seidah 等人，同上)。PCSK9表达于具有增殖和分化能力的细胞中，包括，例如肝细胞、肾间质细胞、 回肠与结肠上皮细胞和胚胎端脑神经元等Geidah等人，同上)。最初合成的PCSK9为非活性酶前体或酶原的形式，其分子量约为72kDa，该酶原可 于内质网(‘‘ER”)内进行自我催化性分子内加工过程以激活其功能。据报道，这种内部加 工事件发生于SSVFAQ丨SIPWNL158基序(序号分别为SEQ ID NOs :19禾P 20) ；Benjannet 等人，2004J. Biol. Chem. 279 :48865_48875。据报道，这种内部加工是蛋白脱离内质网所必 需的(Benjarmet等人，同上Jeidah等人，同上)。经过切割并因此被激活的蛋白与切割 的多肽一起分泌(同上)。人类PCSK9基因序列(长度约221Λ，包括12个外显子，编码含692个氨基酸的蛋 白质)的一个例子见保藏号NP_777596.2。已经描述了人类、小鼠和大鼠的PCSK9的核酸序 列，分别参见例如 GenBank 条目号AX127530(亦即 AX207686)、NP_705793(亦即 Q80W65) 和P59996。PCSK9含有若干在其他前蛋白转化酶中发现的结构域，包括N端信号序列、前体 结构域、催化结构域和富含半胱氨酸的C端结构域。PCSK9催化结构域与枯草杆菌酶的蛋白 酶K家族具有高度序列同一性，特别是都具有D186、H226和S386催化三元体。PCSK9在若干专利公开物中被公开和/或要求保护，包括但不限于下列PCT公开 号W0 01/31007,WO 01/5708UW0 02/14358,WO 01/98468,WO 02/102993,WO 02/102994、 WO 02/46383、W002/90526、WO 01/77137 和 WO 01/34768 ；美国公开号:US2004/0009553 和 US 2003/0119038 ；以及欧洲公开号EP 1 440 98UEP 1 067 182 和 EP 1 471 152。已经发现PCSK9在肝细胞和神经细胞的分化中发挥作用Geidah等人，同上)，在 胚胎肝脏中高度表达，并对胆固醇体内平衡具有非常重要的意义。研究结果表明，PCSK9在 胆固醇生物合成或摄取中具有特异性作用。在一项胆固醇饲喂大鼠的研究中，Maxwell等 人发现，PCSK9表达水平下调与参与胆固醇生物合成的其他三个基因相似(Maxwell等人， 2003J. Lipid Res. 44 :2109-2119)。实际上，已有研究显示PCSK9基因受固醇调控元件结合 蛋白(‘‘SREBP”)调控，这与观察到的其他参与胆固醇代谢的基因相同(同上)。后来一项关于PCSK9转录调控的研究支持这些发现，该研究证实，这种调控对于其他参与脂蛋白代谢 基因是非常典型的(Dubuc 等人，2004Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24 :1454-1459)。 已经表明抑制素(statin)使PCSK9的表达上调，这归结于药物的降低胆固醇水平的效应 (同上)。此外，研究还显示，PCSK9启动子具有两个与胆固醇调节有关的保守位点，一个 为固醇调控元件，另一个为Spl位点(同上)。尤其是，数套研究证据均证明，PCSK9降低肝LDLR的数量，因此减弱了肝脏清 除循环中LDL胆固醇的能力。腺病毒介导的PCSK9在小鼠肝脏中的过度表达导致循环 的LDL-C因肝LDLR蛋白大量丧失而积累，对于LDLR mRNA水平无影响(Benjannet等人， 2004，J. Biol. Chem. 279 :48865-48875 ；Maxwell & Breslow，2004PNAS101 :7100-7105 ； Park 等人，2004 J. Biol. Chem. 279 :50630-50638 ；和 Lalanne 等人，2005 J. Lipid Res. 46 1312-1319)。PCSK9过度表达对小鼠中循环的LDL-C水平升高的影响完全依赖于LDLR的 表达，这再次表明，PCSK9对LDL-C的调节是通过下调LDLR蛋白而介导的。与这些发现相 一致，缺乏PCSK9的小鼠或PCSK9mRNA水平因反义寡聚核苷酸抑制剂而降低的小鼠具有更 高水平的肝脏LDLR蛋白和更强的清除循环的LDL-C的能力(Rashid等人，2005，PNAS 102 5374-5379 ；和 Graham 等人，2007 J. Lipid Res. 48 (4) :763-767)。此外，通过 siRNA 使培 养的人肝细胞中PCSK9水平下降也会引起LDLR蛋白水平升高，且使吸收LDL-C的能力增强 (Benjannet 等人，2004 J. Biol. Chem. 279 :48865-48875 ；和 Lalanne 等人，2005 J. Lipid Res. 46 :1312-1319)。总之，这些研究数据表明，PCSK9作用导致通过降低LDLR蛋白水平 引起LDL-C水平升高。另有研究证实，PCSK9基因的多个突变与常染色体显性高胆固醇血 症(“ADH”)有关，该病症是遗传性代谢紊乱，其特征为血浆中低密度脂蛋白(“LDL”)颗 粒显著增加，这会导致早期心血管功能衰竭(参见Abitadel等人，2003，Nature Genetics 34 :154-156 ；Timms 等人，2004，Hum. Genet. 114:349-353 ；Leren,2004, Clin.Genet. 65 419-422)。Abifadel等人后来发表的一项关于S127R突变的研究(同上)显示，携带这 种突变的患者表现出总胆固醇含量升高，以及在血浆中含有apoBlOO，这是由于(1)含 apoBlOO脂蛋白，如低密度脂蛋白(“LDL”)、极低密度脂蛋白(“VLDL”)和中等密度脂蛋 白(“IDL”)的过量产生，和(2)所述脂蛋白的清除或转化作用相应减弱(Ouguerram等人， 2004，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24 :1448-1453)。因此，毫无疑问，PCSK9在LDL调控中发挥作用。PCSK9的表达或上调表达与血 浆LDL胆固醇水平升高有关，且PCSK9相应的抑制或表达缺失与血浆LDL胆固醇水平下降 相关。已有研究发现，与PCSK9序列变异有关的LDL胆固醇水平赋予抵抗冠心病的保护 (Cohen, 2006，N. Engl. J. Med. 354 :1264-1272)。治疗心血管病有效的化合物和/或制剂的鉴定是非常需要的。临床试验已经表 明，LDL胆固醇水平下降与冠心病发病直接相关(Law等人，2003，BMJ 326 :1423-1427) 0最 近的研究发现，血浆LDL胆固醇水平中度终身降低与冠心病发病率显著降低相关(Cohen等 人，同上)。即使在非脂类相关性心血管风险因素普遍存在的人群中情况亦是如此(同上)。 因此，LDL胆固醇水平的可调控性控制具有重大的意义。本发明通过提供用于抑制PCSK9活性以及PCSK9在各种治疗病症中的相应作用 的PCSK9拮抗剂，进一步提升了这些研究结果的意义。
发明内容
本发明涉及PCSK9拮抗剂，在特别的实施方式中，涉及同时抑制人类和鼠PCSK9的 拮抗剂以及那些对已加工的PCSK9表现出优先靶向作用的PCSK9拮抗剂。广义地说，PCSK9 的蛋白特异性拮抗剂(以下称为“PCSK9特异性拮抗剂”)为PCSK9蛋白结合分子或有效地 选择性结合PCSK9并抑制PCSK9功能的分子。这些分子在治疗与PCSK9功能有关的或受其 功能影响的病症中具有重要意义，所述病症包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、代谢综合 症、急性冠脉综合症及相关病症。PCSK9特异性拮抗剂的特点为，选择性识别PCSK9并与之 结合。PCSK9特异性拮抗剂不显示与除PCSK9之外的其他蛋白有显著结合作用，除非以下特 例即该拮抗剂补充或被专门设计为对PCSK9特异性结合成分提供额外的不同的特异性。本文中特定实施方式中的PCSK9特异性拮抗剂包含(a)重链可变区，其包含⑶R3 结构域，其包含SEQ ID N0:17或SEQ IDNO :17的等同物，所述等同物的特征在于在⑶R3结 构域中具有一个或多个保守性氨基酸取代；和/或(b)轻链可变区，其包含CDR3结构域，其 包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :7的等同物，所述等同物的特征在于在⑶R3结构域中具 有一个或更多个保守性氨基酸取代。在具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/ 或鼠PCSK9结合，其Kd为1. 2X10_6M或更小。在另外的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与 人类和/或小鼠PCSK9结合的Kd为1X10_7M或更小。在另外的实施方式中，PCSK9特异性拮 抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的Kd为议10_%或更小。在进一步的实施方式中，PCSK9 特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的Kd为5X10_9M或更小，或1X10_9M或更小。在 选择性实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人类和/或小鼠PCSK9结合的Kd为ΙΧΙΟ,Μ或 更小，1Χ10_"Μ或更小，或1Χ10~Μ或更小。在具体的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂在 上述与PCSK9结合的水平上不与PCSK9之外的蛋白结合。本发明的特定实施方式包括PCSK9特异性拮抗剂，其在上述水平之一显示出与 PCSK9结合并且与1D05抗体分子竞争性结合PCSK9。1D05抗体分子构成本文重要的PCSK9 特异性拮抗剂。1D05抗体分子的特征在于包括⑴包含SEQ ID Ν0:11的重链可变区 (“VH”)；和(ii)包含SEQ ID N0:27的轻链可变区(“VL”)。所述VH与VL区分别包含 VH 区(SEQ ID NO :13、15 和 17)和 VL 区(SEQ ID NO :3、5 和 7)的公布的 CDR 1、2 和 3 的 全长互补序列。1D05抗体分子的例子包括但不限于(i)Fab，其包含包含SEQ IDNO 1的 轻链和包含SEQ ID NO 9的氨基酸1-233(或SEQ ID NO 9)的Fd链；和(ii)全长抗体分 子，其包含包含SEQ ID NO 26的轻链和包含SEQ ID NO 25的重链。PCSK9特异性拮抗剂可有效抵消PCSK9依赖性的对于细胞LDL摄取的抑制，尤其对 人类和/或鼠PCSK9依赖性的对于细胞LDL摄取的抑制特别有效。再次证实，PCSK9特异性 拮抗剂1D05对于PCSK9对LDL摄取的效应具有剂量依赖性抑制。因此，本文公布的PCSK9 特异性拮抗剂对于降低血浆LDL胆固醇水平意义重大。本文公布的拮抗剂亦可用于不同的 诊断目的，包括PCSK9的检测和定量。选择性1D05拮抗与人类和鼠PCSK9具有交叉反应， 因而是特别有用的。这种特点使得可以在不需要确保小鼠表达人类PCSK9的鼠科模型中进 行特定的1D05拮抗剂的药理学研究。在此类实验中，鼠科模型足以代表目标蛋白的天然活 性和拮抗剂对其具有的抑制作用。在具体的实施方式中，本发明包括PCSK9特异性拮抗剂。在特定实施方式中，本 发明包括抗体分子，其包含本文公布的重链和/或轻链可变区，具有一个或更多个保守性氨基酸取代的所述区域的等同物，及其同源物。选择性实施方式包括分离的PCSK9特异性 拮抗剂，其包含公布的CDR结构域或成套重链和/或轻链CDR结构域，以及具有一个或更 多个保守氨基酸取代的此类结构域的等同物。正如本领域技术人员认为的那样，维持拮 抗PCSK9能力的PCSK9特异性拮抗剂的片段可插入不同的框架区，例如，参见美国专利号 6，818，418及其参考文献，这些公开物共同通过引用的方式并入本文，该文献讨论了不同的 骨架，这些骨架可用于展示之前通过抗原结合选择的抗体环(loop)。此外，运用重组技术 可使编码VL和VH的基因连接，例如运用合成连接子使其产生单链蛋白，在这个蛋白分子内 VL和VH结合形成单价分子，也称为单链Fvs ( “ScFVs")(见例如Bird等人，1988，Science 242 :423-426,和 Huston 等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)，这些公开 物通过引用的方式并入本文。PCSK-9特异性拮抗剂及片段可以以不同的非抗体骨架形式存在，包括但不限 于 avimer (Avidia)、DARPins (分子伴侶)、Adnectin(Adnexus)、Anticalin (Pieris)禾口 Affibody(Affibody)。在科学文献中对蛋白结合的替代骨架运用给予了很高的评价，例如 参见 Binz 和 Pliieckthun，2005，Curr. Opin. Biotech 16 :1-11 ；这些公开物通过引用的方式 并入本文。因此，包含(i)公布的重链和/或轻链可变区⑶R3序列(分别为SEQ ID NO 17和7)，和(ii)公布的重链可变⑶R1、⑶R2和⑶R3序列或公布的轻链可变⑶R1、⑶R2和 CDR3 序列CDRl (分别为 SEQ ID NO 13 和 3)，CDR2 (分别为 SEQ ID N0:15 禾口 5)和 CDR3(分 别为SEQ ID N0:17和7)，(iii)人类重链和/或轻链序列的可变区框架内的公布的重链 和轻链CDR的全长互补序列(分别为SEQ ID N0:13、15、17、3、5和7)，或(iv)公布的重链 和/或轻链可变区SEQ ID NO :11和/或SEQID NO 27的非抗体骨架或拮抗剂分子构成本 发明的重要实施方式，其中这样的骨架或拮抗剂分子显示出PCSK9选择性，并抵消细胞LDL 摄入的PCSK9依赖性抑制作用。在另一方面，本发明提供了编码公布的PCSK9特异性拮抗剂的核酸，在特定实施方式 中，本发明提供了 PCSK9特异性拮抗剂，其包含公布的重链和轻链、公布的可变重链区和可变 轻链区以及其选择性成分(包括CDR 1、2和/或3)，尤其是公布的各个CDR3区。另一方面，本 发明提供了包含所述核酸的载体。此外，本发明提供了包含编码公布的PCSK9特异性拮抗剂的 核酸的分离的细胞。另一方面，本发明提供了包含本发明的多肽或载体的分离的细胞。本发明提供了制备本文公布的PCSK9特异性拮抗剂的方法，所述拮抗剂包括但不 限于抗体、抗原结合片段、衍生物、嵌合分子、上述任一项与另一多肽的融合物，或者包含所 公布序列的能够特异结合PCSK9的替代性结构/成分。方法包括(i)孵育一种细胞，该 细胞包含编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸，或者包含编码其一个或更多个成分的单个核 酸，在可表达并组装PCSK9特异性拮抗剂的条件下表达时，所述核酸共同产生该拮抗剂；和 ( )从细胞中分离所述拮抗剂。本领域技术人员运用标准DNA重组技术也能获得本文公布 的PCSK9特异性拮抗剂。本发明提供一种方法，该方法用于拮抗PCSK9的活性或功能或PCSK9的显著效 应，该方法包括在允许所述拮抗剂结合PCSK9的条件下，使表达PCSK9 (或经过人类或鼠 PCSK9处理或者其中含有PCSK9)的细胞、细胞群或目标组织样品与本文公布的PCSK9特异 性拮抗剂结合。本发明的具体实施方式
包括这样的方法其中所述细胞是人类或鼠细胞。 在附加实施方式中，细胞表达人类或鼠衍生的PCSK9。
另一方面，本发明还提供一种方法，该方法用于拮抗受试者中的PCSK9的活性或 功能或者PCSK9的显著效应，该受试者表现出与PCSK9活性相关的病症或特定患者中对 PCSK9功能禁忌的病症，该方法包括，向受试者施用处于药物组合物或其它组合物中的治疗 上有效量的本发明的PCSK9特异性拮抗剂。因此，本发明包含一种方法，该方法用于治疗与PCSK9活性相关的病症或特定患 者中对PCSK9功能禁忌的病症，该方法包括，向受试者施用处于药物组合物或其它组合物 中的治疗上有效量的本发明的PCSK9特异性拮抗剂。在选择性实施方式中，所述病症为高 胆固醇血症、冠心病、代谢综合症、急性冠脉综合症或相关病症。在具体的实施方式中，本发明包括向受试者施用公布的PCSK9特异性拮抗剂的方 法，该方法包括，输送治疗上有效量的包含本文公布的PCSK9特异性拮抗剂的药物组合物 或其他组合物。在另一方面，本发明提供一种包含本发明的PCSK9特异性拮抗剂的药物组合物或 其它组合物，其特征在于，包含药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于赋形剂、稀释 剂、稳定剂、缓冲剂、或设计为促进拮抗剂以理想剂量向治疗个体施用的替代物。下表列出了本申请中讨论的序列的一般性总结。序列列表包括所有注释、序列及 特点，其共同形成为本公开的文字部分。表 权利要求
1.一种分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)包含⑶R3结构域的重链可变区，该⑶R3结构域包含SEQIDNO 17或其等同物，所 述等同物的特征在于在CDR3结构域中具有一个或更多个保守性氨基酸取代；且/或(b)包含⑶R3结构域的轻链可变区，该⑶R3结构域包含SEQIDNO 7或其等同物，所 述等同物的特征在于在CDR3结构域中具有一个或更多个保守性氨基酸取代；其中所述PCSK9特异性拮抗剂拮抗PCSK9对细胞LDL摄取的抑制。
2.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中CDR3结构域位于CDR3区域中的人类 胚系区。
3.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的平衡解离常数(Kd) 小于 1200nM。
4.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的Kd小于500nM。
5.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的Kd小于ΙΟΟηΜ。
6.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的Kd小于5nM。
7.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用 的 IC5tl 低于 500nM。
8.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用 的 IC5tl 低于 200nM。
9.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用 的 IC50 低于 IOOnMo
10.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取至少产生 20%的拮抗作用。
11.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其是抗体分子。
12.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其进一步包括(a)包含SEQID NO 13的重链可变区⑶Rl序列；(b)包含SEQID NO 15的重链可变区⑶R2序列；(c)包含SEQID NO 3的轻链可变区⑶Rl序列；和/或(d)包含SEQID NO 5的轻链可变区⑶R2序列。
13.权利要求12所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中⑶R1、⑶R2和/或⑶R3结构域处 于各自的CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的人类胚系区。
14.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)包含⑶R3结构域的重链可变区，该⑶R3结构域包含SEQIDNO 17 ；(b)包含⑶R3结构域的轻链可变区，该⑶R3结构域包含SEQIDNO 7 ；(c)重链可变区CDRl序列，其包含SEQID NO 13 ；(d)轻链可变区⑶Rl序列，其包含SEQID NO 3 ；(e)重链可变区⑶R2序列，其包含SEQID NO 15 ；及(f)轻链可变区CDR2序列，其包含SEQID NO :5。
15.权利要求14所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中⑶R1、⑶R2和/或⑶R3结构域位 于各自的CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的人类胚系可变区。
16.权利要求12所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括包含SEQIDNO=Il的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO 27的轻链可变区。
17.权利要求12所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括重链，所述重链具有包含SEQID NO 24的恒定序列。
18.权利要求16所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括重链，所述重链具有包含SEQID NO 24的恒定序列。
19.PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)包含SEQID NO 1的轻链；和(b)包含SEQID NO 11的重链；其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体分子，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取具有拮抗作用。
20.权利要求19所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中SEQID NO=Il之后跟随氨基酸序 列，所述氨基酸序列选自 SEQ ID NO 21, SEQID NO 22、SEQ ID NO 23 禾P SEQ ID NO :24。
21.分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)包含SEQID NO 26的轻链；以及(b)包含SEQID NO 25的重链；其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体分子，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取具有拮抗作用。
22.分离的PCSK9特异性拮抗剂，其(a)将lD05Fab与PCSK9的结合抑制至少50%；所述lD05Fab的特征在于包括包含 SEQ ID NO 1的轻链和包含SEQ ID NO 9的氨基酸1-233的Fd链；和(b)拮抗(i)PCSK9与LDL受体的结合和/或(ii)PCSK9内化进入细胞。
23.PCSK9特异性拮抗剂，其(a)将lD05IgG与PCSK9的结合抑制至少50%;所述lD05IgG的特征在于包括⑴包 含SEQ ID NO 1的轻链和(ii)包含SEQ ID NO 11的重链；和(b)拮抗(i)PCSK9与LDL受体的结合和/或(ii)PCSK9内化进入细胞。
24.权利要求23所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中SEQID NO :11之后跟随氨基酸序 列，所述氨基酸序列选自 SEQ ID NO 21, SEQID NO 22, SEQ ID NO 23 禾P SEQ ID NO :24。
25.分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)SEQ ID NO :45的重链可变区CDR3序列；(b)SEQID NO 45的重链可变区CDR3序列；SEQ ID NO 43的重链CDRl序列；和SEQ ID NO 44的重链CDR2序列；(c)SEQ ID NO 48的轻链可变区CDR3序列；(d)SEQID NO 48的轻链可变区CDR3序列；SEQ ID NO 46的轻链CDRl序列；和SEQ ID NO 47的轻链CDR2序列；(e)(a)和(c)皆有；(f)(b)和(d)皆有；(g)分别包含SEQID NO 50和SEQ ID NO 49的重链和/或轻链可变区；(h)包含SEQID NOs :51-56中任一项的重链可变区及任选的包含SEQ ID NO 27的轻 链可变区；或(i)包含SEQ ID NOs :57-60中任一项的轻链可变区及任选的包含SEQ ID NO 11的重 链可变区；其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体分子，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取具有拮抗作用。
26.包含权利要求1-25中任一项所述的PCSK9特异性拮抗剂和药学上可接受的载体的 组合物。
27.权利要求沈所述的组合物，其包括(a)大约50mg/mL至大约200mg/mL的PCSK9特异性拮抗剂；(b)多羟基烃(包括但不限于山梨醇、甘露醇、甘油和半乳糖醇)和/或二糖(包括但 不限于蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖)；所述多羟基烃和/或二糖合计占制剂的大约至大 约 6% w/v ；(c)大约5mM至大约200mM的组氨酸、咪唑、磷酸盐或乙酸；(d)大约5mM至大约200mM精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、 天冬氨酸或蛋氨酸；(e)大约0.OlM至大约0. IM盐酸(“HCl ”)，其数量足以使pH介于大约5. 5至大约7. 5 之间；以及(f)液体载体，包括但不限于无菌水、石油、动物油、植物油、矿物油、合成油、生理盐水、 右旋糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇；其中所述的药物组合物的PH介于大约5. 5至大约7. 5 ；并且其中所述的药物组合物 任选包括占制剂大约0. 01 %至大约1 % w/v的非离子表面活性剂(包括但不限于聚山 梨酯-80 (Tween 80 )、聚山梨酯-60 (Tween 60 )、聚山梨酯-40 (Tween 40 )和聚山梨 酯-20 (Tween 20 )、聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于，Bri j58 、Brij35 以及其它的，例如 TritonX-100 ,Triton X-114TM、NP40 、Span 85 及 Pluronic 系列的非离子表面活性剂(例 如 Pluronicl21))。
28.权利要求27所述的组合物，其包括(a)大约50mg/mL至大约200mg/mL的PCSK9特异性拮抗剂；(b)大约至大约6%w/v的甘露糖、海藻糖或蔗糖；(c)大约IOmM至大约150mM的组氨酸；(d)大约IOmM至大约150mM的精氨酸或脯氨酸；(e)大约0.003M至大约0.005M的盐酸(“HC1”)，其数量足以使pH介于大约5. 8至大 约6. 5之间；以及(f)液体载体，包括但不限于无菌水、石油、动物油、植物油、矿物油、合成油、生理盐水、 右旋糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇；其中所述的药物组合物的PH介于大约5. 8至大约6. 5 ；并且其中所述的药物组合物 任选包括大约0. 01%至大约w/v的聚山梨酯-80 (Tween 80 )或聚山梨酯-20 (Tween 20 )。
29.权利要求观所述的组合物，其包括(a)大约50mg/mL至大约200mg/mL的PCSK9特异性拮抗剂；(b)大约2%至大约6%w/v的蔗糖；(c)大约25mM至大约IOOmM的组氨酸；(d)大约25mM至大约IOOmM的精氨酸；(e)大约0.0040M至大约0. 0045M的盐酸(“HC1 ”)，其数量足以使pH达到大约6的范 围；以及(f)无菌水；其中所述的药物组合物的PH为大约6的范围；并且其中所述的药物组合物任选包括大 约0. 01%至大约1% w/v的聚山梨酯-80 (Tween 80 )或聚山梨酯-20 (Tween 20 )。
30.权利要求四所述的组合物，其包括(a)大约50mg/mL至大约200mg/mL的PCSK9特异性拮抗剂；(b)蔗糖、组氨酸和精氨酸，其数量为以下之一(i)大约3% w/v的蔗糖，大约50mM组 氨酸及大约50mM精氨酸；或(ii)大约6% w/v的蔗糖，大约IOOmM组氨酸及大约IOOmM精氨酸；(c)大约0.0040M至大约0. 0045M的盐酸(“HC1”)，其数量足以使pH达到大约6的范 围；以及(d)无菌水；其中所述的药物组合物的PH为大约6的范围；并且其中所述的药物组合物任选包括大 约0. 01%至大约1% w/v的聚山梨酯-80 (Tween 80 )或聚山梨酯-20 (Tween 20 )。
31.拮抗PCSK9功能的方法，其包括施用权利要求1-25中任意一项所述的PCSK9特异 性拮抗剂。
32.权利要求1-25中任意一项所述的PCSK9特异性拮抗剂在制备用于减轻由PCSK9功 能引起的和/或由PCSK9功能加剧的紊乱、病症或疾病的药物中的用途。
33.编码权利要求1-25中任意一项所述的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸。
34.编码权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸；其中重链可变区的 ⑶R3结构域由包含SEQ ID NO 18的核苷酸序列编码；和/或其中轻链可变区的⑶R3结构 域由包含SEQ ID NO 8的核苷酸序列编码。
35.权利要求34所述的分离的核酸，其进一步包括(a)分别由包含SEQID NO: 14和SEQ ID NO 16的核苷酸序列编码的位于重链可变区 的CDRl和/或CDR2结构域；(b)分别由包含SEQID NO :4和SEQ ID NO :6的核苷酸序列编码的位于轻链可变区的 CDRl和/或CDR2结构域；
36.编码权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸；其中所述PCSK9特异 性拮抗剂包括(a)由包含SEQID NO 12的核苷酸序列编码的重链可变区；和/或(b)由包含SEQID NO :28的核苷酸序列编码的轻链可变区。
37.编码权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的分离的核酸；其中所述PCSK9特异 性拮抗剂包括(a)由包含SEQID NO 29的核苷酸序列编码的重链区；和/或(b)由包含SEQID NO :30的核苷酸序列编码的轻链区。
38.包含权利要求33-37中任意一项的核酸的载体。
39.体外或原位的分离的宿主细胞或宿主细胞的群体，其包含权利要求33-37中任意 一项的核酸。
40.生产PCSK9特异性拮抗剂的方法，其包括(a)在适合生产PCSK9特异性拮抗剂的条件下培养权利要求39的细胞；及(b)分离所产生的PCSK9特异性拮抗剂。
41.体外或原位的分离的宿主细胞或宿主细胞的群体，其包含权利要求1的PCSK9特异 性拮抗剂。
全文摘要
本文公开了人类枯草溶菌素转化酶9(“PCSK9”)的拮抗剂。本文公开的拮抗剂能有效抑制PCSK9的功能，因此是目前用于治疗与PCSK9活性相关的病症的合意的拮抗剂。本发明还公开了编码所述拮抗剂的核酸、包含所述拮抗机的载体、宿主细胞及组合物。本文还公开了制备PCSK9特异性拮抗剂的方法及利用该拮抗剂抑制或拮抗PCSK9功能的方法，这些构成了本公开的另一重要方面。
文档编号A61P3/06GK102066420SQ200980104498
公开日2011年5月18日 申请日期2009年2月6日 优先权日2008年2月7日
发明者A·西特拉尼, D·D·伍德, D·K·瑙罗基, F·董, H·A·哈蒙德, H·尤德, H·马赫, J·C·桑托罗, J·H·康德拉, J·T·布吕, K·王, L·B·彼得森, L·奥尔萨蒂, P·罗, P·钟, R·M·库邦, S·M·格里戈里, S·潘迪特, Y·李 申请人:P.安杰莱蒂分子生物学研究所, 默沙东公司