专利名称：C-met和egfr拮抗剂的联合疗法的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学和生长因子调控的领域。更具体地，本发明涉及用 于病理状况(诸如癌症)治疗的联合疗法。
背景技术：
HGF是一种对多种不同细胞类型具有促有丝分裂，促运动和形态发生活性的 间充质衍生多效因子。HGF效应是经由一种特异性酪氨酸激酶，c-met介导的，而且 在多种肿瘤中频繁观察到异常HGF和c-met表达。参见例如Maulik et al.，Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13: 41—59; Danilkovitch—Miagkova & Zbar, J.Clin.Invest. (2002)，109(7) : 863-867。肿瘤进展和转移涉及对HGF/c_Met信号传导途径的调控。 参见例如 Trasolino &Comoglio，Nature Rev. (2002)，2 289-300)。HGF结合c-met受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞外结构域并调控多种生物学过 程，诸如细胞播散，增殖和存活。HGF-Met信号传导对于正常胚胎发育(尤其在肌肉 祖细胞的迁移中)及肝和神经系统的发育是至关重要的(Bladt etal.，Nature(1995), 376，768-771. ； Hamanoue et al.，Faseb J (2000)，14，399-406 ； Maina et al.， Cell (1996), 87，531—542; Schmidt et al., Nature (1995)，373，699—702; Ueharaet al., Nature(1995), 373，702-705)。Met和HGF敲除小鼠的发育表型非常相似，提 示 HGF 是 Met 受体的关联配体(Schmidt et al., 1995, supra ； Uehara et al., 1995, supra)。HGF-Met还在肝再生、血管发生和伤口愈合中发挥作用(Bussolino et al.，J Cell Biol (1992)，119，629-641; Matsumoto and Nakamura，Exs (1993), 65，225-249; Nusrat etal.，JClin Invest (1994) 93, 2056-2065)。前体 Met 受体经历蛋白水解切割，变 成通过二硫键相连接的细胞外α亚基和跨膜β亚基(Tempest etal.，Br J Cancer (1988)， 58，3-7)。 β亚基含有细胞质激酶结构域且在C端包含多底物停泊位点，衔接蛋白质 在那里结合并启动信号传导(Bardelli et al.，Oncogene(1997)，15，3103-3111 ； Nguyen et al., J Biol Chem(1997)，272，20811-20819 ； Pelicci et al.，Oncogene(1995)，10， 1631-1638 ； Ponzetto et al.，Cell (1994), 77，261-271 ； Weidner et al.，Nature (1996)， 384，173-176)。在HGF结合后，Met的活化分别经由Gabl和Grb2/Sos介导的PI3激酶 和Ras/MAPK活化而导致酪氨酸磷酸化和下游信号传导，这驱动细胞运动和增殖(Furge et al., Oncogene(2000)，19，5582-5589； Hartmannetal., J Biol Chem(1994)，269， 21936-21939 ； Ponzetto etal.，J Biol Chem (1996)，271，14119-14123 ； Royal and Park，
J Biol Chem (1995)，270，27780-27787)。显示了 Met在用致癌原处理的骨肉瘤细胞系中转化(Cooper et al.,Nature (1984), 311，29-33 ； Parketal., Cell (1986), 45，895-904)。已经在多种人癌症 中观察到Met过表达或基因扩增。例如，Met蛋白质在结肠直肠癌中过表达至少5倍，而 且有报告说在肝转移中基因扩增(Di Renzo et al.，Clin Cancer Res (1995)，1，147-154 ； Liuetal.，Oncogene(1992)，7，181-185)。还有报告说Met蛋白质在口腔鳞状细胞癌， 肝细胞癌，肾细胞癌，乳腺癌和肺癌中过表达(Jinet al.，Cancer(1997), 79，749-760 ； Morello et al.，J Cell Physiol (2001), 189，285-290 ; Natali et al.，Int J Cancer (1996)， 69，212-217 ； Olivero et al., Br J Cancer (1996)，74，1862-1868; Suzuki et al., Br J Cancer(1996), 74，1862-1868)。另外，已经在肝细胞癌，胃癌和结肠直肠癌中观察 到 mRNA 的过表达(Boix et al.，Hepatology (1994), 19，88-91 ； Kuniyasu et al.，Int J Cancer(1993), 55，72-75; Liuetal.，Oncogene(1992)，7，181-185)。已经在肾乳头状癌中找到Met的激酶结构域中导致组成性受体活化的多种突 变(Olivero etal.，Int J Cancer (1999)，82，640-643; Schmidt et al., Nat Genet(1997)， 16，68-73 ； Schmidt et al.，Oncogene(1999)，18，2343-2350)。这些活化性突变赋予 组成性Met酪氨酸磷酸化并导致MAPK活化，病灶形成和肿瘤发生(Jeffers et al., Proc NatlAcad Sci U S A(1997), 94，11445-11450)。另外，这些突变增强细胞运动和侵入 (Giordano et al., Faseb J (2000), 14，399-406 ； Lorenzato etal., Cancer Res (2002)，62， 7025-7030)。转化细胞中的HGF依赖性Met活化介导升高的运动，播散和迁移，这最终 导致侵入性肿瘤生长和转移(Jeffers etal.，Mol Cell Biol (1996)，16，1115-1125； Meiners etal., Oncogene(1998)，16，9-20)。已经显示了 Met与其它驱动受体活化，转化和侵入的蛋白质相互作用。在赘生 性细胞中，有报告说Met与α 6β 4整联蛋白(细胞外基质(ECM)成分诸如层粘连蛋白的 一种受体)相互作用，以促进HGF依赖性侵入性生长(Trusolino etal.，Cell(2001)，107， 643-654)。另外，已经显示了 Met的细胞外结构域与脑信号蛋白家族的一个成员，丛蛋 白 Bl 相互作用，以增强侵入性生长(Giordano etal.，Nat Cell Biol (2002)，4，720-724)。 另外，还有报告说已知涉及肿瘤发生和转移的CD44v6与Met和HGF形成复合物并导致 Met 受体活化(Orian-Rousseau et al., Genes Dev (2002)，16，3074-3086)。Met是包括Ron和Sea的受体酪氨酸激酶(RTK)亚家族的一个成员(Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13，41-59)。Met 的细胞外结构域结构的预测提 示与脑信号蛋白和丛蛋白的共享同源性。Met的N端含有大约500个氨基酸的Sema结构 域，它在所有脑信号蛋白和丛蛋白中是保守的。脑信号蛋白和丛蛋白属于分泌和膜结合 蛋白质的一个大家族，最初记载了它们在神经发育中的作用(Van Vactor and Lorenz，Curr Bio(1999), 19，R201-204)。然而，最近已经将脑信号蛋白过表达与肿瘤侵入和转移关 联起来。在丛蛋白，脑信号蛋白和整联蛋白中找到的一种富含半胱氨酸的PSI结构域(也 称作Met相关序列结构域)邻近Sema结构域，接着是四个IPT重复，它们是在丛蛋白和 转录因子中找到的免疫球蛋白样区。一项最近的研究提示Met Sema结构域足以实现HGF 和肝素结合(Gherardi etal.，Proc Natl Acad Sci U S A (2003), 100(21) 12039-44)。如上所述，Met受体酪氨酸激酶受其关联配体HGF活化，而且受体磷酸化活化 下游 MAPK，PI-3 激酶和 PLC- Y 途径(L.Trasolino and P.M.Comoglio, Nat Rev Cancer 2，289 (2002) ； C.Birchmeier et al., Nat Rev Mol Cell Biol 4，915 (2003))。激酶结构域内Y1234/Y1235的磷酸化对于Met激酶活化是至关重要的，而多底物停泊位点中的 Y1349和Y1356对于src同源性_2(SH2)，磷酸酪氨酸结合(PTB)和Met结合结构域 (MBD)蛋白质的结合是重要的(C.Ponzetto et al.，Cell 77，261(1994) ； K.M.Weidner et al.，Nature 384，173(1996) ； G.Pelicci et al., Oncogene 10，1631(1995))，以介导下游 信号传导途径的激活。另一个近膜磷酸化位点，Y1003，已经详细表征了它对Cbl E3连 接酶的酪氨酸激酶结合(TKB)结构域的结合(P.Peschard etal.，Mol Cell 8，995(2001)； P.Peschard, N.Ishiyama, T.Lin, S.Lipkowitz, M.Park, J Biol Chem 279，29565(2004))。 有报告说Cbl结合驱动吞蛋白介导的受体胞吞，遍在蛋白化和后续受体降解(A.Petrelli etal., Nature 416，187(2002))。先前已经在还包含相似Cbl结合位点的EGFR家族中 描述了这种受体下调机制(K.Shtiegman，Y.Yarden, Semin Cancer Biol 13, 29(2003)； M.D.Marmor, Y.Yarden, Oncogene 23，2057(2004) ； P.Peschard, M.Park, Cancer Cell 3，519(2003))。 已经在多种肿瘤中报告了 Met和HGF的失调。已经在数种癌症中观 察到配体驱动的Met活化。在肺，乳腺癌和多发性骨髓瘤中观察到升高的血清和肿瘤 内 HGF(J.M.Siegfried etal., Ann Thorac Surg 66，1915 (1998) ； P.C.Ma et al., Anticancer Res 23，49(2003) ； B.E.Elliott et al.Can J Physiol Pharmacol 80, 91(2002) ； C.Seidel，et al, Med Oncol 15，145(1998))。 已经在多种癌症中报告了 Met和/或HGF的过表达， Met扩增或突变，诸如结肠直肠癌，肺癌，胃癌和肾癌，而且认为驱动不依赖配体的受体 活化(C.Birchmeier et al，Nat Rev Mol Cell Biol 4，915(2003) ； G.Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev 13, 41(2002))。 另外，肝小鼠模型中可诱导的Met过表达引起肝 细胞癌，证明受体过表达驱动不依赖配体的肿瘤发生(R.Wang，et al, J Cell Biol 153， 1023(2001))。在家族性和散发性肾乳头状癌(RPC)患者中报告了将Met与癌症联系起来 的最有力证据。Met的激酶结构域中导致受体组成性活化的突变被鉴定为RPC中的种系 和体细胞突变(L.Schmidt etal.，Nat Genet 16，68(1997))。在转基因小鼠模型中引入这些 突变导致肿瘤发生和转移(M. Jeffers etal.，Proc Natl Acad Sci U S A 94，11445(1997))。涉及c-met 和 c-met 拮抗剂的出版物包括 Martens，Τ, et al(2006)Clin Cancer Res 12(20 Pt 1) 6144 ； US 6,468,529 ； W02006/015371 ； W02007/063816 ； W02006/104912 ； W02006/104911 ； W02006/113767 ； US2006-0270594 ； US2006-美 国专利 No.7,481,993 ； W02009/007427 ； W02005/016382 ； W02009/002521 ； W02007/143098 ； W02007/115049 ； W02007/126799。表皮生长因子受体(EGFR)家族包含四种密切相关的受体(HER1/EGFR， HER2，HER3和HER4)，其涉及细胞应答，诸如分化和增殖。EGFR激酶或其配体 TGF-α的过表达常常与多种癌症有关，包括乳腺癌，肺癌，结肠直肠癌，卵巢癌，肾 细胞癌，膀胱癌，头颈癌，成胶质细胞瘤和星形细胞瘤，而且认为有助于这些肿瘤的恶 性生长。已经发现EGFR基因(EGFRvIII)中的一种特定删除突变提高细胞致肿瘤性。 EGFR刺激的信号传导途径的活化促进多种潜在促进癌症的过程，例如增殖，血管发生， 细胞运动和侵入，降低的凋亡和药物抗性的诱导。升高的HER1/EGFR表达常常与晚期 疾病，转移和差的预后有联系。例如，在NSCLC和胃癌中，已经显示了升高的HERl/ EGFR表达与高的转移率，差的肿瘤分化和升高的肿瘤增殖相关。已经在NSCLC和成胶质细胞瘤观察到活化受体的内在蛋白质酪氨酸激酶活性和/或提高下游信号传导的突变。然而，突变在赋予对EGFR受体抑制剂(例如 Erlotinib (TARCEVA )或Gefitinib)的敏感性中作为首要机制的作用仍然有争议。已 经有报告预测全长EGF受体的突变体形式对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib的 响应性(Paez, J.G.et al. (2004) Science304 1497-1500 ； Lynch, T.J.et al. (2004) N.Engl. J.Med.350 2129-2139)。细胞培养研究显示了表达此类EGF受体突变体形式的细胞系 (即H3255)对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib的生长抑制作用更敏感，而且抑制表 达野生型EGF受体的肿瘤细胞系需要浓度高得多的Gefitinib。这些观察结果提示EGF受 体的特定突变体形式可能反映对EGF受体抑制剂的更大敏感性，但是不鉴定完全无响应 的表型。直接抑制EGFR的激酶活性的化合物，以及通过阻断EGFR活化来降低EGFR 激酶活性的抗体作为抗肿瘤药的使用的开发是研究努力密集的领域(de Bono J.S.and Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol.Medicine 8 S19-S26 ； Dancey, J.and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev.Drag Discovery 2:92-313)。数项研究已经证明了，披露了， 或提示了 一些EGFR激酶抑制剂在与某些其它抗癌或化疗药剂或治疗联合使用时可能 改善对肿瘤细胞或瘤的杀伤(例如 Herbst, R.S.et al. (2001) Expert Opin.Biol.Ther.l 719-732 ； Solomon, B.et al (2003) Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55 713-723 ； Krishnan, S.et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, el-13 ； Grunwald, V.and Hidalgo, M. (2003) J.Nat. Cancer Inst.95 851-867; Seymour L. (2003) Current Opin.Investig.Drags4 (6) 658-666; Khalil, M.Y.et al. (2003) Expert Rev.Anticancer Ther.3 367—380 ; Bulgaru，A.M.et al. (2003) Expert Rev.Anticancer Ther.3 269-279 ； Dancey, J.and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev.Drug Discovery 2 92-313 ； Ciardiello, F.et al. (2000) Clin.Cancer Res.6 2053-2063 ；及专利公开文本 No: US2003/0157104)。Erlotinib (例如 Erlotinib HC1,也称作 TARCEVA 或 OSI-774)是 EGFR 激
酶的一种可得口服抑制剂。在体外，已经在多种人肿瘤细胞系(包括结肠直肠和乳 腺癌)中证明了 Erlotinib针对EGFR激酶的实质性抑制活性(Moyer J.D.et al. (1997) Cancer Res.57 4838)，而且临床前评估已经证明针对多种表达EGFR的人肿瘤异种移 植物的活性(Pollack，V.A.et al(1999) J.Pharmacol.Exp.Ther.291 739)。已经在临床试 验中证明了 Erlotinib在多种适应证中的活性，包括头颈癌(Soulieres，D.，et al. (2004) J.Clin.Oncol.22 77)，NSCLC (Perez-Soler R, et al. (2001) Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20 310a, abstractl235)，CRC (Oza, M.，et al. (2003) Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22 196a, abstract785)禾PMBC(Winer，E.，et al. (2002)Breast Cancer Res.Treat.76 5115a, abstract445 ； Jones, R.J., et al. (2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22 45a, abstract 180)。 在一项III期试验中，Erlotinib单一疗法在具有晚期治疗不应性NSCLC的患者中显著延长 存活，延迟疾病进展和延长肺癌相关症状恶化(Shepherd，F.et al. (2004) J.Clin.Oncology, 22 14S (July 15 Supplement)，Abstract 7022)。在 2004 年 11 月，美国食品和药品管理 局(FDA)批准了TARCEVA 用于在至少一种在先化疗方案失败后治疗具有局部晚期或 转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。尽管癌症治疗获得了重大进展，但是仍然在寻找改良的疗法。通过述及完整收录本文中所引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。
发明概述本发明提供用于治疗病理状况(诸如癌症)的联合疗法，其中组合c-met拮抗剂 与EGFR拮抗剂，由此提供显著的抗肿瘤活性。一方面，本发明提供治疗受试者中的癌症的方法，包括对受试者施用治疗有效 量的c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂。c-met拮抗剂的例子包括但不限于可溶性c-met受体，可溶性HGF变体，对 c—met或HGF特异性的适体(apatmers)或肽体(peptibodies), c_met小分子，抗c_met抗 体和抗HGF抗体。在一些实施方案中，c-met拮抗剂是抗c_met抗体。在一个实施方案中，抗c-met抗体包含重链可变域，其包含图7中所绘 CDRl-HC, CDR2-HC 和 CDR3-HC 序列(SEQIDN0 13-15)中的一项或多项。在一 些实施方案中，所述抗体包含轻链可变域，其包含图7中所绘CDR1-LC，CDR2-LC和 CDR3-LC序列(SEQ ID NO 5_7)中的一项或多项。在一些实施方案中，重链可变域包 含图 7 中所绘 FR1-HC，FR2-HC, FR3-HC 和 FR4-HC 序列(SEQ ID NO 9-12)。在 一些实施方案中，轻链可变域包含图7中所绘FR1-LC，FR2-LC，FR3-LC和FR4-LC序 列(SEQ ID NO 1-4)。在一些实施方案中，抗c_met抗体是单价的且包含Fc区。在一 些实施方案中，所述抗体包含图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO: 17)。在一些实施方案中，所述抗体是单价的且包含Fc区，其中所述Fc区包含第一和 第二多肽，其中所述第一多肽包含图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO: 17)且所述第二多肽 包含图8中所绘Fc序列(SEQ ID NO 18)。在一个实施方案中，抗c-met抗体包含(a)第一多肽，其包含具有下述序列的重 链可变域QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIG MIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDY WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO 19)，图 7 中所绘 CHl 序列(SEQID NO 16)和图 7 中 所绘Fc序列(SEQ ID NO: 17)；和(b)第二多肽，其包含具有下述序列的轻链可变域 DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAST RESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO 20)和图7中所绘CLl序列(SEQ ID NO 8)；和(c)第三多肽，其包含图8中所 绘 Fc 序歹丨J (SEQ ID NO 18)。一方面，抗c-met抗体包含至少一项促进抗体片段内的Fc序列异二聚化，同时 将同二聚化降至最低的特征。此类特征改善免疫球蛋白群的收率和/或纯度和/或同质 性。在一个实施方案中，所述抗体包含构成“结”(knobs)和“穴”(holes)的Fc突 变，如W02005/063816中所记载的。例如，穴突变(hole mutation)可以是Fc多肽中 的T366A，L368A和/或Y407V中的一项或多项，而腔突变(cavity mutation)可以是 T366W。在一些实施方案中，c-met拮抗剂是 SGX-523，PF-02341066, JNJ-38877605， BMS-698769, PHA-665,752, SU5416, SU 1274，XL-880，MGCD265, ARQ 197， MP-470, AMG 102，抗体 223C4 或人源化抗体 223C4 (W02009/007427)，L2G7, NK4, XL-184, MP-470,或 Comp-1。c-met拮抗剂可用于降低或抑制HGF/c-met相关效应的一个或多个方面，包括但不限于c-met活化，下游分子信号传导(例如促分裂原活化的蛋白质激酶(MAPK)磷 酸化，AKT磷酸化，c-met磷酸化，PI3激酶介导的信号传导)，细胞增殖，细胞迁移， 细胞存活，细胞形态发生和血管发生。这些效应可以通过任何生物学有关机制来调控， 包括破坏配体(例如HGF)对c-met的结合，c_met磷酸化和/或c_met多聚化。EGFR拮抗剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。EGFR拮抗剂还包 括小分子，诸如 US5616582，US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, W09814451, W09850038, W09909016, W09924037, W09935146, W00132651, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498 中记载的化合物。具 体的小分子 EGFR拮抗剂包括 OSI-774(CP_358774，Erlotinib, OSI Pharmaceuticals)； PD 183805 (CI 1033，2-丙烯酰胺，N_[4_[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4_ 吗啉基) 丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氢氯化物，Pfizer Inc.) ； lrcssa (ZD 1839，Gefitinib， AstraZeneca) ； ZM 105180 ((6-氨基-4- (3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)； BIBX-1382 (N8- (3-氯-4-氟-苯基)_N2_ (1-甲基-哌啶 _4_ 基)-嘧啶并[5，4_d] 嘧啶 _2，8- 二 胺，Boehringer Ingelheim) ； PKI-166 ((R)-4_[4_[ (1-苯基乙基)氨 基]-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1_苯基乙 基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785 (N_[4_[ (3-溴苯基)氨基]_6_喹 唑啉yl]-2- 丁炔酰胺)；EKB-569(N_[4-[(3-氯_4_氟苯基)氨基]-3_氰基_7_乙氧 基 _6_ 喹啉基]-4_ ( 二甲基氨基)-1- 丁烯酰胺)；lapatinib (Tykerb，GlaxoSmithKline)； ZD6474 (Zactima, AstraZeneca) ； CUDC — 101 (Curis) ； canertinib (CI—1033)； AEE788 (6-[4-[ (4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N_[(lR)-l-苯基乙基]_7H_吡咯并 [2, 3_d]嘧啶-4-胺，W02003013541，Novartis)禾PPKI166(4-[4_[[(1R)-1-苯基乙基] 氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚，W09702266 Novartis)。在一个具体的实施方案中，EGFR拮抗剂具有依照US 5,757,498 (通过述及收入 本文)的通式I 其中m 为 1，2，或 3 ；每个R1独立地选自下组氢，卤素，羟基，羟基氨基，羧基，硝基，胍基，脲 基，氰基，三氟甲基和-(Ci-Q亚烷基亚烷基)-w-(苯基)，其中W为单键，0，S或 NH ；
或者每个R1独立地选自R9*^-^烷基，其是被氰基取代的，其中R9选自下 组R5，-OR6, -NR6R6，-C(0)R7，-NHOR5，-0C(0)R6，氰基，A 和 _YR5 ; R5 为
Ci-C；烷基；R6独立地为氢或R5; R7为R5，-OR6或-NR6R6; A选自哌啶子基，吗啉代， 吡咯烷子基，4-R6-哌嗪-1-基，咪唑-1-基，4-吡啶酮-1-基，-(CfC；亚烷基亚烷基) (co2h),苯氧基，苯基，苯基硫基，c2-c4烯基和-(CVQ亚烷基亚烷基)C(0)NR6R6 ； 且Y为S，SO,或S02;其中R5，-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1-3个卤素取 代基取代的且R5，-OR6和_NR6R6中的烷基部分任选是被1或2个R9基团取代的，且其 中所述任选取代基的烷基部分任选是被卤素或R9取代的，前提是没有两个杂原子连接于 同一碳原子；或者每个R1独立地选自_NHS02R5，邻苯二甲酰亚氨基-(CfC；)-烷基磺酰基 氨基，苯甲酰氨基，苯磺酰基氨基，3-苯基脲基，2-氧代吡咯烷-1-基，2，5-二氧 代吡咯烷-1-基和Rlcl-(C2-C4)_烷酰基氨基，其中R1(l选自卤素，-OR6，C2_C4烷酰基 氧，-C(O)R7和-NR6R6;且其中所述-nhso2R5，邻苯二甲酰亚氨基-(q-c;-烷基磺酰 基氨基，苯甲酰氨基，苯磺酰基氨基，3-苯基脲基，2-氧代吡咯烷-1-基，2，5-二氧 代吡咯烷-1-基和R1(l_ (C2-C4)-烷酰基氨基R1基团任选是被1或2个独立地选自卤素， q-c;烷基，氰基，甲磺酰基和q-c;烷氧基的取代基取代的；或者两个R1基团与它们所连接的碳一起形成5-8元环，其包括1或2个选自0， S和N的杂原子；R2为氢或CVQ烷基，其任选是被1-3个独立地选自卤素，CVC；烷氧 基，-nr6R6和-SO2R5的取代基取代的；n为1或2且每个R3独立地选自氢，卤素，羟基，CrQ烷基，_NR6R6和 <^_(4烷氧基，其中所述R3基团的烷基部分任选是被1-3个独立地选自卤素，Ci-C4烷氧 基，-NR6R6和_S02R的取代基取代的；且R4为叠氮基或_(乙炔基)_R"，其中R"为氢或烷基，其任选是被羟 基，-OR6，或-NR6R6取代的。在一个具体的实施方案中，EGFR拮抗剂是选自下组的依照式I的化合物(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)_(3_乙炔基苯基)_胺；(6，7_ 二甲氧基 喹唑啉-4-基)-[3-(3'-羟基丙炔-1-基)苯基]_胺；[3-(2' _(氨基甲基)_乙 炔基)苯基]-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6_硝基喹唑 啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(4_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲 氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-2-甲基苯基)-胺；(6-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔 基苯基)_胺；(3-乙炔基苯基)-(6_甲磺酰基氨基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯 基)-(6，7-亚甲二氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔 基-6-甲基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(7_硝基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯 基)-[6-(4'-甲苯磺酰基氨基)喹唑啉-4-基h胺；(3-乙炔基苯基)-{6-[2'-苯二 酰亚氨基-乙-1'-基-磺酰基氨基]喹唑啉-4-基}"胺；(3-乙炔基苯基)-(6_胍 基喹唑啉-4-基)-胺；(7-氨基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基 苯基)_(7_甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯 基)_胺；(7-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；[6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-基h(3-乙炔基苯基)_胺；(3-叠氮基苯基)_(6，7-二甲氧基喹唑 啉-4-基)-胺；(3-叠氮基-5-氯苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(4-叠 氮基苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基-喹唑 啉-4-基)-胺；(6-乙硫基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基-4-氟-苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-[3-(丙 炔-1'-基)-苯基]-胺；[6，7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(5-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(3-乙炔 基-4-氟-苯基)_胺；[6，7-双-(2-氯-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；[6- (2-氯-乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h (3-乙炔基-苯 基)_胺；[6，7-双-(2-乙酰氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h(3-乙炔基-苯基)-胺； 2-[4- (3-乙炔基-苯基氨基)-7- (2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基h乙醇；[6- (2-乙 酰氧基_乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)_胺； [7- (2-氯-乙氧基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)_胺； [7-(2-乙酰氧基-乙氧基)-6-(2_甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙 醇；2-[4-(3_乙炔基-苯基氨基)-7-(2_甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙 醇；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基h乙醇； [6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2_甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；(3-乙炔基-苯基)-{6- (2-甲氧基-乙氧基)-7-[2- (4-甲基-哌嗪-1-基)-乙 氧基]-喹唑啉-4-基}-胺；(3-乙炔基-苯基)-[7-(2_甲氧基-乙氧基)-6-(2_吗 啉-4-基)-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔 基苯基)_胺；(6，7-二丁氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二异丙 氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6- (2-羟基-乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧 基)-喹唑啉-1-基]-胺；[6，7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯 基)-胺；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基h乙 醇；(6，7-二丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基-5-氟-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基-4-氟-苯基)_胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(5_乙炔基-2-甲基-苯 基)_胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-4-甲基-苯基)-胺；(6-氨基甲 基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-苯基)-胺；(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑 啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺； (6-氨基羰基甲基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙 基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-异丙氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺； (6-氨基羰基乙基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；和(6-氨基羰基乙基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)_胺；(6，7-二乙氧基喹唑 啉-1-基)_ (3-乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6- (2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧 基-乙氧基)-喹唑啉-1-基h胺；[6，7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙 炔基苯基)-胺；[6，7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基h(3-乙炔基苯基)-胺； (6，7-二甲氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基 氨基-喹唑啉-1-基)-胺；和(6-氨基-喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺。在一个具体的实施方案中，式I的EGFR拮抗剂为N-(3-乙炔基苯基)_6，7_双 (2-甲氧基乙氧基)-4_喹唑啉胺。在一个具体的实施方案中，EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基 苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为HCl盐形式。在另一个具体的实施方 案中，EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)_4_喹唑啉胺为基本 上同质的结晶多型形式(在WO 01/34,574中描述为多型B)，其展现特征性峰的X射线粉 末衍射花样，该特征性峰具有以度表示大约6.26、12.48、13.39、16.96、20.20、21.10、 22.98、24.46、25.14 和 26.91 的 2-theta。N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧 基)-4-喹唑啉胺的此类多型形式称作Tarceva 以及OSI-774，CP-358774和Erlotinib。EGFR拮抗剂可用于降低或抑制EGFR-EGFR配体相关效应的一个或多个方面， 包括但不限于EGFR活化，下游分子信号传导，细胞增殖。这些效应可以通过任何生物 学有关机制来调控，包括破坏配体对EGFR的结合和破坏EGFR磷酸化。本发明的方法可用于改变任何合适的病理状态。例如，本发明的方法可用于治 疗不同癌症，实体瘤以及软组织瘤。本发明的治疗可改善的癌症的非限制性例子包括乳 腺癌，结肠直肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾细 胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波西氏肉瘤，类癌，头颈癌，成胶质 细胞瘤，黑素瘤，卵巢癌，胃癌，间皮瘤和多发性骨髓瘤。在模型方面，所述癌症是转 移性的。在其它方面，所述癌症是非转移性的。在一个实施方案中，在癌症(诸如非小细胞肺癌)的联合疗法中使用抗c-met抗 #禾口 Erlotinib。在某些实施方案中，所述癌症不是EGFR拮抗剂(例如Erlotinib或Gefitinib)抗
性癌症。在某些实施方案中，所述癌症不是Erlotinib或Gefitinib抗性癌症。在某些实施方案中，所述癌症不是酪氨酸激酶抑制剂抗性癌症。在某些实施方 案中，所述癌症不是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性癌症。在某些实施方案中，所述癌症展示c-met和/或EGFR表达，扩增，或活化。在 某些实施方案中，所述癌症不展示c-met和/或EGFR表达，扩增，或活化。在某些实 施方案中，所述癌症展示c-met扩增。在某些实施方案中，所述癌症展示c-met扩增和 EGFR扩增。在某些实施方案中，所述癌症展示野生型EGFR基因。在某些实施方案中，所 述癌症展示野生型EGFR基因和c-met扩增和/或c_met突变。在某些实施方案中，所述癌症展示EGFR突变。突变可位于EGFR基因的任 何部分或与EGFR基因有关的调节区中。例示性的EGFR突变包括例如外显子18， 19，20或21中的突变，激酶结构域中的突变，G719A，L858R，E746K，L747S， E749Q, A750P, A755V, V765M, S768I, L858P, E746-R748 删除，R748-P753 删除，M766-A767 AI 插入，S768-V769 SVA 插入，P772-H773 NS 插入，24020C， 24820A, 2486T > C, 2491G > C, 24940C, 25100T, 25390A, 25490T, 25630T, 2819T > C, 2482-2490 删除，2486-2503 删除，2544-2545 插入 GCCATA，2554-2555 插 入CCAGCGTGG，或2562-2563插入AACTCC。本领域知道EGFR活化性突变的其它例 子(参见例如美国专利公开文本No.2005/0272083)。在某些实施方案中，细胞或细胞系 不包含EGFR基因中的T790M突变。在某些实施方案中，所述癌症展示c-met和/或EGFR活化。在某些实施方案 中，所述癌症不展示c-met和/或EGFR活化。在某些实施方案中，所述癌症展示组成性c-met和/或EGFR活化。在一些实 施方案中，所述组成性EGFR包含酪氨酸激酶结构域中的突变。在某些实施方案中，所 述癌症不展示组成性c-met和/或EGFR活化。在某些实施方案中，所述癌症展示不依赖配体的c-met和/或EGFR活化。在 某些实施方案中，所述癌症不展示不依赖配体的c-met和/或EGFR活化。c-met拮抗剂可以与EGFR拮抗剂连续或联合施用，或是在同一组合物中或是 作为分开的组合物。可以同时进行c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的施用，例如作为单一 组合物或者作为两种或更多种不同组合物，使用相同或不同施用路径。或者/另外，可 以以任何次序序贯进行施用。或者/另外，可以作为序贯和同时二者任何次序的组合 来实施各步骤。在某些实施方案中，两个或更多个组合物的施用之间可以存在范围为 数分钟至数天，至数周至数月的间隔。例如，可以先施用EGFR拮抗剂，接着是c-met 拮抗剂。然而，还涵盖同时施用或者先施用c-met拮抗剂。因而，一方面，本发明提 供方法，包括施用c-met拮抗剂(诸如抗c-met抗体)，接着施用EGFR拮抗剂(诸如 Erlotinib(TARCEVA ))0在某些实施方案中，两个或更多个组合物的施用之间可以存 在范围为数分钟至数天，至数周至数月的间隔。一方面，本发明提供供治疗癌症中使用的组合物，其包含有效量的c-met拮抗 剂和药学可接受载体，其中所述使用包括同时或序贯施用EGFR拮抗剂。在一些实施 方案中，所述c-met拮抗剂是抗c-met抗体。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是 Erlotinib (TARCEVA )。—方面，本发明提供供治疗癌症中使用的组合物，其包含有效量的c-met拮抗 剂和药学可接受载体，其中所述使用包括同时或序贯施用EGFR拮抗剂。在一些实施 方案中，所述c-met拮抗剂是抗c-met抗体。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是 Erlotinib (TARCEVA )。根据要治疗的具体癌症适应证，本发明的联合疗法可以与别的治疗剂诸如化疗 剂或者别的疗法诸如放疗或手术联合。许多已知的化疗剂可以在本发明的联合疗法中使 用。优选地，会使用作为具体适应证标准治疗的那些化疗剂。联合中要使用的每种治疗 剂的剂量或频率优选与相应药剂在没有其它药剂的情况中使用时的剂量或频率相同，或 更少。附图简述
图1A和1B 通过qRT-PCR证实NSCLC细胞系和原发性肿瘤中的EGFR和
MET mRNA共表达。通过定量RT-PCR测定一组NSCLC细胞系(1A)或冷冻的原发性NSCLC肿瘤溶胞物(IB)中的EGFR和METmRNA的表达。在细胞系(P =0.59，ρ < 0.0001)和原发性 NSCLC 标本(P = 0.48，ρ = 0.0003)中 EGFR 和 MET mRNA 水平
正相关。图2 在对照培养基(Con)或含O.lug/ml四环素类似物多西环素(Dox)的培养 基中培养含有针对c-met的四环素诱导型shRNA或针对GFP的对照shRNA(shGFP2)的 EBCl shMet 4.12细胞(shMet 4.12)48小时。血清饥饿2小时后，细胞不处理㈠或者用 TGFa (Τ, 20nM)或调蛋白bl(Hrg，2nM)处理20分钟。如所示地对全细胞溶胞物评估 总的和磷酸-蛋白质的表达。检测肌动蛋白以显示各道之间的当量加载。图3 在对照培养基或含有O.lug/ml Dox的培养基(Dox)中培养含有针对c_met 的诱导型shRNA或针对GFP的对照shRNA的NSCLC H441细胞48小时。血清饥饿2 小时后，细胞不处理(_)或者用TGF a (T)或调蛋白bl (H)处理20分钟。检测β -肌动 蛋白(第4道)以显示各道之间的当量加载。图4 Erlotinib与shRNA敲低c_met在EBC-1 NSCLC异种移植物模型中的联 合功效。在裸(CRLnu/nu)动物中建立EBC-l-shMet-4.5肿瘤，然后用甲基纤维素吐温 (MCT)媒介加含有5%蔗糖的饮用水(Sue) (PO，QD,在箭头所指之处)，MCT加在5% 蔗糖中配制的含lmg/mL多西环素的饮用水(DOX)(100mg/kg; PO, QD,在箭头所指之 处)，Eriotinib加含有5%蔗糖的饮用水(PO，QD,在箭头所指之处)，或Erlotinib力口在 5%蔗糖中配制的含lmg/mL多西环素的饮用水(PO，QD,箭头所指之处)处理。在箭 头所指之日进行口服给药。在整个研究期间用瓶装蔗糖或Dox水，每2-3天更换。如实 施例中所述计算肿瘤体积和SEM。图 5 MetMAb 与 Erlotinib 在 NCI-H596 hu-HGF-Tg-C3H_SCID 异种移植物模 型中的联合功效。在hu-HGF-Tg-C3H_SCID或C3H-SCID同窝幼仔对照动物中培养 NCI-H596 肿瘤，并用 Captisol 媒介(PO，QD, x2 周)，Erlotinib (实心圆，短虚线； 150mg/kg, PO, QD, x2 周)，MetMAb (30mg/kg, IP, 一次)，或 MetMAb 加 Erlotinib
的组合以相同的剂量和日程表处理。在图的底部指示了 MetMAb (空心尖头)和Erlotinib 或媒介(实心箭头头)的给药。通过测径器进行肿瘤测量，每周2-3次，持续约9周或 直至由于组内肿瘤尺寸大而自研究中除去。如实施例中所述计算肿瘤体积和SEM。图6 为每个组计算肿瘤倍增时间(TTD)测量(定义为肿瘤尺寸倍增需要的时 间)，并用于生成Kaplan-Meier存活曲线。MetMAb加Erlotinib的组合显示出肿瘤进展 的显著改善，TTD均值为49.5 (士2.6)天，比较而言，MetMAb处理组为17.8 (士2.2)天， Erlotinib处理组为9.5 (士 1.2)天，而媒介对照组为9.5 (士 1.2)天。媒介和Erlotinib组的 曲线完美交叠。图7 描绘抗c-met抗体的一个实施方案的框架区(FR)，高变区(HVR)，第一 恒定域(CL或CHl)和Fc区(Fe)的氨基酸序列。所描绘的Fc序列包含突变T366S， L368A 和 Y407V，如 WO 2005/063816 在所记载的。图8:描绘包含突变T366W的Fc多肽的序列，如WO 2005/063816中所记载 的。在一个实施方案中，包含此序列的Fc多肽与包含图7之Fc序列的Fc多肽形成复合 物以生成Fc区。图9A-E c-met活性调节EGFR配体表达。A)在HGF响应性NSCLC细胞系中HGF处理诱导EGFR配体上调。Hop92或NCI-H596细胞血清饥饿过夜，然后不处理 (无HGF)或者用HGF (50ng/ml)处理6小时(HGF)。来自细胞-/+HGF处理的RNA进 行微阵列分析，如实施例中所记载的。RMA=相对微阵列。B)在不依赖配体的NSCLC 细胞系EBC-I中c-met敲低降低EGFR配体表达。稳定表达针对c_met的shRNA的克 隆(克隆3-15和4-12)不处理(无Dox)或者用多西环素处理(Dox) 24或48小时。来 自细胞的RNA进行微阵列分析，如实施例中所记载的。C)在没有HGF (无HGF)或有 HGF(100ng/ml)2小时的情况中稳定表达针对c_met的shRNA的EBClshMet4_12细胞不 处理(无Dox)或者用Dox处理(Dox) 24小时。来自细胞的RNA进行微阵列分析，如实 施例中所记载的。D)稳定表达针对c-met的shRNA的EBCshMet4_12细胞和稳定表达 shGFP2的对照细胞不处理(无Dox)或者用Dox处理(Dox) 24小时。来自细胞的RNA 进行微阵列分析，如实施例中所记载的。E)在裸(CRLnu-nu)动物中自EBClshMet_4.12 或EBCshMet-3.15细胞建立肿瘤，并给予小鼠在5%蔗糖中含lmg/ml Dox(Dox)或单独 的5%蔗糖的饮用水。3天后，通过ELISA评估肿瘤溶胞物中的TGF α水平。图IOA-C (A)EBCshMet 4.12 或 EBCshGFP2 细胞不处理(-)或者用 Dox 处理 (+)24，48或72小时。通过Western印迹对蛋白质溶胞物评估c-met，pEGFR或Her3。 (B)EBCshMet 4.12细胞用Dox(100ng/ml)处理48小时，并通过FACS分析细胞表面 Her3。 (C)具有EBCshMet 4.12肿瘤的小鼠给予在5%蔗糖中含lmg/ml Dox(Dox)或单 独的5%蔗糖(蔗糖)的饮用水3天。通过Western印迹对肿瘤溶胞物评估Her3蛋白质。图11 EBOl ShMet 细胞(3.15 或 4.5 或 4.12)不处理(-)或者用 100ng/ml Dox (+)单独处理96小时，或者启动Dox处理后48小时添加HGF (5或100ng/ml)或 TGFa(l 或 50nM)。使用 Cell Titer Glo 评估细胞数。图12 在HGF存在(右边小图)或缺失(左右小图)的情况中用NCI-H596细 胞实施时间过程实验。在刺激后10分钟(10’)，24小时，48小时或72小时制备细胞溶 胞物，并实施Western印迹以检测总c_met(顶图)，磷酸-EGFR(第2图)和总EGFR(第 3图)。检测β-肌动蛋白(第4图)以显示各道之间的当量加载。图13 在存在无配体，单独的TGF- α，TGF- α +HGF或单独的HGF的情况中 分配NCI-H596细胞。在刺激后10分钟和24小时制备细胞溶胞物，并实施对c_met的免 疫沉淀(IP)，接着是对磷酸_酪氨酸(4G10;顶图)，c-met(第2图)和EGFR(第3图) 的Western印迹。磷酸-酪氨酸印迹显示配体依赖性方式的EGFR(顶带)和c_met(底带) 活化，24小时后削弱。c-met免疫沉淀在所有条件中下拉EGFR，不管EGFR或c_met的 活化状态。图14 用NCI-H596细胞实施存活力测定法以评估在存在TGFa和不同浓度 HGF的情况中细胞对Erlotinib的响应，如所示的。在HGF水平自0.5ng/ml升高至50ng/ ml时检测到对Erlotinib的相对响应的降低。图15 在存在TGF α禾Π HGF(50ng/ml)，有或无MetMAb(l μ Μ)和不同浓度
Erlotinib的情况中用NCI-H596细胞实施存活力测定法。数据表述为相对于未处理对照的 百分比。未处理对照值显示为图左上部的各点。图16 MetMAb和Erlotinib联合处理导致更有效的对磷酸-Akt和磷酸-ERK1/2 的抑制。将携带NCI-H596肿瘤的人HGF转基因SCID(hu-HGF-Tg-SCID)小鼠用媒介(MetMAb缓冲液(100 μ L，IP)和甲基纤维素吐温(MCT，100 μ L，PO)， MetMAb ((30mg/kg, IP, 一次)禾口 MCT)，Erlotinib ((100mg/kg,在 MCT 中，100 μ L, PO)和MetMAb缓冲液(100 μ L，IP))或MetMAb和Erlotinib (剂量给药与为每一项所 述相同)处理。MetMAb (或缓冲液)在时间零(tOhr)给药，Erlotinib (或MCT)在时间 18小时(tl8hr)给药，在时间24小时(t24hr)对小鼠处以安乐死并收集肿瘤。通过直接 Western印迹和免疫沉淀接着Western印迹对肿瘤溶胞物分析总的和磷酸-蛋白质。缩写 pTyr=磷酸-酪氨酸，EGFR =表皮生长因子受体，ERK(细胞外信号调节的激酶_1和 2。检测肌动蛋白以显示各道之间的当量加载。图17Α和17Β:示意性描绘本申请中所记载的一些结果。发明详述I.定义如本文中所使用的，除非另有说明，术语“肝细胞生长因子”或“HGF”指能 够在容许HGF/c-met信号途经发生的条件下激活所述过程的任何天然或变异的(或是天 然的或是合成的)HGF多肽。术语“野生型HGF” 一般指包含天然发生HGF蛋白质的 氨基酸序列的多肽。术语“野生型HGF序列” 一般指在天然发生HGF中发现的氨基酸 序列。c-met是HGF的一种已知受体，HGF细胞内信号传导经由C_met在生物学上实 行。如本文中所使用的，术语“HGF变体”指在天然HGF序列中包含一处或多处氨 基酸突变的HGF多肽。任选地，所述一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。“天然序列”多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如 此，天然序列多肽可具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。此类天然序 列多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列”多肽明 确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形 式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。多肽“变体”指与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物学活 性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或删除一个或多个氨基酸 残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性，更优 选至少约90%氨基酸序列同一性和甚至更优选至少约95%氨基酸序列同一性。“EGFR”(可互换地称作“ErbBl”、“HER1”和“表皮生长因子受体”) 指Ullrich etal.，Nature (1984) 309 418425中记载的受体酪氨酸激酶多肽表皮生长因子受 体，或者指Her-I和c-erbB基因产物，及其变体，诸如EGFRvIII。EGFR的变体还包括 删除、替代和插入变体，例如 Lynch etal.，New England Journal of Medicine 2004, 350 2129 ； Paez etal.，Science 2004，304 1497 ； Pao etal.，PNAS 2004, 101 13306 中所 记载的那些。“生物学 ÷样品”(可互换地称作“样品”或“组织或细胞样品”)涵盖自个体获 得的且可用于诊断或监测测定法的多种样品类型。该定义涵盖血液和生物学起源的其它 液体样品、固体组织样品诸如活检标本或组织培养物或自其衍生的细胞、及其后代。该 定义还涵盖在获得它们后已经进行过操作的样品，诸如用试剂处理、增溶、或富集某些 成分诸如蛋白质或多核苷酸、或为切片目的而埋藏在半固体或固体基质中。术语“生物学样品”涵盖临床样品，而且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、 血浆、生物学流体、和组织样品。生物学样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、 冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体 液，诸如脑脊液、羊水、腹膜液、或间质液；来自受试者的妊娠或发育中任何时间的细 胞。在有些实施方案中，生物学样品是自原发性或转移性肿瘤获得的。生物学样品可含 有在自然界中不与该组织天然混和的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、 营养物、抗生素、诸如此类。“c-met拮抗剂”(可互换地称作“c-met抑制剂”)指干扰C_met活化或功能 的药剂。c-met抑制剂的例子包括c-met抗体；HGF抗体；小分子c_met拮抗剂；c_met 酪氨酸激酶抑制剂；反义和抑制性RNA (例如shRNA)分子(参见例如W02004/87207)。 优选地，c-met抑制剂是结合c-met的抗体或小分子。在一个具体的实施方案中，C_met 抑制剂具有约1,OOOnM或更低的对c-met的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方 案中，c-met抑制剂具有约IOOnM或更低的对c-met的结合亲和力。在另一个实施方案 中，c-met抑制剂具有约50nM或更低的对c_met的结合亲和力。在一个具体的实施方案 中，c-met抑制剂共价结合c-met。在一个具体的实施方案中，c_met抑制剂以Ι,ΟΟΟηΜ 或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c_met抑制剂以500nM或更 低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，C_met抑制剂以50nM或更低的 IC50抑制c-met信号传导。如本文中所使用的，术语“c-met靶向药物”指结合c-met并抑制c-met活化的 治疗剂。c-met靶向药物的一个例子是MetMAb (OA5D5.v2)。“c-met活化”指c-met受体的活化或磷酸化。一般而言，C_met活化导致信号 转导(例如由c-met受体的细胞内激酶结构域引起的，磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨 酸残基)。c-met活化可以由c-met配体(HGF)结合感兴趣c_met受体来介导。HGF对 c-met的结合可活化c-met的激酶结构域并由此导致c_met中酪氨酸残基的磷酸化和/或 别的底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。“EGFR拮抗剂”(可互换地称作“EGFR抑制剂”)指干扰EGFR活化或功 能的药剂。EGFR抑制剂的例子包括EGFR抗体；EGFR配体抗体；小分子EGFR拮 抗剂；EGFR酪氨酸激酶抑制剂；反义和抑制性RNA(例如shRNA)分子(参见例如 W02004/87207)。优选地，EGFR抑制剂是结合EGFR的抗体或小分子。在一些实施方 案中，EGFR抑制剂是EGFR靶向药物。在一个具体的实施方案中，EGFR抑剂具有约 Ι,ΟΟΟηΜ或更低的对EGFR的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方案中，EGFR抑 制剂具有约IOOnM或更低的对EGFR的结合亲和力。在另一个实施方案中，EGFR抑制 剂具有约50ηΜ或更低的对EGFR的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，EGFR抑制 剂共价结合EGFR。在一个具体的实施方案中，EGFR抑制剂以Ι,ΟΟΟηΜ或更低的IC50 抑制EGFR信号传导。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂以500ηΜ或更低的IC50抑制 EGFR信号传导。在另一个实施方案中，EGFR抑 制剂以50ηΜ或更低的IC50抑制EGFR 信号传导。表述“ ErbB2，，禾Π “ HER2，，在本文中可互换使用，指例如Semba et al.， PNAS (USA) 82 6497-6501(1985)和 Yamamoto et al.Nature 319 230-234(1986)中记载的人HER2蛋白质(Genebank登录号X03363)。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因， 而“neu”指编码大鼠ρ185·的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。
“ErbB3” 禾Π “HER3” 指例如美国专利 Νο.5,183,884 和 5,480,968 以及 ICraus et al.PNAS(USA)86 9193-9197(1989)中披露的受体多肽。 术语“ErbB4”和“HER4”在本文中指例如欧洲专利申请No.599,274 ； Plowman et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90: 1746-1750(1993)；和 Plowman et al.， Nature, 366 473-475(1993)中披露的受体多肽，包括其同等型(isoforms)，例如1999 年4月22日公布的W099/19488中披露的。如本文中所使用的，“ErbB”指受体多肽EGFR，HER2, HER3禾Π HER4。“EGFR活化”指EGFR的活化或磷酸化。一般而言，EGFR活化导致信号转 导(例如由EGFR受体的细胞内激酶结构域引起的，磷酸化EGFR或底物多肽中的酪氨酸 残基)。EGFR活化可以由EGFR配体结合包含EGFR的EGFR 二聚体来介导。EGFR 配体对EGFR 二聚体的结合可活化二聚体中一个或多个EGFR的激酶结构域并由此导致一 个或多个EGFR中酪氨酸残基的磷酸化和/或别的底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。如本文中所使用的，术语“EGFR靶向药物”指结合EGFR并抑制EGFR活化 的治疗剂。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子 包括 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB 8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb 528 (ATCC CRL 8509)(参见美国专利第 4,943,533 号，Mendelsohn et al.)及其变体，诸如嵌合化225 (C225或Cetuximab ； ERBUTIX )和重构人225 (H225) (参见 WO 96/40210，Imclone Systems Inc.) ； IMOl 1F8，一种完全人的 EGFR 靶向抗 体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的 人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所记载的；及结合EGFR的人抗体，诸 如 ABX-EGF (参见 WO 98/50433，Abgenix) ； EMD 55900 (Stragliotto et al.，Eur.J.Cancer 32A 636-640 (1996)) ； EMD7200 (matuzumab)，一种针对 EGFR 的人源化 EGFR 抗体， 其与EGF和TGF- α 二者竞争EGFR结合；及mAb 806或人源化mAb 806 (Johns et al., J.Biol.Chem.279 (29) 30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可偶联细胞毒剂，如此产生免 疫偶联物(参见例如EP 659,439 A2，Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子的例子包 括 ZD1839 或 Gefitinib (IRESSA ； Astra Zeneca) ； CP-358774 或 Erlotinib (TARCEVA ； Genentech/OSI)；和 AG1478、AG1571 (SU 5271 ； Sugen) ； EMD-7200。“EGFR抗性”癌症意味着癌症患者在接受EGFR拮抗剂疗法的同时有发展(即 患者是“EGFR不应性”的)，或者患者在完成基于EGFR拮抗剂的治疗方案后12个月 内(例如1个，2个，3个，或6个月内)有发展。例如，包含T790M突变体EGFR的 癌症对Erlotinib和Gefitinib疗法有抗性。“ Erlotinib或Gefitinib抗性”癌症意味着癌症患者在接受基于Erlotinib或 Gefitinib的疗法的同时有发展(即患者是“Erlotinib或Gefitinib不应性”的)，或者患者 在完成基于Erlotinib或Gefitinib的治疗方案后12个月内(例如1个，2个，3个，或6个
月内)有发展。如本文中所使用的，如例如应用于受体信号传导活性，术语“不依赖配体的” 指不依赖配体的存在的信号传导活性。例如，EGFR信号传导可源自与其它HER家族成员(诸如HER2)的二聚化。具有不依赖配体的激酶活性的受体不会必然排除配体结合该 受体以产生额外的激酶活性活化。如本文中所使用的，如例如应用于受体激酶活性，术语“组成性”指受体不依 赖配体或其它活化性分子的存在的持续信号传导活性。例如，常常在多形性成胶质细胞 瘤中找到的EGFR变体III(EGFRVIII)删除了它很大部分的细胞外结构域。虽然配体不能 够结合EGFRvIII，但是它是持续有活性的且与异常增殖和存活有关。根据受体的性质， 所有活性可以是组成性的，或者受体的活性可以通过其它分子(例如配体)的结合而进一 步活化。导致受体活化的细胞事件是本领域普通技术人员公知的。例如，活化可包括寡 聚化(例如二聚化，三聚化，等)成高级受体复合物。复合物可包含单一种类的蛋白质， 即同聚复合物。或者，复合物可包含至少两种不同蛋白质种类，即异聚复合物。可以通 过例如受体的正常或突变体形式在细胞表面上的过表达来引起复合物形成。也可以通过 受体中的特定突变来引起复合物形成。短语“基因扩增”指在特定细胞或细胞系 中形成多拷贝的基因或基因片段的 过程。复制区(扩增的DNA的区段)常常称作“扩增子”。通常，所产生的信使 RNA(mRNA)的量，即基因表达的水平，也按由所表达特定基因形成的拷贝数的比例增 加。“酪氨酸激酶抑制剂”指一定程度抑制酪氨酸激酶(诸如c-met受体)的酪氨酸 激酶活性的分子。“展示出C-met和/或EGFR表达、扩增或活化”的癌或生物学样品指在诊断测 试中表达(包括过表达)c-met和/或EGFR，具有扩增的c_met和/或EGFR基因和/或 以其它方式展现出c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。“不展示c-met和/或EGFR表达、扩增或活化”的癌或生物学样品指在诊断测 试中不表达(包括过表达)c-met和/或EGFR，不具有扩增的c_met和/或EGFR基因和 /或不以其它方式展现出c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。“展示出c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中展现出 c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA 来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。“不展示c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中不展现出 c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA 来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。“展示出组成性c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中展 现出组成性c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例 如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。“不展示c-met和/或EGFR扩增”的癌或生物学样品指在诊断测试中不具有扩 增的c-met和/或EGFR基因的癌或生物学样品。“展示出c-met和/或EGFR扩增”的癌或生物学样品指在诊断测试中具有扩增 的c-met和/或EGFR基因的癌或生物学样品。“不展示组成性c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中不 展现组成性c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。“展示出不依赖 配体的c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测 试中展现出不依赖配体的c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活 化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。“不展示不依赖配体的C-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测 试中不展现不依赖配体的c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活 化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。“磷酸-ELISA测定法”(phosho-ELISA assay)在本文中指在酶联免疫吸附测定 法(ELISA)中评估一种或多种c-met和/或EGFR的磷酸化的测定法，其中使用检测磷 酸化的c-met和/或EGFR、底物或下游信号分子的试剂(通常是抗体)。优选的是，使 用检测磷酸化c-met和/或EGFR的抗体。该测定法可以对细胞溶胞物，优选来自新鲜 的或冷冻的生物学样品的细胞溶胞物进行。“c-met和/或EGFR过表达或扩增”的癌细胞指与同一组织类型的非癌性细胞 相比，具有显著更高水平的c-met和/或EGFR蛋白质或基因的癌细胞。此类过表达可以 是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面 上存在的c-met和/或EGFR蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定法；IHC)来测定 c-met和/或EGFR过表达或扩增。或者/另外，可测量细胞中编码c_met和/或EGFR的 核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH ；参见1998年10月公布的WO 98/45479)、 Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。在上述测 定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者身体内的细胞暴露 于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估该抗体对患者身体内 细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的 活检。“不过表达或扩增c-met和/或EGFR”的癌细胞指与同一组织类型的非癌性细 胞相比，不具有高于正常的c-met和/或EGFR蛋白质或基因水平的癌细胞。术语“突变”在用于本文时指特定蛋白质或核酸(基因，RNA)分别相对于野 生型蛋白质或核酸的氨基酸或核酸序列的差异。突变的蛋白质或核酸可以由基因的一个 等位基因(杂合的)或两个等位基因(纯合的)表达或者在其中找到，而且它可以是体细 胞的或种系的。在本发明中，突变一般是体细胞的。突变包括序列重排，诸如插入、删 除、和点突变(包括单核苷酸/氨基酸多态性)。“抑制”指与参照相比减小或降低活性、功能、和/或量。蛋白质“表达”指基因中编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋 白质。在本文中，“表达”感兴趣蛋白质(诸如HER受体或HER配体)的样品或细胞 指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA或蛋白质(包括其片段)的样品或细胞。“免疫偶联物”(可互换地称作“抗体_药物偶联物”或“ADC”)指抗体偶 联至一种或多种细胞毒剂，诸如化疗剂，药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素， 细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射偶 联物)。
如本文中所使用的，术语“Fe区” 一般指包含免疫球蛋白重链C端多肽序列 的二聚体复合物，其中C端多肽序列是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体可获得的。Fc区 可包含天然或变体Fc序列。虽然免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可以有所变化，但是 人IgG重链Fc序列通常定义为Fc序列自位于大约位置Cys226的氨基酸残基，或自大约 位置Pro230，至羧基端的区段。免疫球蛋白的Fc序列一般包含两个恒定域，CH2域和 CH3域，且任选包含CH4域。Fc区的C端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以 消除，例如在抗体纯化期间，或者通过对编码抗体的核酸进行重组工程改造。因而，依 照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗 体、或有和无K447残基的抗体的混合物。“Fe多肽”在本文中 指构成Fc区的多肽之一。可以自任何合适的免疫球蛋白 获得 Fc 多肽，诸如 IgG1, IgG2, IgG3,或 IgG4 亚型，IgA，IgE, IgD 或 IgM。在一些
实施方案中，Fc多肽包含部分或整个野生型铰链序列(一般位于其N端)。在一些实施 方案中，Fc多肽不包含功能性或野生型铰链序列。如本文中所使用的，“铰链区”，“铰链序列”，及其变化形式包括本领 域知道的含义，其例示于例如 Janeway et al., Immuno Biology the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY)(第 4 版，1999) ； Bloom et al., Protein Science (1997)，6 407-415; Humphreys et al., J.Immunol.Methods (1997)，209 193-202。贯穿本说明书和权利要求书，免疫球蛋白重链中的残基编号方式是如Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991)(通过述及明确收入本文)中的EU索引的编号
方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgGl EU抗体的残基编号方式。术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多 克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、及抗体片段，只 要它们展现出期望的生物学活性。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于 完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在一个实施方案中， 抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案 中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与 之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结 合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例 如，此类抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列 相连。在一个实施方案中，本发明的抗体是如W02005/063816中所记载的单臂抗体。在 一个实施方案中，单臂抗体包含如W02005/063816中所记载的构成“结(knob) ”和“穴 (hole)”的Fc突变。例如，穴突变(hole mutation)可以是Fc多肽中的T366A、L368A 禾口 /或Y407V中的一个或多个，而腔突变(cavity mutation)可以是T366W。“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性 的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。除非另有说明，贯穿本说明书，表述“多价抗体”用于指包含三个或更多个抗原结合位点的抗体。多价抗体优选改造成具有三个或更多个抗原结合位点，而且一般不 是天然序列IgM或IgA抗体。"Fv"片段是包含完整 抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合 (该结合的本质可以是共价的，例如在scFv中)的一个重链可变域和一个轻链可变域的二 聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个CDR相互作用而在Vh-V^ 二聚体表面 上限定了一个抗原结合位点。六个CDR或其子集一起赋予抗体以抗原结合特异性。然 而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和 结合抗原的能力，只是通常亲和力低于完整结合位点。在用于本文时，“抗体可变域”指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区 (CDR ；即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架区(FR)氨基酸序列的那部分。Vh指重链可 变域。V^指轻链可变域。依照本发明所使用的方法，归为CDR和FR的氨基酸位置可 以依,照 Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.，1987和1991))来限定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也依照 Kabat。在用于本文时，术语“互补决定区(CDR ；即CDR1、CDR2、禾Π CDR3)指抗 体可变域中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个CDR，鉴 定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自如Kabat定义的“互补决 定区”的氨基酸残基(即大约是轻链可变域的残基24-34 (Li)、50-56 (L2)和89-97 (L3) 及重链可变域的残基 31-35 (Hl)、50-65 (Η2)和 95-102 (Η3) ； Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service， National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))和/或来自“高变环”的残基(即大约是轻链可变域的 残基 26-32 (Li)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)及重链可变域的残基 26-32 (Hl)、53-55 (H2) 禾口 96-101 (H3) ； Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196 901-917 (1987))。在有些情况中， 互补决定区可以包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸。例如，抗体4D5重 链的CDRHl包含氨基酸26-35。“框架区”(以下的FR)指可变域中CDR残基以外的残基。每个可变域通常 具有四个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。 如果CDR是依照Kabat定义的，那 么轻链FR残基位于大约轻链残基1-23 (LCFRl)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)、和 98-107 (LCFR4),而重链 FR 残基位于大约重链残基 1_30 (HCFRl)、36-49 (HCFR2)、 66-94 (HCFR3)、禾Π 103-113 (HCFR4)。 如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，那 么轻链FR残基位于大约轻链残基1-25 (LCFRl)、33-49 (LCFR2)、53-90 (LCFR3)、和 97-107 (LCFR4),而重链 FR 残基位于大约重链残基 1_25 (HCFRl)、33-52 (HCFR2)、 56-95 (HCFR3)、和102-113 (HCFR4)。在有些情况中，在CDR包含来自Kabat定义的 CDR和高变环二者的氨基酸时，FR残基将做相应的调整。例如，当CDRHl包含氨基酸 Η26-Η35时，重链FRl残基位于1_25位，而FR2残基位于36-49位。“Fab”片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域(CHl)。 F(ab' )2抗体片段包含一对Fab片段，这对Fab片段一般通过它们之间的铰链半胱氨酸在 它们羧基末端附近共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和Vl结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在Vh与Vl结构域之间进一步包含多肽 接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun， 于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编， Springer-Verlag，New York，第 269Il5 页，I"4。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多 肽链(Vh及VJ中包含相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(VJ。通过使用过短的 接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结 构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097 ； WO 93/11161 ； Hollinger 等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448(1993)。表述“线性抗体”指Zapata 等.，Protein Eng., 8(10) 1057-1062(1995)中所 描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(Vh-ChI-Vh-ChI),该区段与互 补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性 的。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得 的特征，不应解释 为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明 使用的单克隆抗体可 通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein.，Nature, 256 495-97(1975) ； Hongo et al.，Hybridoma, 14(3) 253-260(1995)，Harlow et al.， Antibodies A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)； Hammerling et al., in Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参 见例如 Clackson et al., Nature 352 624-628(1991) ； Marks et al., J.Mol.Biol.222 581-597 (1992) ； Sidhu et al., J.Mol.Biol.338 (2) 299-310 (2004) ； Lee et al.， J.Mol.Biol.340(5) 1073-1093(2004) ； Fellouse, Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34) 12467-12472(2004) ； Leeetal., J.Immunol.Methods 284(1-2) 119-132(2004))、及用 于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成 人或人样抗体的技术(参见例如 WO 1998/24893 ； WO 1996/34096 ； WO 1996/33735 ； W01991/10741 ； Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 2551 (1993)； Jakobovits et al.，Nature 362 255-258 (1993) ； Braggemann et al.，Year in Immunol.7 33(1993)；美国专禾丨J No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016 ； Marks et al., Bio/Technology 10 779-783(1992) ； Lonberg et al., Nature 368 856-859(1994) ； Morrison, Nature368 812-813(1994) ； Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14 845-851(1996) ； Neuberger, Nature Biotechnol. 14 826(1996) ； Lonberg and Huszar, Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分 与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链 的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或 同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利 No.4,816,567 ；及 Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 6851-6855 (1984))。嵌合 抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过用感兴趣抗原免疫短尾猴(macaque monkey)而生成的抗体。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白 的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变 区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或 非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框 架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗 体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗 体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中所有或基本上所有高变环对应 于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR。人 源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。 更多细节参见 Jones etal.，Nature 321 522-525 (1986) ； Riechmann et al.，Nature 332 323-329(1988) ； Presta, Curr.Op.Struct.Biol.2 593-596(1992)。“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使 用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包 含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在 一个实施方案中，人抗体是从噬菌体文库选择的，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 309-314(1996) ； Sheets et al., Proc.Natl.Acad.Sci.95 6157-6162(1998) ； Hoogenboom and Winter, J.Mol.Biol.227 381(1991) ； Marks et al., J.Mol.Biol.222 581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球 蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物(例如小鼠)来生成。在受到攻击时，观察 到人抗体生成，它在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体 全集。这种方法记载于例如美国专利No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016，及以下科学出版物Marks et al., Bio/Technology 10 779-783(1992) ； Lonberg et al.，Nature 368 856-859(1994) ； Morrison, Nature 368 812-13(1994) ； Fishwild et al.，Nature Biotechnology 14 845-51 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnology 14 826(1996) ； Lonberg and Huszar, Intern.Rev.Immunol. 13 65-93(1995)。或者，人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化 来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如Cole et al.， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss， p.77 (1985) ； Boerner et al.， J.Immunol. 147(1) 86-95(1991)；及美国专利 No.5,750,373。“裸抗体(裸露的抗体)，，指未偶联异源分子诸如细胞毒性模块或放射性标记物 的抗体。“亲和力成熟的”抗体 指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导 致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和 力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体 可通过本领域已知规程来生成。Marks etal.，Bio/Technology 10 779-783 (1992)记载了 通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了 CDR和/或框架残基的随 机诱变Barbasetal., Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91 3809-3813(1994) ； Schieretal.，Gene 169 147-155(1995) ； Yelton etal.，J.Immunol. 155 1994-2004(1995) ； Jackson et al.,J.Immunol.l54(7) 3310-9(1995) ； Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226 889-896(1992)。具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。为了筛选结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体，可以实施常规交叉阻 断测定法，诸如 Antibodies， A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中所记载的。为了延长包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期，可如例如美国专利 No.5,739,277中所记载的将补救受体结合表位附着于抗体(尤其是抗体片段)。例如，可 以将编码补救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸在同一读码框内相 连接，使得由改造后的核酸分子编码的融合蛋白包含补救受体结合表位和本发明的多肽 序列。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgGp IgG2, IgG3 或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(例如Ghetie etal.，Ann.Rev. Immunol. 18 739-766(2000),表1)。其Fc区中有替代且血清半衰期延长的抗体还记载 于 W000/42072 ； WO 02/060919 ； Shields et al., J.Biol.Chem.276 6591-6604(2001)； Hinton, J.Biol.Chem.279 6213-6216(2004))。在另一个实施方案中，还可以通过例如 附着其它多肽序列来延长血清半衰期。例如，可以将在本发明的方法中有用的抗体或其 它多肽附着于血清清蛋白或血清清蛋白中结合FcRn受体或血清清蛋白结合肽的那部分， 使得血清清蛋白结合该抗体或多肽，例如此类多肽序列披露于W001/45746。在一个优 选的实施方案中，待附着的血清清蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQIDNO 21)。在另一个实施方案中，Fab的半衰期通过这些方法得到了延长。血清清蛋白结合 肽序列还可参见 Dennis et al., J.Biol.Chem.277 35035-35043 (2002)。“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分 分开和/或回收的。多肽或抗体的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途 的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方 案中，将多肽或抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽或抗体重量超过95%且最优 选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部 氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选的银染色的还原性或非还原性条件 下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离 的多肽或抗体包括重组细胞内的原位多肽或抗体。然而，分离的多肽或抗体通常通过至 少一个纯化步骤来制备。“片段”指多肽和核酸分子的一部分，其含有参比核酸分子或多肽全长的的优 选至少 10%、20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,或更多。片 段可含有 10、20、30、40、50、60、70、80、90、或 100、200、300、400、500、600、 或更多个核苷酸，或者 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、 180、190、200或更多个氨基酸。“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的 受试者包括那些早就患有良性、癌前、或非转移性肿瘤的以及要预防发生或复发的。术语“治疗有效量”指在哺乳动物中治疗或预防疾病或病症的治疗剂量。在癌 症的情况中，治疗有效量的治疗剂可减少癌细胞的数目；缩小原发性肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，优 选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病 症有 关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以 是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持 续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测 量。术语“癌(症)，，和“癌(性)的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的 细胞生长为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿 瘤”指非侵入性的或转移性的，或者归为0期、I期、或II期癌症的癌症。癌症的例子包 括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂 肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间 皮瘤、施旺氏细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性 肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞 肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃 癌(gastric or stomach cancer)包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝 癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括转移性乳 腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer),前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆 管肿瘤、及头和颈癌。术语“癌前”指典型地在癌之前或发展成癌的疾患或生长。“癌前”生长会具 有以异常细胞周期调节、增殖、或分化为特征的细胞，这些可通过细胞周期调节、细胞 增殖、或分化的标志物来测定。“发育异常”指组织、器官、或细胞的任何异常生长或发育。优选的是，发育 异常是高级的或癌前的。“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿 瘤，渗透入淋巴和血管，经由血流而循环和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶 (转移)中生长。转移可以是当地的或远端的。转移是一个连续过程，视肿瘤细胞自原 发性肿瘤脱落、经由血流而传播、并在远端部位停止而定。在新的部位，该细胞建立血 供且能生长至形成危及生命的团块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调节这种行为，而且肿瘤细胞与远端部 位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管系统或渗透 至原发部位以外的组织的癌症。一般而言，非转移性癌症指作为0期、I期、或II期癌 症和偶尔的III期癌症的任何癌症。“原发性肿瘤”或“原发性癌”指初始的癌症，而不是位于受试者身体中另一 组织、器官、或位置中的转移病灶。“良性肿瘤”或“良性癌”指仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或 转移至远端部位的肿瘤。“肿瘤载荷”指身体中癌细胞的数目、肿瘤的尺寸、或癌的量。肿瘤载荷也称作肿瘤负荷。“肿瘤数目”指肿瘤的数目。“受试者”指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如牛，马，犬， 绵羊，或猫。优选地，受试者是人。术语“抗癌疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限 于例如化疗剂、生长制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡 齐U、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的药剂，抗CD20抗体、血小板衍生生长因子抑制剂 (例如 Gleevec (Imatinib Mesylate))、COX-2 抑制剂(例如 celecoxib)、干扰素、细胞 因子、结合一种或多种以下靶物的拮抗剂(例如中和性抗体)(ErbB2、ErbB3、ErbB4、 PDGFR-β、BlyS > APRIL、BCMA 或 VEGF 受体、TRAIL/Apo2)、和其它生物活性和 有机化学剂，等。本发明还包括它们的组合。术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的 物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9tl和Re186)、化疗剂、和毒素诸 如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治 疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷基化剂类(alkylating agents)，诸如塞替 派(thiotepa)和 CYTOXAN 环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)； 氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替 派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类 (methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三 乙撑磷酉先胺(triethylenephosphoramide) > 三乙撑硫代磷酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛 (bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物 托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin) ； callystatin ； CC-1065 (包括其阿多来 新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类 (cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin) ； duocarmycin (包 括合成类似物，KW-2I89 和 CBI-TMl)；艾榴塞洛素(eleutherobin) ； pancratistatin ； sarcodictyin ；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酉先胺(cholophosphamide)、雌莫司 Π" (estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮 芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仓(melphalan)、新氮芥(novembichin)、 苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿 啼唆氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、 氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司 汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne) (例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素Y II和加利车霉素ω Il (参 见例如 Agnew (1994) Chem.Intl.Ed.Engl.33 183-186)；蒽环 类抗生素(dynemicin)， 包括 dynemicin A ； 二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯 二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨 茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素 C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin) > 嗜癌霉素(carzinophilin)、色 霄素(chromomycin)、方文线菌素D (dactinomycin)、柔红霄素(daunorubicin)、 地托比星 (detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin) (包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、 表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorabicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素 (marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素 C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、 泊非霉素(pot&omycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多 比星(rodorubicin)、链黑菌素(Streptonigrin)、链佐星(Streptozocin)、杀结核菌素 (tubercidin)、乌苯美 司(ubenimex)、净司他 丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)； 抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物， 诸如二 甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三 甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤 (mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物， 诸如安西他滨(iincitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫 氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷 (doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾 酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate) > 表硫雄酉享(epitiostanol)、 美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶 酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)； 氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼 P定(eniluracil)；安吖 P定(amsacrine)； bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)； 地美可辛(demecolcine)；地吖酉昆(diaziquone) ； elfornithine ；依禾丨J 醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)； 香菇多糖(Ientinan)；氯尼达明(Ionidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)， 诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托 蒽酉昆(mitoxiintrone)；莫哌达醇(mopidamol) ； 二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；批柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone)； 鬼臼酸(podophyllinic acid) ； 2_ 乙基酰胼(ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)； PSK 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根 霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸 (tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone) ； 2，2'，2〃 -三氯三乙胺；单端孢菌素类 (trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracarin) A、杆孢菌素(roridin) A和蛇行 菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)； 甘露莫司汀(mannomustine) ； 二、溴甘露醇(mitobronitol) ； 二、溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman) ； gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；环磷酰胺 (cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如TAXOL 帕利 他塞(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE 不 含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg，Illinois)禾Π TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁 酸氮芥(chlorambucil) ； GEMZAR 吉西 他滨(gemcitabine) ； 6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨 蝶呤(methotrexate)；钼类似物，诸如顺钼(cisplatin)和卡钼(carboplatin)；长春碱 (vinblastine)；钼(platinum)；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)； 米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine) ； NAVELBINE 长春瑞滨 (vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)； 道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐 (ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及 5_FU 和 亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ； 二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类 视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他 汀(combretastatin)；亚叶酸(Ieucovorin) (LV)；奥沙利钼(oxaliplatin)，包括奥沙利钼 治疗方案(FOLFOX) ； PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR (例 如 Erlotinib (TarcevaTM))禾口 VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生 物。该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激 素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包 括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、 4_羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LYl 17018、 奥那司酮(onapristone)和FARESTON 托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺 中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特 (aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR 伏罗唑 (vorozole) > KEMARA 来曲唑(Ietrozole)和ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)；抗 雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、 亮丙瑞林(Ieuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine) (1，3-二 氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(abhenmt)细胞增 殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras;核 酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如ANGIOZYME 核酸)和HER2表达抑制剂； 疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和 VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL-2 ； LURTOTECAN 拓扑异构酶 1 抑制剂； ABARELIX rmRH ；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专 利No.4,675,187)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。术语“前体药物”在用于本中请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的 细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体和衍生物形式。 参见例如 Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy”，Biochemical Society Transactions, 14，pp.375-382, 615thMeeting Belfast (1986)和 Stella et al.，‘‘Prodrugs : A Chemical Approach to Targeted Drag Delivery” , Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.)，pp.247-267，Humana Press (1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯
前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨 基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰 胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药 物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细 胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够 损伤，以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会，本领域知道许多方 式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围 为每天10-200个单位(戈瑞(Gray))。治疗剂本发明特征在于c-met拮抗剂和EGFR拮抗 剂在联合疗法中治疗受试者中的病理 状况(诸如肿瘤)的用途。c-met 拮抗剂在本发明的方法中有用的c-met拮抗剂包括特异性结合c-met的多肽，抗c_met 抗体，c-met小分子，特异性结合c-met的受体分子和衍生物和融合蛋白。cmet拮抗剂 还包括c-met多肽的拮抗性变体，针对c-met和HGF的RNA适体和肽体。在本发明的 方法中有用的c-met拮抗剂还包括抗HGF抗体，抗HGF多肽，特异性结合HGF的c_met 受体分子和衍生物。下文描述了这些每一项的例子。在本发明的方法中有用的抗c-met抗体包括任何以足够亲和力和特异性结合 c-met且能降低或抑制c-met活性的抗体。所选择的抗体正常情况下会具有足够强的对 c-met的结合亲和力，例如抗体会以介于IOOnM-IpM之间的Kd值结合人c_met。抗体 亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请 公开文本NO.W02005/012359中所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测 定法(例如RIA)来测定。优选地，本发明的抗c-met抗体能在靶向和干扰涉及c-met/ HGF活性的疾病或状况中用作治疗剂。还有，可以将所述抗体提交其它生物学活性测定 法，例如为了评估它作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体 的靶抗原和预定用途。抗c-met抗体是本领域已知的(参见例如Martens, Τ, et al (2006) Clin Cancer Res 12(20 Pt 1) 6144 ； US 6,468,529 ； W02006/015371 ； W02007/063816 ； US7,408,043 ； W02009/007427 ； W02005/016382 ； W02007/126799)。在一个实施
方案中，抗c-met抗体包含重链可变域，其包含图7中所绘CDR1-HC，CDR2-HC禾口 CDR3-HC序列(SEQ ID NO 13-15)中的一项或多项。在一些实施方案中，所述抗体 包含轻链可变域，其包含图7中所绘CDR1-LC，CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQ ID NO: 5-7)中的一项或多项。在一些实施方案中，重链可变域包含图7中所绘FR1-HC， FR2-HC, FR3-HC和FR4-HC序列(SEQ ID NO 9-12)。在一些实施方案中，轻链可变域包含图 7 中所绘 FR1-LC，FR2-LC, FR3-LC 和 FR4-LC 序列(SEQ ID NO 1-4)。 在一些实施方案中，抗c-met抗体是单价的且包含Fc区。在一些实施方案中，所述抗体 包含图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO 17)。在一些实施方案中，所述抗体是单价的且包含Fc区，其中所述Fc区包含第一和 第二多肽，其中所述第一多肽包含图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO: 17)且所述第二多肽 包含图8中所绘Fc序列(SEQ ID NO 18)。在一个实施方案中，抗c-met抗体包含(a)第一 多肽，其包含具有下述序列的重 链可变域QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIG MIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDY WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO 19)，图 7 中所绘 CHl 序列(SEQID NO 16)和图 7 中 所绘Fc序列(SEQ ID NO: 17)；和(b)第二多肽，其包含具有下述序列的轻链可变域 DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAST RESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO 20)和图7中所绘CLl序列(SEQ ID NO 8)；和(c)第三多肽，其包含图8中所 绘 Fc 序歹丨J (SEQ ID NO 18)。在其它实施方案中，抗c-met抗体是由以美国典型培养物保藏中心登录号ATCC HB_11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系生成 的单克隆抗体。在其它实施方案中，所述抗体包含由以美国典型培养物保藏中心登录号 ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系 生成的单克隆抗体的一种或多种CDR序列。在其它实施方案中，本发明的c-met抗体特异性结合c-met Sema结构域或其变 体的至少一部分。在一个例子中，本发明的拮抗性抗体特异性结合至少一种选自下组的 序列LDAQT (SEQ ID NO 22)(例如 c_met 的残基 269-273)，LTEKRKKRS (SEQ ID NO 23)(例如 c-met 的残基 300-308)，KPDSAEPM (SEQID NO 24)(例如 c-met 的残 基 350-357)和 NVRCLQHF (SEQ ID NO 25)(例如 c_met 的残基 381-388)。在一个实施 方案中，本发明的拮抗性抗体特异性结合由至少一种选自下组的序列的部分或整个形成 的构象表位LDAQT (SEQID NO 22)(例如 c_met 的残基 269-273)，LTEKRKKRS (SEQ ID NO 23)(例如 c-met 的残基 300-308)，KPDSAEPM (SEQ ID NO 24)(例如 c_met 的残基 350-357)和 NVRCLQHF (SEQ ID NO 25)(例如 c_met 的残基 381-388)。在 一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体特异性结合与序列LDAQT (SEQ IDNO : 22)， LTEKRKKRS (SEQ ID NO 23)，KPDSAEPM (SEQ ID NO 24)和 / 或NVRCLQHF (SEQ ID NO 25)具有至少50%，60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%序列同一性或相似性 的氨基酸序列。抗HGF抗体是本领域公知的。参见例如Kim KJ, et al.Clin Cancer Res. (2006) 12 (4) 1292-8 ； W02007/115049 ； W02009/002521 ； W02007/143098 ； W02007/017107 ； W02005/017107 ； L2G7 ； AMG-102。特异性结合HGF的c-met受体分子或其片段能在本发明的方法中使用，例如用 于结合和隔绝HGF蛋白质，由此阻止其信号传导。优选地，c-met受体分子或其HGF结 合片段是可溶性形式。在一些实施方案中，所述受体的可溶性形式通过结合HGF，由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体而对c-met蛋白质的生物学活性发挥抑制效 果。还包括c-met受体融合蛋白，下文描述了它的例子。本发明的可溶性c-met受体蛋白质或嵌合c-met受体蛋白质包括没有经跨膜结 构域固定至细胞表面的c-met受体蛋白质。因此，c-met受体的可溶性形式(包括嵌合 受体蛋白质)在能够结合和灭活HGF的同时不包含跨膜结构域且如此一般不变成与表达 该分子的细胞的细胞膜结合。参见例如Kong-Beltran，M et al Cancer Cell (2004) 6 (1) 75-84。特异性结合c-met并阻断或降低c-met活化，由此阻止它发信号的HGF分子或 其片段能在本发明的方法中使用。适体是形成特异性结合靶分子(诸如HGF多肽)的三级结构的核酸分子。适体 的生成和治疗用途是本领域已完善建立的。参见例如美国专利Νο.5,475,096。HGF适体 是PEG化的修饰的寡核苷酸，其采取使之能够结合细胞外HGF的三维构象。关于适体 的别的信息可见于美国专利申请公开文本No.20060148748。肽体是与编码免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列相连接的肽序列。多 肽可衍生自随机化序列，通过任何方法来选择特异性结合，包括但不限于噬菌体展示技 术。在一个优选的实施方案中，可以将所选择的多肽连接至编码免疫球蛋白Fc区的氨 基 酸序列。特异性结合并拮抗HGF或c-met的肽体在本发明的方法中也是有用的。c-met 拮抗剂包括小分子，诸如 US 5,792,783 ； US 5,834,504 ； US5,880,141 ； US 6,297,238 ； US 6,599,902 ； US 6,790,852 ； US 2003/0125370 ； US 2004/0242603 ； US 2004/0198750 ； US 2004/0110758 ； US 2005/0009845 ； US 2005/0009840 ； US 2005/0245547 ； US 2005/0148574 ； US 2005/0101650 ； US 2005/0075340 ； US 2006/0009453 ； US 2006/0009493 ； WO 98/007695 ； WO 2003/000660 ； WO 2003/087026 ； WO 2003/097641 ； WO 2004/076412 ； WO 2005/004808 ； WO 2005/121125 ； WO 2005/030140 ； WO 2005/070891 ； WO 2005/080393 ； WO 2006/014325 ； WO 2006/021886 ； WO 2006/021881, WO 2007/103308 中记载的化合 物。PHA-665752是c-Met的催化活性、以及多种肿瘤细胞的生长、细胞运动、侵入和 形态的一种小分子、ATP竞争性的活性位点抑制剂(Ma et al(2005)Clin.Cancer Res. 11 2312-2319 ； Christensen et al (2003) Cancer Res.63 7345-7355)。EGFR 拮抗剂EGFR拮抗剂包括抗体，诸如称作nimotuzumab (YM Biosciences)的人源化 单克隆抗体，完全人的 ABX-EGF (panitumumab, Abgenix Inc.)以及 US6,235,883 中 记载的称作 El.1，E2.4，E2.5，E6.2，E6.4，E2.ll，E6.3 和 E7.6.3 的完全的抗体； MDX-447 (Medarex Inc)。pertuzumab (2C4)是直接结合 HER2 但干扰 HER2-EGFR 二 聚化，由此抑制EGFR信号传导的人源化抗体。结合EGFR的抗体的其它例子包括 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb 528 (ATCC CRL8509)(参见美国专利 No.4,943,533，Mendelsohn et al.)及 其变体，诸如嵌合化225 (C225或Cetuximab ； ERBUTIX )和重构人225 (H225) (参见 WO 96/40210，Imclone Systems Inc. ； IMOl 1F8，一种完全人的 EGFR 靶向抗 体(Imclone)；结合II型突变EGFR的抗体(美国专利Νο.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所记载的；及结合EGFR的人抗体，诸 如 ABX-EGF (参见 sW098/50433，Abgenix) ； EMD 55900 (Stragliotto et al.Eur.J.Cancer 32A 636-640(1996)) ； EMD7200 (matuzumab)，一种针对 EGFR 的人源化 EGFR 抗体， 其与EGF和TGF- α 二者竞争EGFR结合；及mAb 806或人源化mAb 806 (Johns et al., J.Biol.Chem.279 (29) 30375-30384(2004))。抗 EGFR 抗体可偶联细胞毒剂，如此产生 免疫偶联物(参见例如 EP659,439A2，Merck Patent GmbH)。在本发明的方法中有用的抗EGFR抗体包括任何以足够亲和力和特异性结合 EGFR且能降低 或抑制EGFR活性的抗体。所选择的抗体在正常情况下会具有足够强的对 EGFR的结合亲和力，例如抗体可以以介于IOOnM-IpM之间的Kd值结合人c_met。抗 体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申 请公开文本NO.W02005/012359中所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测 定法(例如RIA)来测定。优选地，本发明的抗c-met抗体能在靶向和干扰涉及EGFR/ EGFR配体活性的疾病或状况中用作治疗剂。还有，可以对所述抗体进行其它生物学活 性测定法，例如为了评估它作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且取决 于抗体的靶抗原和预定用途。双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异 性抗体可结合EGFR和c-met。在另一个例子中，例示性的双特异性抗体可结合同一蛋白 质(例如c-met蛋白质)的两种不同表位。或者，可以将c-met或EGFR臂与结合白细胞 上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(Fe y R)，诸如 Fc Y RI (CD64)，FcyRII (CD32)和Fc Y RIII (CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制聚焦 于表达c-met或EGFR的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位至表达EGFR或 c-met的细胞。这些抗体拥有结合EGFR或C_met的臂和结合细胞毒剂(例如皂草毒蛋 白，抗干扰素-α，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原) 的臂。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab' )2双特异性抗体)。EGFR 拮抗剂还包括小分子，诸如 US5616582，US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, W09814451, W09850038, W09909016, W09924037, W09935146, W00132651, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498中记载的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774 (CP-358774， Erlotinib, OSI Pharmaceuticals) ； PD 183805 (Cl 1033，N_[4-[(3-氯 _4_ 氟苯 基)氨基]-7-[3-(4_吗啉基)丙氧基h6-喹唑啉基|-2-丙烯酰胺，二氢盐酸 盐，PfizerInc.) ； Iressa (ZD 1839，Gefitinib, AstraZeneca) ； ZM 105180 ((6-氨 基-4- (3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca) ； ΒΙΒΧ-1382 (Ν8- (3-氯_4_氟-苯 基)-Ν2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8- 二 胺，Boehringer Ingelheim) ； PKI-166 ((R)-4_[4_[ (1-苯基乙基)氨基]-1Η_ 批咯并[2，3-d]嘧 啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1_苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶)；CL-387785 (N_[4_[ (3-溴苯基)氨基]-6_喹唑啉基]_2_ 丁炔酰胺)； EKB-569 (N-[4-[ (3-氯-4-氟苯基)氨基]-3_氰基_7_乙氧基-6-喹啉基]-4_ ( 二甲基氨基)_2_ 丁烯酰胺)；lapatinib (Tykerb，GlaxoSmithKline) ； ZD6474 (Zactima, AstraZeneca) ； CUDC-101 (Curis) ； canertinib (CI—1033) ； AEE788 (6_[4_[ (4-乙
基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N_[ (IR)-I-苯基乙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺， W02003013541, Novartis)禾Π ΡΚΙ166 (4-[4-[[ (IR)-1-苯基乙基]氨基]-7Η_ 吡咯并[2， 3-d]嘧啶-6-基]-苯酚，W09702266 Novartis)。在一个具体的实施方案中，EGFR拮抗剂具有依照US 5,757,498 (通过引用并入 本申请)的通式I:
权利要求
1.一种治疗受试者中的癌症的方法，包括对受试者施用治疗有效量的c-met拮抗剂和 EGFR拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述EGFR拮抗剂具有依照US5,757,498 (通过引用并入 本申请)的通式I:其中m 为 1，2，或3 ；每个R1独立地选自下组氢，卤素，羟基，羟基氨基，羧基，硝基，胍基，脲基， 氰基，三氟甲基和-(C1-C4亚烷基亚烷基)-W-(苯基)，其中W为单键，O，S或NH;或者每个R1独立地选自R9和C1-C4烷基，其是被氰基取代的，其中R9选自下组 R5, -OR6, -NR6R6, -C (O)R7, -NHOR5, -OC (O)R6,氰基，A 和-YR5 ； R5 为 C1-C4 烷基；R6独立地为氢或R5; R7SR5, -OR6或-NR6R6; A选自哌啶子基，吗啉代，吡 咯烷子基，4-R6-哌嗪-1-基，咪唑-1-基，4-吡啶酮-1-基，-(C1-C4亚烷基亚烷基) (CO2H),苯氧基，苯基，苯基硫基，C2-C4烯基和-(C1-C4亚烷基亚烷基)C (O)NR6R6 ； 且Y为S，SO,或SO2;其中R5，-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1-3个卤素取 代基取代的且R5，-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1或2个R9基团取代的，且其 中所述任选取代基的烷基部分任选是被卤素或R9取代的，前提是没有两个杂原子连接于 同一碳原子；或者每个R1独立地选自-NHSO2R5,邻苯二甲酰亚氨基-(C1-C4)-烷基磺酰基氨 基，苯甲酰氨基，苯磺酰基氨基，3-苯基脲基，2-氧代吡咯烷-1-基，2，5-二氧 代吡咯烷-1-基和Rltl-(C2-C4)-烷酰基氨基，其中Rltl选自卤素，-0R6，(2-(4烷酰 基氧，-C (O)R7和-NR6R6;且其中作为R1基团的所述-NHSO2R5,邻苯二甲酰亚氨 基-(C1-C4)-烷基磺酰基氨基，苯甲酰氨基，苯磺酰基氨基，3-苯基脲基，2-氧代吡咯 烷-1-基，2，5-二氧代吡咯烷-1-基和Rltl-(C2-C4)-烷酰基氨基任选是被1或2个独立 地选自卤素，C1-C4烷基，氰基，甲基磺酰基和C1-C4烷氧基的取代基取代的；或者两个R1基团与它们所连接的碳一起形成5-8元环，其包括1或2个选自0，S和 N的杂原子；R2为氢或C1-C6烷基，其任选是被1-3个独立地选自卤素，C1-Qg氧基，-NR6R6 和-SO2R5的取代基取代的；η为1或2且每个R3独立地选自氢，卤素，羟基，C1-C6烷基，-NR6R6和C1-C4烷 氧基，其中所述R3基团的烷基部分任选是被1-3个独立地选自卤素，C1-C4烷氧基，-NR6R6和-SO2R的取代基取代的；且R4为叠氮基或_(乙炔基)_R"，其中R11为氢或C1-C6烷基，所述C1-C6烷基任选是被羟基，-OR6，或-NR6R6取代的。
3.权利要求2的方法，其中所述EGFR拮抗剂为选自下组的依照式I的化合物 (6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑 啉-4-基)-[3-(3 ‘-羟基丙炔-1-基)苯基]_胺；[3-(2' _(氨基甲基)_乙炔 基)苯基]-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6_硝基喹唑 啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(4_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲 氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-2-甲基苯基)-胺；(6-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔 基苯基)_胺；(3-乙炔基苯基)-(6_甲磺酰基氨基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯 基)-(6，7-亚甲二氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔 基-6-甲基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(7_硝基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯 基)-[6-(4'-甲苯磺酰基氨基)喹唑啉-4-基h胺；(3-乙炔基苯基)-{6-[2'-苯二 酰亚氨基-乙-1'-基-磺酰基氨基]喹唑啉-4-基}"胺；(3-乙炔基苯基)-(6_胍 基喹唑啉-4-基)-胺；(7-氨基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基 苯基)-(7_甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯 基)_胺；(7-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；[6，7-双(2-甲氧基乙 氧基)喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)-胺；(3-叠氮基苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑 啉-4-基)-胺；(3-叠氮基-5-氯苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(4-叠 氮基苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基-喹唑 啉-4-基)-胺；(6-乙硫基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基-4-氟-苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-[3-(丙 炔-1'-基)-苯基]-胺；[6，7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(5-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(3-乙炔 基-4-氟-苯基)_胺；[6，7-双-(2-氯-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；[6- (2-氯-乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h (3-乙炔基-苯 基)_胺；[6，7-双-(2-乙酰氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h(3-乙炔基-苯基)-胺； 2-[4- (3-乙炔基-苯基氨基)-7- (2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基h乙醇；[6- (2-乙 酰氧基_乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基h(3-乙炔基-苯基)_胺； [7- (2-氯-乙氧基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h (3-乙炔基-苯基)_胺； [7-(2-乙酰氧基-乙氧基)-6-(2_甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙 醇；2-[4-(3_乙炔基-苯基氨基)-7-(2_甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙 醇；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇； [6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2_甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯 基)-胺；(3-乙炔基-苯基)-{6- (2-甲氧基-乙氧基)-7-[2- (4-甲基-哌嗪-1-基)-乙 氧基]-喹唑啉-4-基}-胺；(3-乙炔基-苯基)-[7-(2_甲氧基-乙氧基)-6-(2_吗 啉-4-基)-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔 基苯基)_胺；(6，7-二丁氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二异丙 氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6- (2-羟基-乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧 基)-喹唑啉-1-基]-胺；[6，7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯 基)-胺；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基h乙 醇；(6，7-二丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基-5-氟-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基-4-氟-苯基)_胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(5_乙炔基-2-甲基-苯 基)_胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-4-甲基-苯基)-胺；(6-氨基甲 基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-苯基)-胺；(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑 啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺； (6-氨基羰基甲基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基 乙基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-异丙 氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-丙氧基-喹唑 啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺； (6-氨基羰基乙基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二乙氧基喹 唑啉-1-基)_ (3-乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6- (2-羟基-乙氧基)-7- (2-甲氧 基-乙氧基)-喹唑啉-1-基h胺；[6，7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙 炔基苯基)-胺；[6，7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3_乙炔基苯基)-胺； (6，7-二甲氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基 氨基-喹唑啉-1-基)-胺；和(6-氨基-喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺。
4.权利要求2的方法，其中所述式I的EGFR拮抗剂为N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双 (2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。
5.权利要求4的方法，其中所述EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲 氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为HCl盐形式。
6.权利要求4的方法，其中所述EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6，7_(2_甲氧基乙 氧基)-4-喹唑啉胺为基本上同质的结晶多型形式，其展现的X射线粉末衍射图所具有的 特征峰如下表示大约 6.26、12.48、13.39、16.96、20.20、21.10、22.98、24.46、25.14 禾口 26.91 的 2-theta。
7.权利要求1的方法，其中所述c-met拮抗剂为抗体。
8.权利要求7的方法，其中所述抗体为单价抗体。
9.权利要求7的方法，其中所述抗体为单价且包含Fc区，其中所述Fc区包含第一和 第二多肽，其中所述第一多肽包含图7中所绘Fc序列(SEQ IDNO : 17)且所述第二多肽 包含图8中所绘序列(SEQ ID NO 18)。
10.权利要求7的方法，其中所述抗体包含(a)第一多肽，其包含具有下述序列的重 链可变域QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPS NSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO 19)，图 7 中所绘 CHl 序列(SEQ ID NO 16)和图 7 中所绘 Fc 序列(SEQIDNO: 17)；和(b)第二多肽，其包含具有下述序列的轻链可变域DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYW ASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 20)和图7中所绘CLl序列(SEQID NO 8)；和(c)第三多肽，其包含图8 中所绘Fc序歹丨J (SEQ ID NO 18)。
11.权利要求1的方法，其中所述癌症选自下组乳腺癌，结肠直肠癌，直肠癌，非 小细胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤， 卡波西氏肉瘤，类癌，头颈癌，胃癌，黑素瘤，卵巢癌，间皮瘤和多发性骨髓瘤。
12.权利要求11的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌。
13.权利要求1的方法，其中所述癌症不是EGFR拮抗剂抗性癌症。
14.权利要求1，进一步包括对受试者施用化疗剂。
15.权利要求1的方法，其中所述EGFR拮抗剂为4-(3'-氯-4'-氟苯胺基)_7_甲 氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉。
16.权利要求1的方法，其中所述EGFR拮抗剂为N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基] 苯基]-6-[5-[[[2-(甲磺酰基)乙基]氨基]甲基h2-呋喃基]-4_喹唑啉胺。
17.权利要求1的方法，其中所述EGFR拮抗剂为4-(4_溴-2-氟苯胺基)_6_甲氧 基-7-(l-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉。
全文摘要
本发明一般涉及分子生物学和生长因子调控的领域。更具体地，本发明涉及用于病理状况(诸如癌症)治疗的，包含c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的联合疗法。
文档编号A61P35/00GK102014913SQ200980116491
公开日2011年4月13日 申请日期2009年3月6日 优先权日2008年3月6日
发明者埃伦·菲尔瓦罗夫, 罗伯特·L·尧克, 马克·麦钱特 申请人:健泰科生物技术公司