专利名称：使用辐射和免疫细胞因子的癌症治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过在放射治疗后施用免疫细胞因子(immunocytokine)来治疗肿瘤和癌细胞的方法。此治疗组合可以在照射和非照射部位刺激免疫应答，其用于消除已从原发肿瘤部位扩散的癌细胞。此外，通过此疗法，可以按低于最大耐受剂量的剂量施用免疫细胞因子，优选NHS-IL2 (D20T)和NHS-IL12，这减轻了与免疫细胞因子疗法相关的副作用。
背景技术：
疾病如癌症的有效治疗需要一个或多个效应细胞类型，如天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的有力免疫应答。但是，现有的癌症治疗，例如放射治疗和化学疗法靶向快速分裂的细胞，并从而实际上破坏免疫细胞。此外，肿瘤自身的环境是免疫抑制的。为了克服目前的癌症治疗的免疫抑制效应，已进行了研究来研究与放射治疗组合施用细胞因子 IL-2。参见 Jacobs 等 Q005)，Cancer Immunol. Immunother. ,54 792-798 ；Everse 等(1997)，Int. Τ.Cancer,72 :1003-1007 ；Lam 等(1995)，Tournal of Immunotherapy, 18 (1) :28-34 ；禾口 Jiirgenliemk-SchuIz 等，(1997)，Radiation OncoloRY Investigations, 5力4_61。虽然针对某些癌症类型观察到一些应答，但在许多情况下，未完全消除肿瘤。在其他情况下，肿瘤可复发。此外，某些癌症类型显示治疗后无改善。此外， 已知IL-2产生严重的副作用，包括血管渗漏综合症(vascular leakage syndrome)，其中流体从血管渗出，引起低血压、呼吸困难和水肿。因此，需要增加全身免疫应答的刺激，同时最小化由这些治疗产生的副作用的改进。发明概述本发明涉及用于在哺乳动物中降低肿瘤或癌细胞生长的方法。该方法通过在照射肿瘤后施用免疫细胞因子增强便于降低肿瘤生长的免疫应答来降低肿瘤或癌细胞生长。实施本发明的一些方法可以减小肿瘤大小、抑制转移、抑制肿瘤再生长、抑制复发、增加平均进展时间(average time to progression)、增加平均存活时间或促进对治疗方案的部分或完全应答，该治疗方案可以包括其他治疗剂或活动，如手术。本发明还涉及用于批准施用本发明的免疫细胞因子或批准为施用本发明的免疫细胞因子付款的健康护理商业方法。本发明还涉及免疫细胞因子用途，其通过在照射肿瘤后用免疫细胞因子增强便于降低肿瘤生长的免疫应答以降低肿瘤或癌细胞生长。本发明的免疫细胞因子的一些用途可以减小肿瘤大小、抑制转移、抑制肿瘤再生长、抑制复发、增加平均进行时间、增加平均存活时间或促进对治疗方案的部分或完全应答，该治疗方案可以包括其他治疗剂或活动，如手术。在一方面，本发明涉及通过对具有已经照射过的肿瘤的哺乳动物(例如人)施用免疫细胞因子来降低肿瘤或癌细胞生长的方法。在另一方面，本发明涉及在多个位置具有癌细胞的哺乳动物中增强全身免疫应答的方法，其包括在已照射部分位置后施用免疫细胞因子。该照射在照射和非照射位置都增强免疫应答。在另一方面，本发明涉及免疫细胞因子对在具有已经照射过的肿瘤的哺乳动物 (例如人)中降低肿瘤或癌细胞生长的用途。在另一方面，本发明涉及免疫细胞因子对在多个位置具有癌细胞的哺乳动物中增强全身免疫应答的用途，其包括在已照射部分位置后使用免疫细胞因子。该照射在照射和非照射位置都增强免疫应答。在另一方面，本发明涉及健康护理方法，其包括批准对具有之前照射过的肿瘤或癌细胞的哺乳动物施用免疫细胞因子，或批准对具有之前照射过的肿瘤或癌细胞的哺乳动物施用免疫细胞因子付款。在本发明的一些实施方案中，施用的辐射(例如Y辐射)剂量是至少IGy/天、至少2Gy/天或至少3Gy/天。在某些实施方案中，施用的辐射剂量是每天l_4Gy/天、I-IOGy/ 天、l-20Gy/ 天、2-4Gy/ 天、2-lOGy/ 天、2_20Gy/ 天、3_4Gy/ 天、3-lOGy/ 天或 3_20Gy/ 天。按照本发明的方法和用途组合辐射和免疫细胞因子治疗的一个优势是可以施用更低剂量的免疫细胞因子，这降低了副作用的可能性。在本发明的一个实施方案中，按低于免疫细胞因子最大耐受剂量的剂量施用或使用免疫细胞因子剂量。在另一实施方案中，按低于最大耐受剂量的一半、低于最大耐受剂量的三分之一、低于最大耐受剂量的四分之一或低于最大耐受剂量的十分之一的剂量施用或使用免疫细胞因子。在另一实施方案中，免疫细胞因子包括可选地掺入了一个或多个突变如D20T突变的白细胞介素_2。还在另一实施方案中，免疫细胞因子包含白细胞介素-12。放射治疗的次数及放射治疗和施用免疫细胞因子之间的时间长短可根据本发明的方法或用途而改变。在一些实施方案中，在不超过14天的期间内仅在一天照射肿瘤，或在多天照射肿瘤。在某些实施方案中，该期间是6至8天、4至10天、2至12天或1至14 天。在特定实施方案中，在该期间的终点后至少2天、4天或6天施用免疫细胞因子。在另一实施方案中，在最初对肿瘤施用辐射的21天、18天、15天、12天或8天内施用免疫细胞因子。在一个实施方案中，在最初对肿瘤施用辐射后至少5天、7天、9天或12天施用免疫细胞因子。本发明的实施方案可以包括将已知的癌症疗法与本发明的方法组合。在一些实施方案中，该方法还包括手术去除至少部分肿瘤、施用其他治疗剂或照射肿瘤。本发明的其他实施方案可以包括与已知的癌症治疗组合使用免疫细胞因子。在一些实施方案中，免疫细胞因子可以用于具有之前照射过的肿瘤并已去除至少部分肿瘤的哺乳动物中，或与使用其他治疗剂组合。实施和使用本发明的一些方法可以组合上文定义的两个或多个条件。例如，在一个实施方案中，所施用的辐射是至少IGy/天(例如至少2、至少3、1-4、1-10、1-20、2-4、 2-10、2-20、3-4、3-10或3_20Gy/天)，仅对哺乳动物中的部分癌细胞位置施用。可以在最初施用辐射的21天内(例如18天内、15天内、12天内或8天内)施用或使用免疫细胞因子，或可以按低于最大耐受剂量的一半(例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的剂量施用或使用。在另一实施方案中，所施用的辐射是IGy/天(例如至少2、至少 3、1-4、1-10、1-20、2-4、2-10、2-20、3-4、3-10 或 3_20Gy/天)，并在最初施用辐射的 21 天内(例如18天内、15天内、12天内或8天内)，可选地按低于最大耐受剂量的一半(例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的剂量施用或使用免疫细胞因子。在另一实施方案中，所施用的辐射是至少IGy/天(例如至少2、至少3、1-4、1-10、1-20、2-4、2-10、 2-20、3-4、3-10或3-20Gy/天)，并按低于最大耐受剂量的一半的剂量施用或使用免疫细胞因子。在另一实施方案中，仅对哺乳动物中的部分癌细胞位置施用辐射，并在最初施用辐射的21天内(例如18天内、15天内、12天内或8天内)，可选地按低于最大耐受剂量的一半 (例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的剂量施用或使用免疫细胞因子。在另一实施方案中，仅对哺乳动物中的部分癌细胞位置施用辐射，并按低于最大耐受剂量的一半(例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的剂量施用或使用免疫细胞因子。在另一实施方案中，在最初施用辐射的21天内(例如18天内、15天内、12天内或8天内)在具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物中施用或使用免疫细胞因子，且按低于最大耐受剂量的一半(例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的剂量施用免疫细胞因子。 总结起来，本发明涉及以下实施方案通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法； 或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括按至少IGy/天、优选2Gy/天、最优选2_20Gy/天的剂量对具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子的步骤的方法。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括按至少IGy/天、优选2Gy/天的剂量对具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子的步骤的方法，其中在最初对肿瘤施用辐射的21天内，优选5-21天内施用免疫细胞因子。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括按至少IGy/天、优选2Gy/天的剂量对具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子的步骤的方法，其中在最初对肿瘤施用辐射后21天内，优选5-21天和在完成肿瘤的照射或最后的照射治疗后1-6天，优选2-5天施用免疫细胞因子。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括按至少IGy/天、优选2Gy/天的剂量对具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子的步骤的方法，其中在最初对肿瘤施用辐射后21天内，优选5-21天和在完成肿瘤的照射或最后的照射治疗后1-6天， 优选2-5天，按低于最大耐受剂量，优选低于最大耐受剂量的一半，最优选低于最大耐受剂量的三分之一或甚至十分之一的免疫细胞因子剂量，对具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子，其中最大耐受剂量定义为在患者中引起严重副作用的免疫细胞因子剂量。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括按至少IGy/天、优选2Gy/天的剂量在多个肿瘤细胞位置对具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子的步骤的方法，其中之前仅照射了部分位置，且其中在最初对肿瘤施用辐射后21天内，优选5-21天和还在完成肿瘤的照射或最后的照射治疗后1-6天，优选2-5天，按低于最大耐受剂量，优选低于最大耐受剂量的一半，最优选低于最大耐受剂量的三分之一或甚至十分之一的剂量，对具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子，其中最大耐受剂量定义为在患者中引起严重副作用的免疫细胞因子剂量。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括对具有之前在多个肿瘤细胞位置照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子的步骤的方法，其中之前仅照射了部分位置，且其中在最初对肿瘤施用辐射后21天，优选5-21天内和还在完成肿瘤的照射或最后的照射治疗后1-6天，优选2-5天施用免疫细胞因子。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括以下步骤的方法仅在一天按至少lGy、优选2Gy、最优选2_20Gy 的总剂量一次或分次照射患者中的肿瘤细胞，然后仅在结束该辐射后1-21天，优选1-6天， 更优选2-5天后的一天施用免疫细胞因子。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括以下步骤的方法仅在一天按至少lGy、优选2Gy、最优选2_20Gy的总剂量一次或分次照射患者中的肿瘤细胞，然后在几天多次施用免疫细胞因子，其中在结束该辐射后1-21天，优选1-6天，更优选2-5天后进行最初的施用，在该最初的施用后1-5天，优选1-3天进行第二次施用和可选地进行其他施用。可选地，可以进行该多次施用免疫细胞因子的其他间隔， 其中每个间隔在3-12周之间。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括以下步骤的方法在不超过14天的期间内按至少lGy、优选2Gy、最优选2-20Gy的总日剂量一次或分次照射患者中的肿瘤细胞，然后仅在一天施用免疫细胞因子，其中在最初照射肿瘤细胞后不迟于21天和在结束该多次放射治疗后1-6天，优选2-5天后进行免疫细胞因子的施用。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括以下步骤的方法在不超过14天的期间内在多天按至少lGy、优选2Gy、最优选2_20Gy的总日剂量一次或分次照射患者中的肿瘤细胞，然后在几天多次施用免疫细胞因子，其中在最初照射肿瘤细胞后不迟于21天和在结束该多次放射治疗后1-6天，优选2-5天后进行最初的免疫细胞因子施用，在该最初的施用后1-5 天，优选1-3天进行第二次施用和可选地进行其他免疫细胞因子施用。可选地，可以进行该多次施用免疫细胞因子的其他间隔，其中每个间隔在3-12周之间。通过优选降低肿瘤生长来治疗肿瘤的方法；或用于这种治疗的免疫细胞因子；或免疫细胞因子在制备用于此治疗的药物中的用途；包括以下步骤的方法(i)仅在一天按至少lGy、优选2Gy、最优选2_20Gy 的总剂量一次或分次照射患者中的肿瘤细胞，(ii)然后在结束该辐射后1-21天，优选1-6 天，更优选2-5天后，仅在一天施用免疫细胞因子，(iii)然后在步骤(ii)后1-5天，但不超过辐射步骤(i)后14天，仅在一天按至少lGy、优选2Gy、最优选2_20Gy的总剂量一次或分次进行第二照射步骤，和(iv)然后在结束该第二辐射后1-21天，优选1-6天，更优选 2-5天后，仅在一天进行第二免疫细胞因子施用。上文所列的任意方法、用途或免疫细胞因子的方法、用途或免疫细胞因子，其中免疫细胞因子剂量低于具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物的最大耐受剂量，优选低于最大耐受剂量的一半，最优选低于最大耐受剂量的三分之一或甚至十分之一，其中最大耐受剂量定义为在患者中引起严重副作用的免疫细胞因子剂量。上文所列的任意方法、用途或免疫细胞因子的对应方法，其中该免疫细胞因子的细胞因子部分是IL2、IL2(D20T)或IL12。上文所列的任意方法、用途或免疫细胞因子的对应方法，其中该免疫细胞因子是NHS-IL2(D20T)、NHS-IL2、NHS-IL12。上文所列的任意方法、用途或免疫细胞因子的对应方法，其中之前在多个肿瘤细胞位置照射了肿瘤，其中之前仅照射了部分位置。上文所列的任意方法、用途或免疫细胞因子的对应方法，其中手术去除了至少部分肿瘤。上文所列的任意方法、用途或免疫细胞因子的对应方法，其中该辐射是Y照射。在多个位置具有癌细胞的哺乳动物中增强全身免疫应答的方法，该方法包括在照射部分位置后施用免疫细胞因子的步骤，其中辐射在照射和非照射位置都增强免疫应答，且其中按上文所列的方案进行照射和免疫细胞因子施用的组合施用。附图简述
图1显示示例性给药方案，其中辐射“R”和免疫细胞因子“IC”可以各自作为由间隔1-1分开的单剂量施用。图2显示示例性给药方案，其中仅在一天施用辐射“R”，然后在多天施用免疫细胞因子“IC”。图3显示示例性给药方案，其中在超过一天施用辐射“R”，然后仅在“IC1” 一天施用免疫细胞因子“IC”。图4显示示例性给药方案，其中可以在超过一天施用辐射“R”，然后在超过一天施用免疫细胞因子“IC”。图5显示示例性给药方案，其中可以在超过一天施用辐射“R”，然后在超过一天施用免疫细胞因子“IC”，且施用免疫细胞因子的起点“IC1”可以存在于照射期的终点“R2”之
、r -刖。图6显示用化学辐射(chemoradiation)加NHS_mulL12(空心正方形)、 EMD521873(空心圆)、化学辐射单独(实心三角形)、NHS_muIL12单独(实心正方形)、 EMD521873单独(实心圆)或对照治疗⑴治疗的动物中肿瘤大小随时间的变化。图7显示用免疫细胞因子NHS-IL12与化学辐射组合(实心圆)、EMD521873与化学辐射组合(空心圆)、无治疗(X)、化学辐射单独(空心正方形)、EMD521873单独(空心菱形)或NHS-muIL12单独(空心三角形)治疗的动物中肿瘤大小随时间的变化。图8显示用化学辐射加EMD521873 (空心圆)、化学辐射单独(空心三角形)、对照治疗(X)或EMD521873单独(空心盒)治疗的动物中肿瘤大小随时间的变化。图9显示用lmg/kg EMD521873加化学辐射(实心正方形)、5mg/kg EMD521873加化学辐射(实心三角形)和15mg/kg EMD521873加化学辐射(实心圆)、lmg/kg EMD 521873 单独(空心正方形)、5mg/kgEMD521873单独(空心三角形)和15mg/kg EMD521873单独 (空心圆)、化学辐射单独(+)或载体单独(_)治疗的动物中肿瘤大小随时间的变化。发明详述本发明的方法提供用于具有一个或多个肿瘤的哺乳动物的联合治疗，其包括辐射和免疫细胞因子施用，并导致增加的免疫应答和随后肿瘤生长的降低。由于激活全身免疫应答，本发明的方法可用于治疗单个肿瘤、多个肿瘤(包括非照射肿瘤)或转移灶 (metastase)。放射治疗后，可以按低于最大耐受剂量的剂量施用免疫细胞因子，这是有利的，因为使用更低剂量的免疫细胞因子可以导致更少的副作用。放射治疗根据本发明的方法，可以将辐射与免疫细胞因子组合施用来治疗癌症。放射治疗通常使用高能离子束或波，如X射线和Y射线，通过在细胞的DNA中诱导突变来消除癌细胞。癌细胞比正常细胞更快地分裂，使得肿瘤组织比正常组织对辐射敏感。只要病人耐受辐射剂量而无显著的副作用，可以对病人施用任何类型的辐射。适宜的放射治疗的类型包括， 例如电离辐射(例如X射线、Y射线或高线性能辐射)。电离辐射定义为包含具有足够的能量来产生电离，即得到或失去电子的粒子或光子的辐射(如例如美国专利号5，770，581 中所述)。临床医生至少可以部分控制辐射的作用。优选将辐射剂量分次来获得最大的靶细胞暴露和降低的毒性。辐射可以与增强肿瘤细胞杀伤的辐射敏化剂，或与保护健康组织免受辐射的有害作用的辐射防护剂(例如L-I或IL-6)同时施用。类似地，应用热(即体温过高(hyperthermia))或化学疗法可以使组织对辐射敏感。
辐射源可以在患者外部或内部。外部放射治疗是最常见的，通常涉及用例如线性加速器将高能辐射束(粒子束)经皮肤导向肿瘤部位。虽然将辐射束定位至肿瘤部位，但几乎不可能避免正常健康组织的暴露。但是，患者通常很好地耐受外部辐射。在另一实例中，用Y射线从外部向患者提供辐射。Y射线是放射性同位素如钴60 衰变产生的。使用称为“Gamma Knife ”的治疗，可以仅将、射线紧密集中于肿瘤组织， 使得损伤非常少的健康组织。另一方面，可以用由粒子加速器产生X射线来在身体的更大区域内施用辐射。内部放射治疗涉及将辐射发射源，如小球、线、片、胶囊等在肿瘤部位或其附近处植入体内。所使用的辐射来自放射性同位素，例如但不限于碘、锶、磷、钯、铯、铱、磷酸盐或钴。这类植入物可以在治疗后去除，或无活性地保留在体内。内部放射治疗的类型包括但不限于近距离放射治疗(brachytherapy)、间质照射和腔内照射。目前较不常见的内部放射治疗的形式涉及放射性同位素的生物学载体，如放射免疫治疗，其中对患者施用与放射性材料结合的肿瘤特异性抗体。该抗体结合肿瘤抗原，从而有效地对相关组织施用辐射剂量。将放射治疗用作控制原发肿瘤生长的方案的组件(参见例如Comphausen等 (2001) “Radiation Therapy to a Primary Tumor Accelerates Metastatic Growth in Mice,，，Cancer Res. 61 :2207-2211)。虽然放射治疗单独对破坏或预防转移灶的效果可以较差，但将辐射与本文所述的免疫细胞因子组合可以增强放射治疗的局部和全身功效。根据本发明的方法，可以在具有多个肿瘤或癌细胞的哺乳动物中对部分肿瘤或部分癌细胞施用辐射。在一个实施方案中，该部分肿瘤是一个肿瘤。在已照射了部分位置后，施用免疫细胞因子。与免疫细胞因子施用单独相比，照射在照射和非照射部位增强了免疫应答。因此， 本发明的方法在治疗癌细胞已在体内从一个或多个肿瘤扩散至其他位置的哺乳动物中可以是有效的。由于辐射杀伤免疫效应细胞，辐射的剂量和时间选择很重要。照射过的肿瘤中T 细胞和树突细胞在照射后立即减少；但是，T细胞水平反弹至高于基线水平。不论施用方法，可以在一天的过程中施用完整的辐射剂量。优选地，将总剂量分次，并在几天内施用。因此，日辐射剂量可包含约3-20Gy/天，例如至少2、至少3、1-4、1-10、1-20、2-4、2-10、2_20、 3-4、3-10、3-20Gy/天。日剂量可以作为单剂量施用，或可以是在一天的过程内以两部分或多部分施用的“微分次(microfractionated) ”剂量。在使用内部辐射源，例如近距离放射治疗或放射免疫治疗时，通常将增加暴露时间，同时相应地降低辐射强度。如本文所使用，“最初施用辐射”可以是单剂量，或者是在几天内展开的一系列照射的开始。虽然哺乳动物可以已在之前接受了一个或多个过程的放射治疗，但“最初的施用”与任何之前的辐射过程在时间上是分开的。例如，若哺乳动物在星期一、星期二和星期三接受辐射，则星期二的辐射将不是“最初的施用”。类似地，若哺乳动物在每个星期一、星期三和星期五接受辐射三周，则第一个星期一可以是“最初的施用”，但第二和第三个星期一不是。一般而言，最初施用辐射之前7天或多天不接受辐射(例如不接受治疗性辐射剂量，如至少IGy的剂量)。如本文所使用，照射“期间，，具有一个最初施用辐射，然后在其他一天或多天施用辐射。例如，可以在连续日(例如星期一、星期二、星期三)、隔日(例如星期一、星期三、星期五)等，或每周2或3或4或5或6次施用辐射。给定的辐射期间将不包含任何7个连续的无辐射日。相反，中断7天后重新开始规律施用辐射一般将标记新的“期间”的开始。 免疫细胞因子如本文所使用，术语“免疫细胞因子”理解为意指(i)具有针对预先选择的抗原， 例如细胞类型特异性抗原的结合特异性，并能够与之结合的抗体结合结构域，和(ii)能够诱导或刺激通常针对癌细胞的杀细胞免疫应答的细胞因子的融合。预先选择的抗原的实例包括如在癌细胞上的细胞表面抗原，和与细胞直接结合或不结合的作为肿瘤微环境特征的其他抗原，如可以分泌或以别的方式释放或沉积在肿瘤附近的抗原；在肿瘤附近与细胞外膜结合的抗原；或结合与肿瘤接触和/或浸润肿瘤的非恶性细胞的抗原。优选的抗原是作为肿瘤细胞特征的靶抗原，如肿瘤特异性抗原。因此，免疫细胞因子能够选择性地递送细胞因子至体内靶标(其通常是细胞)，使得细胞因子可以介导针对靶细胞的局部免疫应答。例如，若免疫细胞因子的抗体成分选择性结合癌细胞，如实体瘤，尤其是大于约100mm3的更大的实体瘤中的癌细胞上的抗原，则免疫细胞因子发挥局部抗癌活性。如本文所使用，术语“抗体结合结构域”理解为意指至少部分免疫球蛋白重链，例如，能够结合预先选择的抗原如细胞类型的免疫球蛋白可变区。抗体结合结构域还优选包含至少部分免疫球蛋白恒定区，其包含例如CHl结构域、CH2结构域和CH3结构域，或至少 CH3结构域，或其一个或多个部分。此外，免疫球蛋白重链还可以共价或非共价结合免疫球蛋白轻链，该免疫球蛋白轻链包含例如免疫球蛋白轻链可变区和可选地包含轻链恒定区。 因此，考虑抗体结合结构域可以包含能够结合预先选择的抗原的完整抗体或其片段，或单链抗体。对于免疫细胞因子，考虑可通过本领域普通技术人员公知的多种方式将抗体片段与细胞因子连接。例如，在融合蛋白质构建体中，优选通过多肽键或接头将抗体结合部位连接至细胞因子。备选地，可以通过抗体结合部位和细胞因子内存在的氨基酸侧链内的反应基，例如巯基来将抗体结合部位与细胞因子化学偶联。如本文所使用，术语“细胞因子”理解为意指能够在哺乳动物中刺激或诱导针对预先选择的细胞类型，例如癌细胞或病毒感染的细胞的杀细胞免疫应答的任何蛋白质或肽，其类似物或功能性片段。因此，考虑可将多种细胞因子掺入本发明的免疫细胞因子。 可以掺入本发明的免疫细胞因子的细胞因子包括，例如肿瘤坏死因子、白细胞介素、集落刺激因子和淋巴因子，以及本领域已知的其他细胞因子。优选的肿瘤坏死因子包括，例如肿瘤坏死因子α (TNFa)0优选的白细胞介素包括，例如白细胞介素_2 (IL_2)、白细胞介素-4 (IL-4)、白细胞介素-5 (IL-5)、白细胞介素_7 (IL-7)、白细胞介素-12 (IL-12)、白细胞介素-15 (IL-15)和白细胞介素-18 (IL-18)。优选的集落刺激因子包括，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。优选的淋巴因子包括，例如淋巴毒素(LT)。其他有用的细胞因子包括干扰素，其包含IFN-a、IFN-β和IFN-γ，它们均具有独立于其抗病毒活性的免疫学作用，以及抗血管发生作用。还可以使用改变形式的细胞因子。如美国专利号7，186，804中所述，例如，免疫细胞因子的细胞因子部分中的突变可以赋予免疫细胞因子改进的特性，如IL-2的D20T突变，相对于野生型IL-2，该突变提高了改变的IL-2对其高亲和力受体的选择性，从而降低了其毒性。可以从头克隆、从可用来源获得或通过标准DNA合成从已知的核苷酸序列合成编码特定目的细胞因子的基因。例如，LT的DNA序列是已知的(参见例如Nedwin等(1985)Nucleic Acids Res. 13 :6361)，IL-2 (参见例如 Taniguchi 等(1983)Nature 302 305-318)、GM-CSF (参见例如 Gasson 等(1984) Science 266 :1339-1342)和 TNF α (参见例如 Nedwin 等(1985)Nucleic Acids Res. 13 :6361)的序列也是已知的。在优选实施方案中，免疫细胞因子是通过常规重组DNA方法，即通过形成编码嵌合免疫细胞因子的核酸构建体产生的重组融合蛋白质。现有技术中已描述了重组抗体-细胞因子融合蛋白质的构建。参见例如Gillies等(1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89: 1428-1432 ；Gillies ^ (1998)1. Immunol. 160 :6195-6203 :和美国专利号 5, 650, 150。优选地，编码本发明的免疫细胞因子的基因构建体以5'至3'的取向包含编码免疫球蛋白重链可变区结构域的DNA区段、编码免疫球蛋白重链恒定区的DNA区段和编码细胞因子的 DNA。将融合基因组装入或插入表达载体，该载体用于转染入适当的受体细胞，融合基因在该受体细胞中表达。优选将杂合多肽链与免疫球蛋白轻链组合，使得免疫球蛋白重链可变区(Vh)和免疫球蛋白轻链可变区组合产生单一且完整的用于结合预先选择的抗原的部位。在优选实施方案中，例如利用链间二硫键共价偶联免疫球蛋白重链和轻链。此外，可以例如利用一个或多个链间二硫键共价偶联其中之一或二者都与细胞因子融合的两条免疫球蛋白重链。因此，本发明的方法用于增强治疗肿瘤的治疗性方法中所使用的免疫细胞因子的抗肿瘤活性，该免疫细胞因子包含W099/29732、W099/43713、W099/52562、W099/53958和 W001/10912中公开的免疫细胞因子组合物和方法，以及在连接区中具有改变的氨基酸序列的基于抗体的融合蛋白质。由于其结构的两个方面，可以认为本发明的免疫细胞因子是嵌合的。首先，免疫细胞因子是嵌合的是因为它包含与给定的细胞因子连接的具有抗原结合特异性的免疫球蛋白重链。其次，从它包含免疫球蛋白可变区(V)和免疫球蛋白恒定区(C) (二者都衍生自不同抗体，使得产生的蛋白质是ν/c嵌合体)的意义上说，本发明的免疫细胞因子可以是嵌合的。例如，可变区和恒定区可以衍生自可从不同物种分离的天然存在的抗体分子。参见例如美国专利号4，816，567。还包含这样的构建体，其中免疫球蛋白可变区之一或二者都包含衍生自不同物种的构架区(FR)序列和互补决定区(CDR)序列。这类构建体公开于例如 Jones 等(1986)Nature 321 :522-525 ；Verhoyen 等(1988) Science 239 :1534-1535 ；和美国专利号5，225，539和5，585，089中。此外，考虑可以通过针对以所希望的亲和力结合预先选择的抗原的可变区序列筛选文库，例如噬菌体展示文库来衍生可变区序列。用于产生和筛选噬菌体展示文库的方法公开于例如Huse等(1989) Science 246 1275-1281和Kang 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :11120-11123 中。免疫细胞因子的免疫球蛋白重链恒定区结构域可以选自称为IgAdga )、 IgD(IgS), IgE(Ige), IgG(Igy)和IgM(Igy)的五个免疫球蛋白种类的任一种。但是，优选来自IgG种类的免疫球蛋白重链恒定区。此外，考虑免疫球蛋白重链可以衍生自在本领域中称为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的IgG抗体亚类的任一种。如已知，每个免疫球蛋白重链恒定区包含四个或五个结构域。将这些结构域依次命名如下CH1-铰合部-CH2-CH3-(-CH4)。CH4存在于无铰链区的IgM中。重链结构域的DNA序列在免疫球蛋白种类中具有残余同源，例如IgG的CH2结构域与IgA和IgD的CH2结构域及IgM和IgE的CH3 结构域同源。免疫球蛋白轻链可以具有κ或λ恒定区。这些免疫球蛋白区域的序列和序列比对为本领域公知(参见例如Kabat等，〃 Sequences of Proteins of Immunological Interest, " U. S. Department of Health and Human Services,第三版 1983,第四版 1987 ; 和 Huck 等(1986)Nuc. Acids Res. 14 1779-1789)。在优选实施方案中，可变区衍生自对预先选择的细胞表面抗原(与患病的细胞如癌细胞或病毒感染的细胞结合的抗原)特异的抗体，恒定区包含源自与作为可变区来源的抗体相同或不同的抗体的CHI、CH2和CH3结构域。在本发明的实施中，优选免疫细胞因子的抗体部分在预期的受体中是无免疫原性的或弱免疫原性的。因此，优选抗体部分尽可能多地衍生自与预期的受体相同的物种。例如，若要对人施用免疫细胞因子，则优选恒定区结构域来源于人。参见例如美国专利号4，816，567。此外，在免疫球蛋白可变区衍生自预期的受体以外的物种时，例如，在可变区序列来源于鼠类，而预期的受体是人时，则优选可变区序列包含人FR序列，将鼠CDR序列插入FR序列之间，以产生具有针对预先选择的抗原的结合特异性的嵌合可变区，但同时最小化在预期的宿主中的免疫反应性。这类嵌合可变区的设计和合成公开于 Jones 等(1986) Nature 321 :522-525 ；Verhoyen 等(1988) Science 239 :1534-1535 ；和美国专利号 5，225，539 和 5，585，089 中。已在 Gillies 等(1998) T. Immunol. 160 :6195-6203中描述了人源化抗体-细胞因子融合蛋白质KS-1/4抗-EpCAM 抗体-IL-12融合蛋白质的克隆和表达，及其消除已建立的结肠癌转移灶的能力。直接或利用接头，例如利用编码(Gly4-kr) 3接头的DNA将编码细胞因子的基因符合读框地与编码免疫球蛋白恒定区的基因(例如CH2或CH3外显子)的3'端连接。在某些实施方案中，接头可以包含编码蛋白酶剪切位点的核苷酸序列。在插入免疫球蛋白恒定区和细胞因子之间时，可以设计此位点来在靶部位提供细胞因子的蛋白酶解释放。例如， 纤溶酶和胰蛋白酶在蛋白酶可及的位点处在赖氨酸和精氨酸残基后切割是公知的。许多其他位点特异性内切蛋白酶和它们切割的氨基酸序列为本领域公知。优选的蛋白酶剪切位点和与这类切割位点反应的蛋白酶解酶公开于美国专利号5，541, 087和5，726，044中。核酸构建体可以可选地包含用于可变区编码基因的内源性启动子和增强子，来调节嵌合免疫球蛋白链的表达。例如，可以作为包含前导肽、用于轻链的VJ基因(具有连接 (J)区段的功能上重排的可变(V)区)或用于重链的VDJ基因和用于这些基因的内源性启动子和增强子的DNA片段获得可变区编码基因。备选地，可以获得除内源性调节元件之外的编码可变区的基因，并用于提供了这些元件的表达载体中。可以通过标准DNA克隆方法从产生所希望的抗体的细胞获得可变区基因。可以用适当的DNA探针，如包含J区DNA序列和下游序列的DNA区段来实现针对具体的功能上重排的可变区的基因组文库筛选。通过测序所克隆的基因并将序列与对应的正确剪接的mRNA 的全长序列比较来达到正确克隆的鉴定和确认。靶抗原可以是肿瘤细胞、癌细胞或其他赘生性细胞的细胞表面抗原。一般可以从产生免疫球蛋白的淋巴样细胞系获得编码适当的可变区的基因。例如，可以通过本领域公知的标准体细胞杂交技术来制备产生对肿瘤结合的抗原或病毒抗原特异的免疫球蛋白的杂交瘤细胞系(参见例如美国专利号4，196，沈5)。这些产生免疫球蛋白的细胞系以功能上重排的形式提供了可变区基因的来源。备选地，可以通过针对以所希望的亲和力结合预先选择的抗原的可变区序列筛选文库，例如噬菌体展示文库来衍生可变区序列。用于产生和筛选噬菌体展示文库的方法公开于例如Huse等(1989) Science 246 :1275-1281和Kang等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :11120-11123 中。将编码在功能上具有活性的可变区基因的DNA片段与包含编码所希望的恒定区 (或其部分)的基因的DNA片段连接。可以通过标准基因克隆技术从产生抗体的细胞获得免疫球蛋白恒定区(重链和轻链)。已克隆了两类人轻链(κ和λ)和五类人重链(α、δ、 ε、Y和μ)的基因，因此可以容易地从这些克隆获得人来源的恒定区。将编码杂合免疫球蛋白重链的融合基因组装入或插入用于掺入受体细胞的表达载体中。可以通过标准基因剪接方法来实现将基因构建体引入质粒载体中。可以将嵌合免疫球蛋白重链与对应的免疫球蛋白轻链在同一细胞中共表达，使得可以同时表达和组装完整的免疫球蛋白。为了此目的，可以将重链和轻链构建体置于同一载体或分开的载体中。受体细胞系一般是淋巴样细胞。优选的受体细胞是骨髓瘤(或杂交瘤)。骨髓瘤可以合成、组装和分泌由所转染的基因编码的免疫球蛋白，且它们可以糖基化蛋白质。示例性受体或宿主细胞包括正常情况下不产生内源性免疫球蛋白的Sp2/0骨髓瘤和小鼠骨髓瘤NS/0细胞。在转染时，细胞仅产生由所转染的基因构建体编码的免疫球蛋白。转染的骨髓瘤可以在培养物中或小鼠腹膜中，其中可以从腹水回收所分泌的免疫细胞因子。可以将其他淋巴样细胞如B淋巴细胞用作受体细胞。也可以使用非淋巴样受体细胞，如中国仓鼠卵巢细胞。存在几种用包含编码嵌合免疫球蛋白链的核酸构建体的载体转染淋巴样细胞的方法。例如，可以通过球芽融合来将载体引入淋巴样细胞(参见例如Gillies等(1989) Biotechnol. 7 =798-804)。其他有用的方法包括电穿孔或磷酸钙沉淀(参见例如Sambrook 等编辑(1989) “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual, " Cold Spring Harbor Press)0其他有用的产生免疫细胞因子的方法包括编码构建体的RNA序列的制备及其在适当的体内或体外表达系统中的翻译。考虑用于合成编码抗体-细胞因子融合蛋白质的基因、用于将基因引入宿主细胞、用于在宿主中表达基因和用于收获产生的融合蛋白质的重组DNA方法是本领域公知和充分记载的。具体流程描述于例如Sambroo等编辑 (1989)" Molecular Cloning :A Laboratory Manual， “ Cold Spring Harbor Press 中。应理解，可以用本领域技术人员公知的多种方法来产生化学偶联的免疫细胞因子。例如，可以用抗体或抗体片段和细胞因子中的化学反应性氨基酸侧链来将抗体或抗体片段与细胞因子化学偶联。可以例如通过二硫键或利用同双功能或异双功能交联剂来共价连接氨基酸侧链，该交联剂包括例如3 (-2-吡啶基硫基(pyridyylditio))丙酸_N_琥珀酰亚胺、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酸酯、π7-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯和1，4_ 二-[3' (2'-吡啶基硫基)丙酰胺基]丁烷，它们均可从 Pierce, Rockford, 111 商业购得。可以通过任意适宜的手段，直接(例如局部，如通过注射、植入或局部施用于组织位置)或全身地(例如肠胃外或口服)向哺乳动物提供本发明的方法中使用的组合物。在要经肠胃外，如通过静脉内、皮下、眼、腹膜内、肌内、口腔、直肠、阴道、眼眶内、脑内、颅内、 脊髓内、心室内、鞘内、池内(intracistemal)、囊内、鼻内或通过气溶胶施用来提供组合物时，优选组合物包含部分水性或生理上相容的流体悬液或溶液。可以由本领域技术人员识别和/或常规开发制剂。
每次施用的免疫细胞因子剂量优选低于最大耐受剂量。例如，可以按低于最大耐受剂量的一半、低于最大耐受剂量的三分之一、低于最大耐受剂量的四分之一或低于最大耐受剂量的十分之一的剂量施用免疫细胞因子。最大耐受剂量(MTD)是可以在可接受的毒性水平下施用物质的最高剂量。虽然处于可接受的毒性水平，但是按最大耐受剂量施用的物质仍然可以产生不希望的副作用。免疫细胞因子产生的副作用的严重性比细胞因子单独产生的副作用低。但是，已报道了使用多种免疫细胞因子的不希望的副作用，包括发烧、恶心、血管渗漏和低血压。本发明的方法允许按低于最大耐受剂量的剂量有效使用免疫细胞因子，这具有产生更少的副作用的优势。虽然要施用的剂量将根据所使用的免疫细胞因子和其他临床参数而改变，但在某些实施方案中，免疫细胞因子的剂量在0.01mg/kg 和 20mg/kg 之间，例如至少 0. 03-15mg/kg、0. 03_6mg/kg、0· 03-1. 5mg/kg、0. 03-0. 6mg/kg、 0. 5_20mg/kg、0. 5_15mg/kg、0. 5_10mg/kg、0. 5_6mg/kg、0. 5_5mg/kg 或 0. 5-1. 5mg/kg。所施用的免疫细胞因子剂量可以在整个治疗过程中改变。例如，可以按较低的剂量更频繁地施用细胞因子许多天、许多周或许多个月，然后按较高的剂量较不频繁地施用许多天、许多周或许多个月。例如，可以每周三天施用约0. 0375-0. 6mg/kg的剂量连续三周，然后在随后三周每周一天施用增加至约0. 0375-1. 5mg/kg的剂量。可以通过定期的快速浓注或通过从外部储器(例如从静脉内袋子(intravenous bag))或内部(例如从生物可蚀解的植入物)的连续静脉内或腹膜内施用来施用免疫细胞因子。但是，考虑可以通过完全处于本领域技术水平内的常规实验来确定免疫细胞因子和辐射的最佳组合、施用模式和剂量。辐射可以杀伤免疫效应细胞。例如，照射过的肿瘤中T细胞和树突细胞在照射后立即减少。但是，随后T细胞水平反弹至高于基线水平。因此，和与放射治疗的时间选择有关的免疫细胞因子剂量给药方案很重要。优选这样安排给药，使得免疫效应细胞在放射治疗后的反弹与施用免疫细胞因子的免疫刺激作用一致。在一个实施方案中，在放射治疗期间施用免疫细胞因子。在优选实施方案中，在放射治疗后施用免疫细胞因子。在放射治疗期间或优选在放射治疗后施用免疫细胞因子产生协同抗肿瘤作用。在放射治疗前施用免疫细胞因子不能产生在放射治疗后施用免疫细胞因子时所观察到协同抗肿瘤作用。类似地，起始免疫细胞因子施用后将放射治疗延长超过五天可降低在免疫细胞因子的施用发生于放射治疗结束后时所观察到的协同作用。不希望受理论束缚，在免疫细胞因子施用后，或在一些情况下，在免疫细胞因子施用期间提供放射治疗时，辐射最初的免疫抑制作用可以钝化免疫细胞因子施用的免疫刺激作用。另一方面，免疫细胞因子施用不应发生在放射治疗后太远，以致减小协同作用。如图1中所示的示例性给药方案中所示，辐射和免疫细胞因子可以各自作为单剂量施用。参考图1，在“R1”天作为单剂量施用辐射“R”。间隔1_1(其可以以小时或天量度)之后，在“IC1”天作为单剂量施用免疫细胞因子“IC”。优选地，施用辐射和免疫细胞因子之间的间隔(间隔1-1)在0至21天之间。例如，该间隔(间隔1-1)可以是1至21天， 或2至21天，或2至14天等。此后，可以按适宜的间隔，例如每2周、每3周、每4周、每5 周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周等施用单剂量的免疫细胞因子。示例性给药方案可以如下。在第1天施用单剂量的辐射，并在第4天开始免疫细胞因子治疗周期，其中按3周的间隔施用作为单剂量的免疫细胞因子。适宜数目的治疗周期，例如5至10个治疗周期后，将给药间隔增加至例如至多12周的间隔。在另一实施方案中，如图2中所示，仅在一天施用辐射，然后在多天施用免疫细胞因子。参考图2，在“R1”天作为单剂量施用辐射“R”。间隔2-1(其可以以小时或天量度) 之后，在“IC1”天开始施用免疫细胞因子“IC”。可以每天、隔天、每三天、每两周、每周、连续地或按任意其他适宜的时间表施用免疫细胞因子，直至施用在“IC2”天终止。例如，可以在连续2天、连续3天、连续4天等每天施用免疫细胞因子一次。优选地，施用辐射和开始施用免疫细胞因子之间的间隔(间隔2-1)是0至21天(例如1至21天之间、2至21天之间、2至14天之间等)。此后，可以按适宜的间隔，例如每2周、每3周、每4周、每5周、每6 周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周等施用免疫细胞因子。示例性给药方案可以如下在第1天施用单剂量的辐射，并在第4天开始免疫细胞因子治疗周期，其中按3周的间隔在连续3天每天施用免疫细胞因子一次。适宜数目的治疗周期，例如5至10 个治疗周期后，将给药间隔增加至例如至多12周的间隔。还在另一实施方案中，如图3中所示，在多天施用辐射“R”，然后仅在“IC1”一天施用免疫细胞因子“IC”。优选在不超过14天(例如4-10天)的期间(间隔3-1)内施用辐射。可以每天、隔天、每三天、连续地或按任意其他适宜的时间表施用辐射，直至施用在“R2” 天终止。例如，可以在连续3天、在连续4天、在连续5天等施用辐射。免疫细胞因子的施用可以发生在放射治疗的起点“R1”后至少5天(间隔3-2)，例如5天后，6天后等。放射治疗的终点“R2”和免疫细胞因子的施用之间的间隔(间隔3-3)可以是0天或多天，例如 1天、2天等。优选地，放射治疗的终点“R2”和免疫细胞因子的施用“IC1”之间的间隔(间隔3-3)是至少2天，例如2天、3天等。此后，可以按适宜的间隔，例如每2周、每3周、每4 周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周等施用单剂量的免疫细胞因子。示例性给药方案可以如下。在第-7至-3天连续5天(第-7、-6、-5、-4和-3 天)施用分次剂量的辐射，并在第1天(3天后)开始免疫细胞因子治疗周期，其中按3周的间隔作为单剂量施用免疫细胞因子。适宜数目的治疗周期，例如5至10个治疗周期后， 将给药间隔增加至例如至多12周的间隔。在另一实施方案中，如图4中所示，可以在超过一天施用辐射“R”，然后在超过一天施用免疫细胞因子“IC”。优选地，在不超过14天(例如4-10天)的期间(间隔4-1)内施用辐射。可以每天、隔天、每三天、连续地或按任意其他适宜的时间表施用辐射，直至施用在“R2”天终止。例如，可以在连续3天、在连续4天、在连续5天等施用辐射。施用免疫细胞因子的起点可以存在于放射治疗的起点后至少5天(间隔4-2)，例如5天后，6天后等。 施用免疫细胞因子的起点可以存在于放射治疗的终点后至少1天(间隔4-3)。优选地，放射治疗的终点“R2”和施用免疫细胞因子的起点“IC1”之间的间隔(间隔4-3)是至少2天， 例如2天、3天等。可以每天、隔天、每三天、每两周、每周、连续地或按任意其他适宜的时间表施用免疫细胞因子，直至施用在“IC2”天终止。例如，可以在连续2天、连续3天、连续4 天等每天施用免疫细胞因子一次。此后，可以按适宜的间隔，例如每2周、每3周、每4周、 每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周等施用免疫细胞因子。 示例性给药方案可以如下在第-7至-3天连续5天施用分次剂量的辐射，并在第1天开始免疫细胞因子治疗周期，其中按3周的间隔在连续3天每天施用免疫细胞因子一次。适宜数目的治疗周期，例如5至10个治疗周期后，将给药间隔增加至例如至多12周的间隔。
在另一实施方案中，如图5中所示，可以在超过一天施用辐射“R”，然后在超过一天施用免疫细胞因子“IC”。可以每天、隔天、每三天、连续地或按任意其他适宜的时间表施用辐射，直至施用在R2天终止。优选施用辐射的起点“R1”和施用免疫细胞因子的起点 “IC1”之间的间隔(间隔5-1)不超过14天(例如4-10天)。免疫细胞因子施用的起点 “IC1”可以存在于辐射施用期间的终点“R2”之前。可以每天、隔天、每三天、每两周、每周、 连续地或按任意其他适宜的时间表施用免疫细胞因子，直至施用在IC2天终止。虽然这些实施方案描述了包括在辐射后施用免疫细胞因子的过程的单次治疗，但构想可以根据需要重复此治疗。例如，在第二轮治疗中，可以对相同或不同的肿瘤部位施用辐射和/或随后可以施用该免疫细胞因子或不同的免疫细胞因子。与其他治疗的组合可以将发明的方法与其他治疗剂或方法组合进行，以在患者中达到所希望的生物效应。在一个实施方案中，在手术切除肿瘤之前、期间或之后施用药物组合物。完全手术去除肿瘤组织通常并发肿瘤组织侵入周围组织和不确定的团块边界。如本文所述，用发明的方法治疗肿瘤导致肿瘤缩小，这将便于切除。此外，本发明的方法的手术后表现可以消除残留的肿瘤细胞。与手术切除一样，化学疗法是用于大多数癌症类型的标准治疗。因此，本发明的方法可以与基于化学药品的疗法平行、在其之前或在其之后进行。常见的化疗药物包括但不限于阿霉素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺钼、卡钼、卡莫司汀、希罗达、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右丙亚胺(dexrazoxane)、多西他赛、羟基红比霉素、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、盐酸吉西他滨、羟基脲、脱甲氧柔红霉素、异环磷酰胺、伊立替康、罗氮芥、盐酸氮芥、巯嘌呤、meplhalan,甲氨喋呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽酮、亚硝基脲、紫杉醇(paclitaxel)、氨羟二磷酸二钠、喷司他丁、普卡霉素、普鲁苄胼、链脲菌素、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、噻替哌、长春花碱、长春新碱、长春烯碱、紫杉醇(taxol)、反钼、5-氟尿嘧啶等。发明的方法可以伴随操作体内激素水平来治疗疾病的激素疗法进行。体内激素水平以某种方式影响许多癌症，这样，与激素疗法相关的典型治疗，例如三苯氧胺发挥作用来降低循环激素水平和/或阻止激素与激素受体结合。可以将发明的方法与单克隆抗体，例如贝伐单抗(Avastin)、西妥昔单抗 (Erbitux)、吉妥珠单抗(Mylotarg)、替伊莫单抗(Zevalin)、马妥珠单抗和利妥昔单抗 (Rituxin)的施用组合进行。单克隆抗体通过多种机制发挥作用。例如，单克隆抗体可以与特异性肿瘤蛋白质结合，并吸引免疫细胞至肿瘤部位。一些单克隆抗体通过阻断否则将允许肿瘤生长和扩散的生长信号来发挥作用。其他单克隆抗体与放射性粒子或化疗药物结合，并特异性地将辐射或药物递送至肿瘤细胞。靶组织待用本发明的方法治疗的肿瘤和癌细胞的类型包括实体瘤的所有类型，如与以下癌症类型相关的实体瘤肺、头和劲鳞状细胞癌(SCCHN)、胰腺、结肠、直肠、食管、前列腺、 乳腺、卵巢癌、肾癌、淋巴瘤和黑素瘤。肿瘤可以与口腔和咽、消化系统、呼吸系统、骨骼和关节(例如骨转移)、软组织、皮肤(例如黑素瘤)、乳腺、生殖系统、泌尿系统、眼和眼眶、脑和神经系统(例如神经胶质瘤)或内分泌系统(例如甲状腺)的癌症相关(即定位于其中)， 且不必是原发肿瘤。与口腔相关的组织包括但不限于舌和口组织。癌症可以出现在包括例如食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊和胰腺的消化系统组织中。呼吸系统的癌症可以影响喉、肺和支气管，且包括例如非小细胞肺癌。肿瘤可以出现在构成雄性和雌性生殖系统的子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸和阴茎中，以及组成泌尿系统的膀胱、 肾、肾盂和输尿管中肿瘤可以处于任何阶段，且可以进行其他治疗。本发明的方法用于治疗已证明对其他形式的癌症疗法具有抗性的肿瘤(即破坏肿瘤细胞或减小肿瘤大小)。肿瘤还可以是任意大小的。理想地，在针对癌症治疗病人中，本发明的方法导致肿瘤生长速率降低、癌性 (肿瘤)细胞死亡和/或肿瘤大小减小。应理解，由于例如支持细胞、血管形成、纤维基质等的存在，在肿瘤大小无实质性减小的情况下可以发生肿瘤细胞死亡。因此，虽然优选减小肿瘤大小，但它不是癌症治疗中必需的。优选地，本发明的方法将肿瘤的大小减小至少约5% (例如至少约10%、15%、 20%或25% )。更优选地，肿瘤大小减小约30% (例如至少约35%,40%,45%,50%,55%, 60%或65%)。甚至更优选地，肿瘤大小减小至少约70% (例如至少约75%、80%、85%、 90%或95%)。最优选地，肿瘤彻底消除。但是，如本文所讨论，虽然优选减小肿瘤大小，但其不是必需的。全部所需是降低肿瘤的生长速率。例如，肿瘤可以放慢其生长速率、完全停止生长、缩小或完全消除。肿瘤生长速率的任何降低都足以实现疗效。功效的评估可以以几种方式测量本发明的方法的功效。例如，可以用肿瘤大小、复发、存活和免疫应答的起始的测量结果(例如用基因、蛋白质组或细胞谱分析)来测定治疗功效。可以在治疗前、治疗期间和治疗后进行测量来检测本发明的方法的效力。可以在患者的整个治疗过程中监测该方法的效力。备选地，本领域技术人员可以用下文实施例部分中所述的动物模型或其他适宜的动物模型来测试免疫细胞因子与辐射及可选地与其他癌症治疗的哪种组合在协同作用以增强已建立的肿瘤或癌细胞的免疫破坏中最有效。此外，由于鉴定了新的免疫细胞因子，本领域技术人员将能够用这些功效测量来评估新的免疫细胞因子增强辐射的抗癌作用的潜能。可以监测复发、存活和肿瘤大小来评价本发明的方法的功效。可以用本领域已知的统计分析来评估复发和存活。可以用本领域已知的许多成像方法来监测人患者中的肿瘤大小，这些方法包括内镜检查术、放射成像(包括X射线)、计算层析X射线照相术(CT)扫描、磁共振成像(MRI)和核成像。可以通过成像方法或通过测径器或容量测量来监测治疗对动物模型中肿瘤生长的影响。还可以通过测量是否已刺激了免疫应答来测定本发明方法的功效。可以用多种方法测量免疫应答的起始。在一个实例中，可以进行基因表达谱分析来测定本发明的方法是否已刺激了对免疫功能重要的基因。可以对肿瘤样品或其他样品，如淋巴结样品或外周血单核细胞进行表达谱分析，这些样品的表达谱可以指示全身免疫应答的存在或缺乏。可以在治疗前、治疗期间和/或治疗后从患者采集样品。在用本方法治疗之前和之后，提取来自所治疗的哺乳动物的肿瘤组织的RNA，并可以例如通过定量实时PCR来评估与免疫应答相关的基因的表达水平扩增从涉及免疫功能的基因转录的RNA来测定表达在整个治疗过程中是否提高或降低。在另一实例中，治疗后，可以对肿瘤进行活组织检查或切除，切片并通过标准的组织学方法或通过特异性免疫组织学试剂染色，以评估联合治疗对免疫应答的影响。例如，用苏木精(hematoxolin)和伊红简单染色可以显示淋巴细胞浸润入实体瘤中的差异，其是细胞免疫应答的指示。此外，用针对特定种类的免疫细胞的抗体对切片进行免疫染色可以显示诱导应答的性质。例如，可以用与⑶45 ( —般的白细胞标记)、⑶4和⑶8 (用于T细胞亚类鉴定)、⑶25 (淋巴细胞标记)和NKl. 1 (NK细胞上的标记)结合的抗体来评估已通过本发明的方法介导的免疫应答的类型。此外，可以利用针对治疗中所使用的免疫细胞因子的抗体来测量免疫细胞因子浸润肿瘤的程度。还可以用荧光激活细胞分选术(FACS)分析免疫效应细胞群体来评估响应本发明的方法而刺激的免疫应答的类型和程度。使用本领域公知的方法，将已处理的样品，如血液样品暴露于针对多种免疫细胞标记，如⑶4、⑶8、⑶25、⑶44、⑶62L、⑶lib和D)(5的抗体混合物。用荧光标记标记各个种类的抗体，该荧光标记具有不同于混合物中其他种类的抗体的发射波长。然后通过FACS分选仪，如FacsARIA (BDBiosciences)处理样品，并针对多个细胞亚群进行分析。还可以用酶联免疫吸附斑点(ELISP0T)测定来测量免疫应答的起始。为了测定是否已刺激了给定的免疫细胞，将针对该细胞激活时所产生的蛋白质，例如细胞因子的抗体包被在ELISP0T平板上。将来自用本发明的方法治疗的小鼠的脾细胞加至平板并孵育。若细胞被激活，则它们将分泌目的蛋白质，且该蛋白质将被抗体捕获。将对该蛋白质的不同表位特异的抗体加至平板。可以用本领域已知的大量标记中的任一种来标记这些抗体。通常，抗体带有生物素标记，且还加入链霉抗生物素-HRP (辣根过氧化物酶)。然后测量标记的存在和量来测定细胞在免疫应答中激活的程度。备选地，可以通过例如Lode等(1998)Blood 91 :1706-1715中所述的常规细胞亚型排除研究来评估本发明的方法介导的免疫应答的类型。排除抗体的实例包括与T细胞标记⑶4和⑶8反应的抗体，以及结合NK标记NKl. 1和脱唾液酸GM的抗体。简言之，在开始本方法之前按较高的剂量(例如，按约0. 5mg/小鼠的剂量)对哺乳动物注射这些抗体，此后按一周的间隔施用，直至完成实验。此技术可以鉴定在哺乳动物中引起所观察到的免疫应答必需的细胞类型。在另一种方法中，可以将从已用联合治疗治疗的动物分离的脾细胞的细胞毒活性与来自其他治疗组的细胞毒活性相比较。通过见于大多数免疫学实验室手册中的标准技术机械绞碎所回收的无菌脾脏来制备脾细胞培养物。参见例如Coligan等(编辑) (1988) “ Current Protocols in Immunology, " John Wiley & Sons, Inc0 然后在含有血清、抗生素和低浓度IL-2( 10U/mL)的适宜的细胞培养基(例如来自GIBCO的DMEM) 中培养产生的细胞。例如，为了比较NK活性，培养3天通常是最适的，而为了比较T细胞细胞毒活性，培养5天通常是最适的。可以通过用51Cr对肿瘤靶细胞(例如LLC细胞)进行 30分钟的放射性标记来测量细胞毒活性。去除过量的放射性标记后，将标记的细胞与不同浓度的培养的脾细胞混合4小时。孵育结束时，通过Y计数器测量从细胞释放的51Cr,然后用其来定量由免疫细胞诱导的细胞裂解的程度。以这种方式来测量传统的细胞毒性T淋巴细胞(或CTL)活性。批准治疗或为治疗付款按照本发明的方法，第三方，例如医院、诊所、政府实体、报销方、保险公司(例如健康保险公司)、ΗΜ0、第三方支付者或支付或报销医疗费用的其他实体可以批准治疗、批准为治疗付款或批准报销治疗费用。例如，本发明涉及健康护理方法，其包括批准对具有之前照射过的肿瘤或癌细胞的哺乳动物施用免疫细胞因子，或批准为施用免疫细胞因子付款或
18报销。例如，该健康护理方法可以包括批准按至少IGy/天(例如至少2、至少3、1-4、1-10、 1-20、2-4、2-10、2-20、3-4、3-10或3-20Gy/天)的剂量，对具有之前照射过的肿瘤的哺乳动物施用免疫细胞因子，或批准为施用免疫细胞因子付款或报销。本发明的健康护理方法可以包括在将在首次对肿瘤施用辐射的21天内(例如18天内、15天内、12天内或8天内) 施用免疫细胞因子时批准施用免疫细胞因子，或批准为施用免疫细胞因子付款或报销。在一个实施方案中，该健康护理方法可以包括批准在放射治疗后施用免疫细胞因子，或批准为施用免疫细胞因子付款或报销，其中按低于免疫细胞因子最大耐受剂量的剂量，例如按低于免疫细胞因子最大耐受剂量的一半、低于免疫细胞因子最大耐受剂量的三分之一、低于免疫细胞因子最大耐受剂量的四分之一或低于免疫细胞因子最大耐受剂量的十分之一的剂量施用免疫细胞因子。实施例实施例1 材料和方法蛋白质从NS/0细胞系产生NHS-IL2LT(也称为Selectikine或EMD521873)并纯化。从 NS/0细胞系产生NHS-muIL12并纯化。细胞转染CD6细胞(通过在Balb/C小鼠中直肠内注射N-亚硝基_N_甲基氨基甲酸乙酯衍生的鼠结肠上皮细胞系)来表达已通过PCR克隆并用反转录病毒载体在亲本细胞中表达(Gillies 1998)的人 KS 抗原(KSA 或 EpCAM)。将 CI^6/KSA 细胞于 37°C和 7% CO2 下维持在补充了 10%热灭活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、维生素、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素 / 链霉素和Geneticin (G418) (Life Technologies, Inc.)的 DMEM 中。加入 G418 来维持KSA表达。将和CI^6/KSA细胞植入雌性Balb/C小鼠。将LL/2(LLC)细胞(鼠路易斯肺癌细胞系)于37°C和7% CO2下维持在补充了 10%热灭活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(Life Technologies, Inc.)的DMEM 中。将LLC细胞植入雌性C57BL/6小鼠。将B16细胞(鼠黑素瘤细胞系)于37°C和7%0)2下维持在补充了 10%热灭活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素/链霉素(Life Technologies, Inc.)的RPMI 1640中。将B16细胞植入雌性C57BL/6小鼠。化学品和溶液将EMD521873 配制在 U8mM精氨酸、6mM 柠檬酸、2. 蔗糖、0. 05% Tween 80、pH 6. 0中。用在^Onm下的吸光度和基于已知的蛋白质序列的12. 38mg/0D280的理论消光系数来测定稀释溶液的蛋白质浓度。贮存液在4°C下保存小于1个月。为了对小鼠施用，从贮存管取出配制的材料的整分试样，用0. 9%的盐水稀释，并在稀释后1小时内注射入动物。丢弃未使用的稀释材料。将NHS-muIL12 配制在 50mM 磷酸钠、150mM 氯化钠、0. 05% Tween 80、pH 7. 0 中。 为了对小鼠施用，用0. 9%的盐水将配制的材料稀释至0. 5mg/ml。顺钼(顺式-二氯化二氨钼(II))粉末获自Sigma-Aldrich (目录号P4394)。 在0. 9%的盐水中制备0. 4mg/ml的施用溶液。方法对于肿瘤生长测定，将培养的指数生长的细胞作为在100 μ 1 PBS中的单细胞悬液肌内注射入小鼠前腿。在使用双肿瘤模型的实验中，还将细胞植入小鼠胁腹(flank)。肿瘤建立之后，起始治疗(第0天)。在实验LLC-7中，将肿瘤植入胁腹直至建立。在第0至 9天治疗小鼠，然后在第12天用存活手术切除肿瘤。此后，监测动物存活。在实验LLC-14 中，在胁腹中皮下植入肿瘤直至建立。在第0至6天和第17天治疗小鼠，在研究期间每周测量肿瘤大小两次。
下表总结了用于各个实验的条件表权利要求
1.免疫细胞因子在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，其中肿瘤之前已照射，且所述免疫细胞因子旨在用于在之前最初辐射所述肿瘤的21天内施用。
2.权利要求1的用途，其中在首次施用所述免疫细胞因子前8-21天最初照射肿瘤。
3.权利要求1或2的用途，其中在肿瘤照射的终点之后1至6天后完成首次施用免疫细胞因子。
4.权利要求3的用途，其中在肿瘤照射的终点之后2至5天后完成首次施用免疫细胞因子。
5.权利要求1至4中任一项的用途，其中在1至14天的期间内在多天照射肿瘤。
6.权利要求1至5中任一项的用途，其中在1至5天的期间内在多天施用免疫细胞因子，从而形成免疫细胞因子施用的第一个周期。
7.权利要求6的用途，其中在第一个周期的终点之后2至12周后分别安排免疫细胞因子施用的第二个周期和其他周期。
8.权利要求1至7中任一项的用途，其中按至少IGy/天的剂量一次或分次在一天或几天照射肿瘤。
9.权利要求8的用途，其中按l_20Gy/天的剂量照射肿瘤。
10.权利要求1至9中任一项的用途，其中所述辐射后的免疫细胞因子剂量低于患者耐受的最大剂量，该患者耐受的最大剂量通过严重副作用在所述患者中的出现来定义。
11.权利要求10的用途，其中免疫细胞因子剂量低于最大耐受剂量的一半。
12.权利要求10或11的用途，其中免疫细胞因子剂量低于lmg/kg体重。
13.权利要求10或11的用途，其中免疫细胞因子剂量低于0.5mg/kg体重。
14.权利要求13的用途，其中免疫细胞因子剂量是0.lmg/kg至0. 5mg/kg。
15.权利要求1至14中任一项的用途，其中仅对部分肿瘤细胞进行肿瘤的照射。
16.权利要求15的用途，其中肿瘤在体内的位置不同于定义的所述部分肿瘤细胞的位置。
17.权利要求1至16中任一项的用途，其中所述免疫细胞因子分子的细胞因子是 IL-12、IL2 或 IL2(D20T)。
18.权利要求1至16中任一项的用途，其中免疫细胞因子是NHS-IL2(D20T)或 NHS-IL12。
19.用于治疗肿瘤的免疫细胞因子，其中肿瘤之前已用l_30Gy/天照射，且免疫细胞因子旨在用于在之前最初辐射所述肿瘤后21天内施用。
20.权利要求19的免疫细胞因子，其中在完成肿瘤照射之后1至6天后完成首次施用免疫细胞因子。
21.权利要求19或20的免疫细胞因子，其中在1至14天的期间内在多天照射肿瘤。
22.权利要求19至21中任一项的免疫细胞因子，其中辐射后的免疫细胞因子剂量低于患者耐受的最大剂量的一半，该患者耐受的最大剂量通过严重副作用在所述患者中的出现来定义。
23.权利要求19至22中任一项的免疫细胞因子，其中仅对不同位置的部分肿瘤细胞进行肿瘤的照射。
24.权利要求19至23中任一项的免疫细胞因子，其中免疫细胞因子分子内的细胞因子是 IL12、IL2 或 IL2(D20T)。
25.权利要求19至M中任一项的免疫细胞因子，其中免疫细胞因子是NHS-IL2(D20T) 或 NHS-IL12。
全文摘要
本发明涉及通过在放射治疗后施用免疫细胞因子来治疗肿瘤和癌细胞的方法。此治疗组合可以在照射和非照射部位刺激免疫应答，其用于消除已从原发肿瘤部位扩散的癌细胞。此外，可以按低于最大耐受剂量的剂量施用免疫细胞因子，这减轻了与免疫细胞因子疗法相关的副作用。
文档编号A61K38/20GK102196815SQ200980141799
公开日2011年9月21日 申请日期2009年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者K·J·卡伦, S·A·霍尔登, S·G·克林兹, T·威克姆, U·格纳德-福格特 申请人:默克专利有限公司