专利名称：用血管内皮生长因子受体拮抗剂抑制肿瘤生长的联合疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用血管内皮生长因子(VEGF)受体拮抗剂与化疗剂，放疗，和/或其 它生长因子受体拮抗剂联合治疗肿瘤的方法。
背景技术：
血管发生是指毛细血管从预先存在于胚胎和成体生物中的血管形成，已知血管发 生是肿瘤生长，存活和转移的重要因素。生长因子及其受体，包括表皮生长因子(EGF)，转 化生长因子-α (TGF-α)，转化生长因子-β (TGF-β )，酸性和碱性成纤维细胞生长因子 (aFGF和bFGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，和血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤的血管 发生中发挥作用。见 Klagsbrun&D，Amore ,Annual Rev. Physiol.，53 :217-239 (1991)。这 些生长因子与其细胞表面受体的结合可诱导受体活化，引发并修饰信号转导途径，导致细 胞增殖和分化。VEGF，一种内皮细胞-特异性促有丝分裂剂，则与这些因子不同，这是因为 它是通过特异性促进内皮细胞增殖而作为血管发生诱导剂起作用的。VEGF是一种由两个23kD的亚单位组成的同种型二聚糖蛋白，而且它是一种较强 的血管渗透性诱导剂，内皮细胞迁移和增殖的刺激剂，对于新形成的血管而言是重要的存 活因素。VEGF有4种不同的单体同种型，它们是从mRNA的可变剪接产生的。它们包括两种 膜结合形式(VEGF2tlf^PVEGF189)和两种可溶形式(VEGF16JPVEGF121)t5在除胎盘外的所有人 类组织中，VEGF165同种型的含量最高。VEGF是血管发生的重要调节剂，血管发生是指新血管由于内皮前体的原位分 化(成血管细胞)而从头发育，VEGF在胚胎组织(Breier等，Development (Camb. ),114 521 (1992))，巨噬细胞，以及伤口愈合过程中的增殖表皮角质形成细胞(Brown等，J. Exp. Med. , 176 :1375(1992))中表达，而且涉及与炎症有关的组织水肿O^errara等，Endocr. Rev. , 13 :18 (1992))。原位杂交研究已经证实，VEGF在很多人肿瘤系中高水平表达，包括多 形性成胶质细胞瘤，成血管细胞瘤，中枢神经系统瘤和AIDS-相关性卡波济氏肉瘤(Plate等，(1992)Nature 359 :845-848 ；Plate 等(1993)Cancer Res. 53 :5822-5827 ；Berkman 等 (1993) J. Clin. Invest. 91 :153-159 ；Nakamura ^ (1992)AIDS Weekly, 13(1)) 高水平的 VEGF也可在低氧诱导的血管发生中观察到(Stiweiki等，(1992)Nature 359:843-845)。VEGF的生物反应是通过其高亲和性受体介导的，它们在胚胎发生(Millauer， Cell, 72 :835-846(1993))和肿瘤形成过程中的内皮细胞上选择性表达。VEGF受体 (VEGFRs)通常是III类受体型酪氨酸激酶，其特征在于它们氨基末端的胞外受体配体 结合域中有若干，通常是5或7个免疫球蛋白样的环(Kaipainen等，J. Exp. Med. , 178 2077-2088(1993))。另外两个区包括一个跨膜区和一个羧基末端胞内催化域，其可被不 同长度的亲水性内激酶(interkinase)序列的插入，也称作激酶插入域断开(Terman等， Oncogene，6 1677-1683 (1991))。VEGFRs 包括由 Shibuya 等，Oncogene, 5 :519-524(1990) 测序的fins样酪氨酸激酶受体(flt-1)，或VEGFR-1，在1992年2月20日提交的 W092/14248，和 iTerman 等，Oncogene，6 :1677-1683(1991)中描述，并由 Matthews 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :9026-9030 (1991)测序的，含有激酶插入域的受体/胎儿肝激酶 (KDR/flk-Ι)，或VEGFR-2，当然其它受体，如neuropilin-1和-2也能结合VEGF。其它酪氨 酸激酶受体，VEGFR-3 (flt-4)，可结合VEGF的同源物VEGF-C和VEGF-D，而且在淋巴管的发 育中更为重要。高水平的Flk-I是由浸润神经胶质瘤的内皮细胞表达的(Plate等，(1992) Nature 359:845-848)。Flk-I的水平可被人成胶质细胞瘤产生的VEGF特异性上调(Plate等， (1993)CancerRes. 53 :5822-5827)。Flk-I在与内皮细胞(GAEC)有关的成胶质细胞瘤中的 高水平表达表明，受体活性很可能是在肿瘤形成过程中被诱导的，这是因为在正常的脑内 皮细胞中几乎检测不到Flk-I转录物。这种上调被限定在与肿瘤很近的血管内皮细胞。用 中和抗-VEGF单克隆抗体(mAbs)阻断VEGF活性可抑制人肿瘤的异种移植物在裸鼠中生长 (Kim等，(199;3)Nature 362 :841-844)，从而表明VEGF在与肿瘤有关的血管发生中的直接 作用。虽然VEGF配体在肿瘤细胞中是上调的，而且其受体在浸润肿瘤的血管内皮细胞 中也是上调的，但VEGF配体及其受体在与血管发生无关的正常细胞中的表达水平较低。因 此，这种正常细胞不会由于阻断VEGF及其受体间的相互作用而受到影响，从而抑制血管发 生及肿瘤生长。本发明的目的是提供VEGF受体的拮抗剂。本发明另一个目的是提供使用这种 VEGF受体拮抗剂，特别是使用这种VEGF受体拮抗剂与放疗，化疗或其它受体拮抗剂联合抑 制血管发生，由此抑制或减轻哺乳动物肿瘤生长的方法。
发明内容
本发明提供通过给予治疗有效量的VEGF受体拮抗剂和其它受体拮抗剂的联合而 减轻或抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。本发明还提供通过给予治疗有效量的VEGF受体拮 抗剂和放疗的联合而减轻或抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。此外，本发明提供通过给予治 疗有效量的VEGF受体拮抗剂和化疗剂的联合而减轻或抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。
图1 用单克隆抗体DC-101使flk-1 (VEGFR-2)/SEAPS免疫沉淀的蛋白质印迹证 实DC-101可使鼠flk-1 =SEAPS免疫沉淀，但不能使单独的SEAPS免疫沉淀。图加和2b 图2a 竞争性抑制测定法，表示抗_f lk_l (VEGFR-2)单克隆抗体 DC-101对VEGF165诱导的转染3T3细胞中f lk_l (VEGFR-2) /fms受体磷酸化的作用。图2b VEGF诱导的flk-1 (VEGFR-2)/fms受体磷酸化对单克隆抗体DC-101所致抑制的敏感性。 C441细胞是在最大刺激浓度的VEGF165GOng/ml)及不同水平抗体的条件下测定的。图 3a 和 3b 图 3a 在有 mAb DC-IOl 存在时，VEGF-诱导的 flk-1 (VEGFR-2) /fms 受体磷酸化的滴定。C441细胞是在有(1-4道)或没有(5-8道)5 μ g/ml mAb DC-IOl存 在时，用指定浓度的VEGF刺激的。在有抗体(9道)存在时测定的未受刺激的细胞用作对 照。图北是相对于各VEGF浓度绘制的，图3a各道中磷酸化受体水平的光密度测定扫描 图，该图显示过量配体浓度对mAb的抑制程度。用于检测的细胞溶解产物是按照下面实施 例所述，通过抗-磷酸酪氨酸制备的。图 4 通过预结合的 mAb DC-IOl 抑制 VEGF-flk-l (VEGFR-2) /fms 的活化。C441 细 胞是在没有(3道和4道)和有(5道和6道)DC-IOl时，用指定浓度的VEGF刺激的。未受 刺激的细胞(1道和2道)用作对照。MAb是在两组条件下测定的。对于P而言，细胞与mAb 预结合，接着室温用VEGF刺激15分钟。对于C而言，同时加入mAb和配体，并按照上面所 述进行测定。图5 用不同浓度的单克隆抗体DC-IOl和成胶质细胞瘤细胞的条件培养基(GB CM)处理VEGF-诱导的flk-1 (VEGFR-2) /fms受体磷酸化。图 6 对抗-flk-1 (VEGFR-2) mAb 与 flk_l (VEGFR-2)/fms 转染的 3T3 细胞 (C441)的结合进行FACS分析。把转染的flk-1 (VEGFRD/fms3T3细胞与10 μ g/ml的 抗-flk-1 (VEGFR-2)mAb DC-IOl或同种型匹配的无关抗-flk-lmAb 23H7—起放在冰上温 育60分钟。洗涤细胞，用5 μ g与FITC偶联的山羊抗-小鼠IgG再温育，洗涤，并通过流式 细胞术进行分析，确定抗体结合。数据表示与使用无关mAb 23H7检测到的相比，DC-IOl对 C441细胞的荧光水平。图7:mAb DC-101与f lk_l (VEGFR-2)/fms受体在转染的3T3细胞系C441上的饱和 结合。4°C时，使汇合的C441细胞与浓度逐渐增加的mAb DC-101 (50ng/ml-2 μ g/ml)在M 孔平板中温育2小时。洗涤细胞，用5yg抗-大鼠IgG-生物素偶联物温育。为了检测结 合，洗涤细胞，用1 1000稀释的链霉抗生物素-HRP温育，洗涤，并在比色检测系统(TMB) 中温育。数据代表mAb DC-IOl的浓度逐渐增加时，540nm处的吸光度。除去每次测定中第 二抗体与单独细胞的结合是为了对非-特异性结合进行调整。数据代表三次独立实验的平 均值。图 8 磷酸化 flk-1 (VEGFR-2) /fms 从 VEGF 刺激的 flk_l (VEGFR-2) /fms 转染的 3T3细胞中的免疫沉淀。细胞是按照实验过程所述用VEGF刺激的，溶解产物是用下列无关 或相关抗体免疫沉淀的1.大鼠抗-FLK2 IgG2a(mAb 2A13) ；2.大鼠抗-flk_l (VEGFR-2) IgGl (mAb DC-101) ；3.大鼠抗-FLK2IgGl (mAb 23H7) ；4.兔抗-fms 多克隆抗体。免疫沉淀 蛋白经过SDS PAGE，接着经过蛋白质印迹分析。VEGF活化受体的免疫沉淀是通过用抗-磷 酸酪氨酸抗体探测印迹而检测的。
图9 =VEGF-诱导的flk_l (VEGFR-2) /fms受体磷酸化对mAb DC-101抑制的敏感 性。预结合及竞争性测定法是在指定抗体浓度下，用40ng/ml VEGF进行的。用于受体检测 的细胞溶解产物是按照下面实施例所述用抗磷酸酪氨酸制备的。图10 :mAb DC-101对CSF-1诱导的fms受体磷酸化的作用。在(B)中，fms/FLK_2 转染的3T3细胞系，10A2,是在没有(3道和4道)和有(5道和6道)5 μ g/ml的mAb DC-101 时，用最优刺激水平的CSF-I刺激的。在没有(1道)或有位道)抗体时测定的未受刺激的 细胞用作对照。用于检测的细胞溶解产物是按照下面实施例所述通过抗磷酸酪氨酸制备的。图11 活化flk-1 (VEGFR-2) /fms受体的mAb DC-101中和的特异性。C441细胞是 在有DC-101 (IgGl)或无关抗-FLK-2大鼠单克隆抗体2A13(IgG2a)或23H7 (IgGl)存在时， 用20或40ng/ml VEGF刺激的。测定法是在竞争性道)或预结合(9_11道)条件下， 在没有VEGF(l-3道)和有VEGF存在时，用各个抗体进行的。用于检测的细胞溶解产物是 按照下面实施例所述，通过抗磷酸酪氨酸制备的。分离印迹，并使用fms受体C-末端区的 兔多克隆抗体对印迹进行再次探测，从而检测flk-1 (VEGFR-2)/fms受体。图12 磷酸化受体带从VEGF刺激的HUVEC细胞中的免疫沉淀。HUVEC细胞在内皮 生长培养基(EGM)中生长3天，期间不更换培养基，直到细胞亚汇合。受体形式是利用mAb DC-101从未受刺激的细胞(1道)，VEGF刺激的细胞O道)，以及在有1 μ g/ml肝素(3道) 存在时，用VEGF刺激的细胞的溶解产物中免疫沉淀出来的。磷酸化受体形式的磷酸化测定 法，免疫沉淀法，和检测是按照实验过程所述进行的。图13 :mAb DC-101对反应于VEGF的HUVEC细胞增殖的作用。细胞按照图6的说 明生长48小时。然后细胞经过下列测定条件不向培养基中加入任何物质(未处理过的)； 更换新鲜的内皮生长培养基(完全培养基)；在没有或有ι μ g/ml肝素存在时，加入IOng/ ml VEGF ；在有1 μ g/ml DC-101存在时测定VEGF和VEGF-肝素处理过的细胞。用于进行增 殖测定的细胞是使用细胞增殖测定试剂盒(Promega)，通过在550nm处进行比色检测而测 定的。图1 和14b:图14a:用DC-101 (大鼠抗-flk-Ι单克隆抗体)减轻个体动物的肿 瘤生长。图14b 用对照的2A13组(大鼠抗-flk-2单克隆抗体)减轻个体动物的肿瘤生长。图15 用人成胶质细胞瘤的细胞系GBM-18给无胸腺裸鼠皮下注射，并把它们分成 三组PBS对照组，无关大鼠IgGl对照23H7组，和DC-101。治疗是用肿瘤异种移植物皮下 给予的，并持续4周。图 16 表示不同的 scFv抗体(plCll，plF12，p2A6和p2A7)与固定化KDR(VEGFR_2) 直接结合的曲线图。图 17 表示通过不同的 scFv抗体(plCll，plF12，p2A6和p2A7)抑制KDR(VEGFR-2) 与固定化VEGF165结合的曲线图。图18 表示通过scFv抗体(p2A6和plCll)抑制VEGF-诱导的HUVEC增殖的曲线 图。图19 =C-PlCll的Vh和八链的核苷酸及推断的氨基酸序列。图20 表示抗体(c-plCll，plCll，p2A6)与固定化KDR(VEGFR-2)直接结合的曲线 图。
图21 表示c-plCll与表达HUVEC的KDR-(VEGFR-2)结合的FACS分析曲线图。图 22 表示通过不同的 scFv 抗体(c-plCll，plCll，和 p2A6)抑制 KDR(VEGFR_2) 受体与固定化VEGF165结合的曲线图。图23 表示通过c-pICl 1和冷VEGF165抑制放射性标记的VEGF165与固定化 KDR(VEGFR-2)受体结合的曲线图。图对表示通过抗-KDR(VEGFR-2)抗体(c_plCll，plCll)抑制VEGF-诱导的HUVEC 增殖的曲线图。
具体实施例方式本发明提供用放疗，化疗，和/或其它受体拮抗剂与VEGF受体拮抗剂联合减轻或 抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。在优选实施方案中，当用VEGF受体拮抗剂与化疗剂，放疗，或其它受体拮抗剂或 其组合联合治疗肿瘤，包括人的肿瘤时，可产生协同效果。换句话说，当VEGF受体拮抗剂与 化疗剂，放疗，或其它受体拮抗剂或其组合联合抑制肿瘤生长时，可产生比所预期的还要好 的治疗效果。当使用联合疗法抑制肿瘤生长所产生的效果比使用VEGF受体拮抗剂和化疗 剂，放疗，或其它受体拮抗剂所产生的效果之和还要大时，表现出协同效果。优选，协同效果 是通过癌症的缓解加以证实的，其中这种缓解是使用VEGF受体拮抗剂和化疗剂，放疗，或 其它受体拮抗剂进行联合治疗时所没有预见到的。(见实施例VIII.)VEGF受体拮抗剂是在开始化疗或放疗之前，之中，或之后，及其任意组合，即，在开 始化疗和/或放疗之前和之中，之前和之后，之中和之后，或之前，之中，和之后给予的。例 如，当VEGF受体拮抗剂是抗体时，抗体通常在开始放疗和/或化疗之前的1-30天之间，优 选3-20天之间，更优选5-12天给药。放疗与VEGF受体拮抗剂联合使用的放射源对于所治疗的患者而言可以是外在的或内 在的。当放射源对患者是外在的时，该疗法被称为外在射线放疗(EBRT)。当放射源对于患 者是内在的时，该疗法被称为近程放射治疗(BT)。放疗是按照熟知的标准技术，使用为此目的制造的标准设备，如AECL Theratron 和Varian Clinac给予的。放疗的剂量取决于多种因素，这是本领域熟知的。这种因素包 括所要治疗的器官，放疗途径中的健康器官，因为这些健康器官可能会无意中受到不良影 响，患者对放疗的耐受性，和需要进行治疗的机体面积。所述剂量通常为Ι-lOOGy，更优选 2-80Gy。已经报道过的某些剂量包括脊髓35Gy，肾15Gy，肝20Gy，前列腺65_80Gy。然而应 当强调的是，本发明不限制于任何特定的剂量。剂量可由主治医生根据已知情况中的特定 因素，包括上述因素确定。外在放射源与进入患者内的点之间的距离可以是任意距离，它代表在杀死靶细 胞和使副作用达到最小之间的可接受的平衡。通常，外在放射源距离进入患者内的点 70-100cm。通常，近程放射治疗是通过把放射源放在患者中进行的。通常，放射源被放置在距 离所要治疗的组织大约0-3cm处。已知的技术包括间质，腔内，和表面近程放射治疗。放射 源可永久或暂时植入。永久植入物中使用的某些典型的放射性原子包括碘-125和氡。临
8时植入物中使用的某些典型的放射性原子包括镭，铯-137，和铱-192。已经用于近程放射 治疗的某些其它放射性原子包括镅-241和金-198。近程放射治疗的放疗剂量可与上述外在射线放疗相同。除了上面提到的，用于确 定外在射线放疗剂量的因素之外，在确定近程放射治疗的剂量时，还要考虑到所用放射性 原子的性质。化疗化疗剂包括可有效抑制肿瘤生长的所有化合物。化疗剂的给药可以各种方式进行，包括通过肠胃外和肠内途径全身给药。在其中 一个实施方案中，VEGF受体拮抗剂和化疗剂可作为独立的分子分开给药。在另一实施方案 中，VEGF受体拮抗剂通过与化疗剂偶联而连接。化疗剂的例子包括烷基化剂，例如，氮芥类，乙烯亚胺化合物和烷基磺酸盐；抗代 谢物，例如，叶酸，嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂分裂抑制剂，如，长春碱和鬼白毒素衍生物； 细胞毒性的抗生素；损害或干扰DNA表达的化合物。此外，化疗剂包括此处所述的抗体，生物分子和小分子。化疗剂的具体例子包括顺钼，达卡巴嗪(DTIC)，更生霉素，双氯乙基甲胺(氮芥)， 链脲霉素，环磷酰胺，卡莫司汀(BCNU)，罗氮芥(CCNU)，阿霉素(亚德里亚霉素)，柔红霉素， 丙卡巴胼，丝裂霉素，阿糖孢苷，依托泊苷，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，长春花碱，长春新碱，博 莱霉素，紫杉醇(紫杉酚)，多西他赛(脱乙酰基紫杉醇)，阿地流津，天门冬酰胺酶，白消 安，卡钼，克拉屈滨，达卡巴嗪，氟尿苷，氟达拉滨，羟基脲，异环磷酰胺，干扰素α，利普安， 甲地孕酮，美法仓，巯基嘌呤，普卡霉素，米托坦，培加帕酶，喷司他丁，哌泊溴烷，光辉霉素， 链脲霉素，他莫昔芬，替尼泊苷，睾内酯，硫鸟嘌呤，噻替派，尿嘧啶氮芥，维诺利宾，苯丁酸 氮芥，紫杉酚及其组合。生长因子受体拮抗剂本发明所用的生长因子受体拮抗剂(除了 VEGF受体拮抗剂)包括可抑制生长因 子受体的配体对生长因子受体刺激的所有物质。这种刺激的抑制可抑制表达生长因子受体 的细胞生长。涉及肿瘤发生的生长因子受体的某些例子是表皮生长因子(EGFR)，血小板衍生的 生长因子(PDGFR)，胰岛素样生长因子(IGFR)，神经生长因子(NGFR)，和成纤维细胞生长因 子(FGF)的受体。优选，本发明所用的生长因子受体拮抗剂是EGFR拮抗剂。本发明的EGFR拮抗剂 是生物分子，小分子，或任何其它物质，它们可抑制EGFR活化，由此抑制EGFR的酪氨酸激酶 活性，并防止受体自磷酸化，以及涉及各种EGFR信号途径的其它蛋白磷酸化。EGFR活化的 抑制是指EGFR活化的任意降低，它无需完全阻止或终止EGFR的活化。此外，本发明定义的EGFR活化的抑制是指由于EGFR拮抗剂与受体相互作用产生 的EGFR抑制。相互作用是指EGFR拮抗剂与受体之间充分的物理或化学相互作用，如此才 能抑制酪氨酸激酶的活性。本领域的技术人员应当了解这种化学相互作用的例子，它包括 在EGFR拮抗剂和受体之间，本领域已知的缔合或键合，还包括共价键合，离子键合，氢键键 合等。与EGF拮抗剂形成对比，它与配体相互作用，由此抑制活化。根据其它生长因子的具体情况，EGFR活化的增加可能是由于配体水平升高，EGFR基因扩增，受体转录增加或引起上调受体信号的突变增加而引起的。编码EGFR基因的扩增 导致与EGFR结合的配体数增加，从而进一步刺激细胞增殖。EGFR还可在没有基因扩增的 情况下过量表达，据推测是通过可增加EGFR转录，mRNA翻译，或蛋白稳定性的突变完成的。 EGFR突变体已在神经胶质瘤，非小细胞肺癌，卵巢癌和前列腺癌中鉴定，它们具有组成型活 性的酪氨酸激酶，表明高水平EGFR活性的作用，而不是EGFR在这些癌中过量表达的作用。 见，例如，Pedersen 等，Ann. Oneol.，12 (6) :745-60 (2001)。(III 型 EGFR 突变-各式命名 的EGFRvIII，de2-7EGFR或AEGFR-缺少由外显子2-7编码的胞外配体结合域的一部分)； 见 Wikstrand 等，Cancer Res.，55 :3140-3148 (1995)。在本发明其中一个实施方案中，EGFR拮抗剂抑制EGFR与其配体结合。配体与EGFR 外部的胞外域的结合可刺激受体二聚化，EGFR自磷酸化，受体的内部胞质酪氨酸激酶结构 域的活化，和涉及DNA合成及细胞分裂调节的多个信号转导途径的引发。EGFR的配体包括， 例如，EGF，TGF-a，双调蛋白，肝素-结合 EGF(HB-EGF)和 betarecullulin。EGF 和 TGF-α 是可导致EGFR-介导的刺激的主要内源性配体，尽管TGF- α在促进血管发生方面更有效。在本发明另一实施方案中，EGFR拮抗剂结合EGFR。应当了解EGFR拮抗剂可与EGFR 的胞外部分外部结合，抑制或不抑制配体的结合，或与酪氨酸激酶结构域内部结合。结合 EGFR的EGFR拮抗剂的例子包括，但不限制于，生物分子，如对EGFR特异的抗体(及其功能 等同物)，直接作用于EGFR胞质域的合成激酶抑制剂，如小分子。本发明的EGFR拮抗剂优选对EGFR特异的生物分子，更优选抗体，或其功能等同 物。对本发明所用抗体的描述可在名为“抗体”的部分找到。此外，在抗体结合之后，优选 使EGFR-抗体复合物内化并降解，防止受体被细胞再利用。 已知的生物分子EGFR拮抗剂是ERBITUX (IMC-C225)，它是对EGFR特异的嵌 合(人/小鼠)单克隆抗体。见，例如，美国专利号4，943，533 (Mendelsohn等)；美 国专利号 6, 217，866 (Schlessinger 等)；美国申请号 08/973，065 (Goldstein 等)和 09/635, 974 (Teufel) ；W099/60023 (Waksal 等)和 WO 00/69459 (Waksal)。单克隆抗体 ERBITUX 特异性结合EGFR，并阻断配体，例如EGF的结合。这种阻断可抑制肿瘤生长，包 括通过干扰EGFR活化作用而抑制肿瘤侵入，转移，细胞修复和血管发生。此外，或可选择性 地，单克隆抗体ERBITUX 可促进受体-抗体复合物的内化，防止其配体或任何其它机理进 一步刺激受体。生物分子EGFR拮抗剂的其它例子是ABX-EGF，它是对EGFR特异的完全人IgG2单 克隆抗体。ABX-EGF以较高的特异性结合EGFR，阻断EGFR与其两个配体，EGF和TGF-α 的结合。见，例如，Figlin等，ASCO第37期年会的摘要1102，San Francisco, CA, 2001 年5月12-15日。先前被称作克隆E7.6.3的ABX-EGF的序列和描述在美国专利号 6，235，883 (Abgenix, Inc.)第28栏第62行-第29栏第36行和图29-34中公开。见Yang 等，Critical Rev. Oncol. /Hematol. , 38 (1) :17-23, 2001。在可选择性，但也是优选的实施方案中，本发明的EGFR拮抗剂是小分子的酪氨酸 激酶抑制剂。小分子的描述可在名为“小分子”的部分找到。已经描述过使用很多小分子 抑制EGFR。例如，Spada等，美国专利5，656，655，公开了可抑制EGFR的苯乙烯基取代的杂芳 基化合物。所述杂芳基是具有一个或两个杂原子的单环，或具有1-约4个杂原子的双环，
10该化合物可被任选取代或多取代。美国专利5，656，655公开的化合物引入此处作为参考。Spada等，美国专利5，646，153公开了可抑制EGFR的双单环和/或双环的芳基杂 芳基，碳环，和杂碳环化合物。美国专利5，646，153公开的化合物引入此处作为参考。Bridges等，美国专利5，679，683公开了可抑制EGFR的三环嘧啶化合物。所述化 合物是稠合的杂环嘧啶衍生物，在第3栏第35行-第5栏第6行描述。第3栏第35行-第 5栏第6行描述的这些化合物引入此处作为参考。Barker，美国专利5，616，582公开了具有受体酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生 物。美国专利5，616，582公开的化合物引入此处作为参考。Fry 等，Science, 265 :1093-1095(1994)公开了具有抑制 EGFR 的结构的化合物。 结构在图1中给出。Fry等所著文章图1中所示的化合物引入此处作为参考。Osherov 等，J. Biol. Chem.，268 (15) :11，134-42 (1993)公开了可抑制 EGFR/HER1 和HER2的酪氨酸磷酸化抑制剂。Osherov等所著文章中公开的化合物，特别是表I，II，III， 和IV中的那些引入此处作为参考。Levitzki等，美国专利5，196，446公开了可抑制EGFR的杂芳基乙烯二基或杂芳基 乙烯二基芳基化合物。美国专利5，196，446第2栏第42行-第3栏第40行公开的化合物 引入此处作为参考。Panek 等，J. Pharma. Exp. Thera. J83 :1433-1444(1997)公开了被鉴定为 PD166285的化合物，它可抑制受体的EGFR，PDGFR，和FGFR家族。PD166285被鉴定为6-(2， 6-二氯苯基)-244-(2-二乙氨基乙氧基)苯氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3_d)嘧 啶-7-酮，它具有第1436页图1所示的结构。在Panek等所著文章第1436页图1中描述 的化合物引入此处作为参考。小分子EGFR拮抗剂的其中一个例子是IRESSA (ZD1939)，它是quinozaline 衍生物，可作为ATP-模拟物抑制EGFR。见，美国专利号5，616，582(Zeneca Limited)； WO 96/33980 (Zeneca Limited)第 4 页；见，Rowinsky 等，ASCO 第 37 期年会的摘要 5， San Francisco, CA, 2001 年 5 月 12-15 日；Anido 等，ASCO 第 37 期年会的摘要 1712，San Francisco, CA,2001 年 5 月 12-15 日。TARCEVA 是小分子EGFR拮抗剂的另一个例子。TARCEVA (0SI_774)是4-取代 的苯氨基quinozaline衍生物[6，7_双甲氧基-乙氧基)_喹唑啉_4_基]-(3-乙炔 基-苯基)胺盐酸盐]EGFR抑制剂，它在WO 96/30347 (Pfizer he.)第2页第12行-第
4页第 34 行和第 19 页第 14-17 行描述。也见 Moyer 等，Cancer Res.，57 :4838-48 (1997)； Pollack等，J. Pharmacol. ,291 :739-48(1999)。TARCEVA 通过抑制EGFR及其下游PI3/Akt 磷酸化和导致P27-介导的细胞周期停滞的MAP (促有丝分裂剂活化蛋白)激酶信号转导途 径而发挥作用。见，Hidalgo等，ASCO第37期年会的摘要281，San Franscio, CA, 2001年
5月 12-15 日。还有很多其它小分子也可抑制EGFR。小分子EGFR拮抗剂的一些例子 ^t WO 91/116051, WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199(ZenecaLimited), WO 97/30034(Zeneca Limited),WO 97/42187(Zeneca Limited),WO 97/49688(Pfizer Inc.)， WO 98/33798(Warner LambertCompany), WO 00/18761(American Cyanamid Company), 和WO 00/31048 (Warner Lambert Company)描述。小分子EGFR拮抗剂的具体例子包括C1-1033，它是酪氨酸激酶，特别是EGFR的quinozaline (N<4-(3-氯_4_氟-苯 氨基)-7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺)抑制剂，在WO 00/31048 (Warner-Lambert Company)第 8 页第 22-6 行描述；PKI166，它是 EGFR 的吡咯并 嘧啶抑制剂，在 W097/27199 (Novartis AG)第 10-12 页描述；GW2016，它是 EGFR 和 HER2 的 抑制剂；和ΕκΒ569。其它EGFR拮抗剂可使用熟知的方法很容易地确定。本发明的EGFR拮抗剂可抑 制EGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化事件。因此，磷酸化测定法可用于确定本发 明所用的拮抗剂。酪氨酸激酶活性的某些测定法在Panek等，(1997)和Batley等，Life Sci. ,62:143-50(1998)中描述。此外，可使用特异性检测EGFR表达的方法。这些包括检 测蛋白表达的免疫组织化学(HIC)，检测基因扩增的荧光原位杂交(FISH)，竞争性放射性 配体结合测定法，固体基质印迹技术，如RNA和DNA印迹，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR) 和 ELISA。见，例如，Grandis 等，Cancer，78 :1284-1292(1996) ；Shimizu 等，JapanJ. Cancer Res. ,85 :567-571(1994) ；Sauter 等，Am. J. Path.，148 :1047-1053(1996) ；Collins, Glia, 15 :289-296(1995) ；Radinsky等，Clin. Cancer. Res.，1 :19-31(1995) ；Petrides等，Cancer Res. ,50 :3934-3939(1990) ；Hoffmann 等，Anticancer Res. , 17 :4419-4426(1997)； Wikstrand 等，Cancer Res.，55 :3140-3148 (1995)。VEGF受体拮抗剂在其中一个实施方案中，VEGF受体拮抗剂特异性结合VEGF受体胞外域上的抗原 决定部位。VEGF受体的胞外域是配体-结合域。配体-结合域可在受体任何一个末端找 到，但通常位于氨基末端。VEGF受体的一些例子包括蛋白酪氨酸激酶受体，如文献中提到的 flt-1 (VEGFR-I)，KDR和flk_l (VEGFR-2)。除非另有说明或以其它方式清楚地说明，本说明 书将遵循VEGF受体的常规文献命名法。KDR (VEGFR-2)被称作具有MW 180kD的VEGF受体 的人类形式(Terman等，上述)。Flk-I (VEGFR-2)被称作KDR的鼠同系物(Matthews等，上 述)。Flt-I (VEGFR-I)被称作VEGF受体的不同形式，但与KDR/flk-1 (VEGFR-2)受体有关。 见Siibuya等，上述。其它VEGF受体包括用VEGF交联标记的那些，或与KDR (VEGFR-2)共-免疫沉淀的 那些。这些VEGF受体某些已知形式的分子量大约为170KD，150KD，130-i;35KD，120-125KD 和 85KD。见，例如，Quinn 等，Proc. Nat，1 Acad. Sci USA，90 :7533-7537 (1993) ；Scher 等， J.Biol. Chem.，271 :5761-5767(1996)。VEGF受体通常与细胞，如内皮细胞结合。VEGF受体还可与非-内皮细胞，如肿瘤 细胞结合。可选择性地，VEGF受体可游离于细胞，优选可溶性形式。 本发明的拮抗剂可中和VEGF受体。在本说明书中，中和受体是指使受体的内在激 酶活性灭活，从而转导信号。VEGF受体中和的可靠测定法是抑制受体磷酸化。本发明不受VEGF受体中和的任何特殊机理的限制。在申请这种应用时，还不了解 通过抗体中和VEGF受体的机理，通过其中一种拮抗剂中和的机理无须与通过另一种拮抗 剂中和的机理相同。某些可能的机理包括阻碍VEGF配体与VEGF受体的胞外结合域结合， 并防止受体二聚或寡聚。然而，不能排除其它机理。本发明的VEGF受体(或VEGFR)拮抗剂是生物分子，小分子，或抑制受体VEGFR亚CN 102133403 A
说明书
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家族的任何其它物质。受体VEGFR亚家族活化的抑制是指VEGFR活化的任意降低。S卩，阻 碍活化时，无需完全终止VEGFR活化。此外，本发明所定义的VEGFR活化的抑制是指VEGFR 拮抗剂与VEGFR相互作用之后，VEGFR拮抗剂的抑制。缔合是指VEGFR拮抗剂与VEGFR之 间充分的物理或化学相互作用，从而抑制受体的酪氨酸激酶活性。本领域技术人员应当了 解这种化学相互作用的例子，包括本领域已知的缔合或键合，包括共价键合，离子键合，氢 键键合等。因此，本发明的VEGFR拮抗剂可抑制受体的酪氨酸激酶活性，阻碍受体自磷酸化 和涉及VEGFR信号途径的各种其它蛋白磷酸化。这种涉及血管发生和血管形成的调节的 途径包括下列任何一种磷脂酶C γ (PLCy)途径或磷脂酰肌醇3’激酶(PI3-K)/Akt和促 有丝分裂剂激活的蛋白激酶(MAPK)途径。见，例如，Larrivee等，Int' 1 J. Mol. Med.，5 447-56(2000)。受体VEGFR亚家族的特征在于胞外域中7个免疫球蛋白样环，单一跨膜区和胞内 区中断裂酪氨酸激酶结构域的存在(III类受体酪氨酸激酶)。受体VEGFR亚家族还有很 多已知的成员，它的例子包括VEGFR-I，VEGFRUP VEGFR-3。据信KDR(VEGFR_2)是主要的 VEGF信号转导物，它可导致内皮细胞的增殖，迁移，分化，管形成，血管渗透性的增加，和血 管完整性的维持。VEGFR-I具有较弱的激酶活性，而且当受到VEGF刺激时，不能产生促有丝 分裂反应，虽然它可以高于KDR(VEGFR-2)大约10倍的亲和性与VEGF结合。VEGFR-I还涉 及VEGF和胎盘生长因子(PIGF)诱导的单核细胞和巨噬细胞迁移以及组织因子的产生。对于上述EGFR而言，VEGFR活化的增加可能是由高水平的配体，VEGFR基因的扩 增，受体转录的增加或引起上调受体信号的突变而引起的。在本发明其中一个实施方案中，VEGn 拮抗剂抑制VEGFR与其配体结合。配体与 VEGFR外部的胞外域结合可刺激受体二聚化，VEGFR自磷酸化，受体内部胞质酪氨酸激酶结 构域的活化，和涉及血管形成及血管发生的调节的多个信号转导途径的引发。VEGFR 的配体包括 VEGF 及其同源物 P1GF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D,和 VEGF-E。例 如，P1GF，它是只结合VEGFR-I的二聚分泌型因子，它通过绒毛细胞滋养层，合胞滋养层和 绒毛外滋养层大量产生，其氨基酸序列与VEGF的同源性很高。人类有3种同种型，P1GF-1， P1GF-2，和P1GF-3。对缺乏PlGF小鼠的研究证实，这种生长因子本身与血管发生无关，但可 特异性调节病理过程中的血管发生及VEGF的渗透作用。且，VEGF-D与VEGF-C紧密相关，这 是因为在其它VEGF家族成员中是找不到N-和C-末端延伸的存在。在成人组织中，VEGF-D 的mRNA在心脏，肺，骨胳肌，结肠，和小肠中的含量最丰富。对VEGF-D受体特异性进行的分 析揭示，VEGF-D是VEGFR-2 (Flkl)和VEGFR-3 (Flt4)的配体，而且可激活这些受体；然而， VEGF-D不结合VEGFR-I。此外，VEGF-D是内皮细胞的促有丝分裂剂。在本发明另一实施方案中，VEGFR拮抗剂结合VEGFR。应当认识到，VEGFR拮抗剂 可与VEGFR的胞外部分外部结合，抑制或不抑制配体的结合，VEGFR拮抗剂还可与酪氨酸激 酶结构域内部结合。结合VEGFR的VEGFR拮抗剂的例子包括，但不限制于，生物分子，如受 体核酶及对VEGFR特异的抗体(或其功能等同物)，和直接作用于VEGFR胞质结构域的合成 激酶抑制剂，如小分子。优选本发明的VEGFR拮抗剂是对VEGFR特异的生物分子，更优选抗 体或其功能等同物，下面将对它们作更详细的描述。可选择性地，本发明的VEGFR拮抗剂是 小分子激酶抑制剂，下面将对其作详细描述。在其中一个优选实施方案中，VEGFR受体拮抗剂特异性结合VEGFR-I。特别优选抗
13原结合蛋白，它可结合VEGFR-I的胞外结构域，并通过其一个或两个配体，VEGF和PlGF阻 断结合，和/或中和VEGF-诱导的或PlGF诱导的VEGFR-I活化。例如，mAb 6. 12是与可溶 性，细胞表面表达的VEGFR-I结合的scFv。ScFv 6. 12含有小鼠单克隆抗体mAb 6. 12的八 和Vh结构域。产生mAb 6. 12的杂交瘤细胞系已经保藏，ATCC号为PTA-3344。保藏是根据 布达佩斯条约的规定，在用于专利程序及其条例(布达佩斯条约)的微生物保藏机构进行 的。这样做可确保活培养物自保藏之日起维持30年。根据布达佩斯条约，在申请人和ATCC 之间达成协议的情况下，可从ATCC获得生物体，这样可确保在相关美国专利公开之后，不 受限制地使用它。按照专利法的规定，在实行该发明时，无须在任何行政机构的授权下使用 保藏菌株。其它优选抗体在实施例，特别是实施例XII，XIII，和XIV，及SEQID NO 1-83中 描述。此外，这些优选VEGFR抗体拮抗剂的其中一部分在Lu等，ht，1 J. Cancer,97 393-399(2002)中描述。还存在各种产生VEGFR-2抗体的杂交瘤。例如，产生大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆 抗体的杂交瘤细胞系(DClOl)的保藏号为ATCC HB11534 ；产生小鼠抗小鼠VEGFR-2单克 隆抗体mAb 25的杂交瘤细胞系(M25. 18A1)的保藏号为ATCC HB 12152 ；产生小鼠抗小鼠 VEGFR-2单克隆抗体mAb 73的杂交瘤细胞系(M73. 24)的保藏号为ATCC HB12153。此外，产生抗VEGFR-I抗体的各种杂交瘤包括，但不限制于，杂交瘤KM1730 (保藏 号 FERM BP-5697)，KM1731(保藏号 FERM BP-5718)，杂交瘤 KM1732 (保藏号 FERM BP-5698)， KMl748 (保藏号 FERM BP-5699)，杂交瘤 KMl750 (保藏号 FERM BP-5700)，它们在 WO 98/2^16，W099/59636，澳大利亚申请号AU 199850666B2，和加拿大申请号CA23^893中描 述。很多其它VEGFR拮抗剂也是本领域已知的。VEGFR拮抗剂的某些例子在美国 申请号 07/813，593 ；07/906，397 ；07/946，507 ；07/977，451 ；08/055，269 ；08/252, 517 ； 08/601, 891 ；09/021, 324 ；09/208, 786 ；和 09/919，408(所有均属于 Lemischka 等)；美国专利号 5，840，301 (Rockwell 等)；美国申请号 08/706，804 ；08/866，969 ； 08/967，113 ；09/047, 807 ；09/401, 163 ；和 09/798, 689(所有均属于 Rockwell 等)； 美国申请号09Λ40，770 (Witte等)；和PCT/US01/06966 (Liao等)中描述。美国专 利号 5，861，301 CTerman 等)，Terman 等，0ncogene6 1677-1683 (1991 年 9 月)，WO 94/10202 (Ferrara 等)，和 WO 95/21865 (Ludwig)公开了 VEGFR 拮抗剂，特别是抗 VEGFR-2 抗体。此外，PCT/US95/01678 (Kyowa Hakko)描述了抗VEGFR-2抗体。抗VEGFR抗体还在美国 申请号 09/976，787 (Zhu 等)中描述。美国专利号 6，177，401 (Ullrich 等)，5，712，395 (App 等)，和5，981，569 (App等)描述的VEGFR拮抗剂是有机分子。此外，双特异性抗体(BsAbs) 是已知的，它是具有两种不同的抗原-结合特异性或位点的抗体，针对KDR(VEGFR-2)和 VEGFR-I0 见，例如，美国申请号 09/865，198 (Zhu) ；60/301，299 (Zhu)。Hennequin 等，在 J. Med. Chem. 42，5369-5389 (1999)中公开了某些可用作 VEGF 受 体拮抗剂的喹唑啉，喹啉和噌啉。见Annie等，Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and HumanRetrovirology 17， A41 (1998) 。 $ Hermequin的^1 中&Jf 的VEGF受体拮抗剂引入此处作为参考。此外，App等(USPN :5，849，742)公开了可作为酪氨酸激酶抑制剂起作用的喹唑啉，quinoxiline，取代苯胺，异噁唑，丙烯腈和苯基丙烯腈化合物。Hermequin等，Annie等 和App等描述的小分子也可作为本发明的VEGF受体拮抗剂。此外，确定VEGFR拮抗剂的测定法是本领域熟知的，因此，适用于本发明的侯选拮 抗剂可很容易地鉴定。本发明的VEGFR拮抗剂可抑制VEGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及 磷酸化事件。因此，磷酸化测定法可用于确定本发明的VEGFR拮抗剂。酪氨酸激酶活性的 某些测定法在 Panek 等，J. Pharmacol. Exp. Thera. ,283 :1433-44(1997)和 Batley 等，Life Sci. ,62 =143-50(1998)中描述。此外，还可使用特异性检测VEGFR表达的方法。抗体本发明的抗体可通过本领域已知的方法生产。这些方法包括免疫学方法，由 Kohler 和 Milstein, Nature, 256 :495-497(1975)和 Campbell，单克隆抗体技术，啮齿动 物和人类杂交瘤的生产和描述，Burdon等，Eds.，生物化学和分子生物学的实验室技术，13 卷，ElsevierScience Publishers, Amsterdam(1985)描述；以及 Huse 等，Science, 246, 1275-1281(1989)描述的重组DNA方法。本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体或任何其它适宜类型的抗体，如 抗体的片段或衍生物，单链抗体(scFv)或抗体的合成同系物，只要抗体具有与那些完整 抗体相同或相似的结合性。除非另有说明或可从上下文清楚地知道，此处所用的抗体的 结构域，区和片段与本领域熟知的标准定义一致。见，例如，Abbas等，细胞和分子免疫学， W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA(1991)。优选本发明的抗体是单克隆抗体。抗体片段可通过裂解完整抗体，或通过表达编码该片段的DNA产生。抗体片段 可通过 Lamoyi 等，J. Immunol. Methods, 56 :235-243(1983)禾口 Parham，J. Immunol. 131 2895-2902(1983)所述的方法制备。这种片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab，)2片段。 这种片段还可含有单链片段可变区抗体，即，scFv,双抗体，或其它抗体片段。生产这种功能 等同物的方法在PCT申请冊93/21319，欧洲专利申请号239，400 ；PCT申请WO 89/09622 ；欧 洲专利申请338，745 ；和欧洲专利申请EP 332，424中公开。单链抗体(scFv)是由使用或不用互连接头连接的抗体重链可变区和轻链可变区 组成的。因此，scFv含有完整的抗体结合位点。这些链可在细菌，或真核细胞中产生。单链 抗体的一个例子是picil。(见下面的实施例IX。)PlCll可阻断VEGF-KDR(VEGF-VEGFR-2) 的相互作用，抑制VEGF-刺激的受体磷酸化和HUVEC有丝分裂。这种scFv既可结合HUVEC 上的可溶性KDR(VEGFR-2)，又可结合细胞表面表达的KDR(VEGFR_2)。ρICll的序列如SEQ ID Νο:21所示。通过本领域已知的方法可把上述单链抗体构成嵌合抗体或人源化抗体，例 如，见下面的实施例ΙΧ-3。嵌合scFv的其中一个例子是嵌合plCll，S卩，c-plCll。优选所述抗体片段含有完整抗体的全部6个互补决定区，尽管片段所含的这种区 较少，如含有3个，4个或5个CDRs，但它也可以是功能性的。如果抗体太短以致不是免疫 原性的，那么它可与载体分子偶联。一些适宜的载体分子包括匙孔血蓝蛋白和牛血清白蛋 白。偶联可通过本领域已知的方法进行。本发明的抗体还包括可通过直接突变，亲和力成熟，噬菌体展示，或链混排方法提 高结合性的那些。通过使CDRs突变，并筛选具有所需特性的抗原结合位点，可修饰或改进 亲和性和特异性(见，例如，Yang等，J. Mol. Bio. ,254:392-403(1995))。CDRs是以各种方 法突变的。其中一个方法是使单个残基或残基的组合随机化，这样在其它相同的抗原结合位点群中，就可在特定位置找到全部20种氨基酸。可选择性地，突变可通过易错PCR方法， 在多种CDR残基上诱导(见，例如，Hawkins等，J. Mol. Bio.，226 :889-896 (1992))。含有重 链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体在大肠杆菌的增变菌株中繁殖(见，例如，Low等， J. Mol. Bio.，250 :359-368(1996))。这些诱变的方法只是本领域技术人员已知的多种方法 的举例说明。本发明的抗体还可以是具有一类物种，例如小鼠的抗体可变区，和不同物种，例如 人的抗体恒定区的嵌合抗体。可选择性地，本发明的抗体可以是人源化抗体，它具有来源于 其中一类物种，例如小鼠的抗体的高变或互补决定区(CDRs)，和人类抗体的构架可变区及 恒定区。可选择性地，本发明抗体可以是具有人类抗体恒定区和可变区的人类抗体。抗体，特别是单克隆抗体，可通过本领域已知的方法生产。生产抗体的实例 包括，但不限制于，在杂交瘤细胞中生产并用编码受体拮抗剂的DNA转化哺乳动物细 胞。这些方法在各种出版物中公开，包括免疫学方法，由Kohler和Milstein，Nature, 256 :495-497 (1975)和Campbell，“单克隆抗体技术，啮齿动物和人类杂交瘤的生产和 描述”，Burdon等，Eds.，生物化学和分子生物学的实验室技术，13卷，Elsevier Science Publishers, Amsterdam(1985)；和 Huse 等在 kience，246 :1275-U81 (1989)中描述的重 组DNA方法。抗体等同物也可通过本领域已知的方法制备。例如，抗体片段可从完整抗体酶促 制备。优选，抗体等同物是从编码这种等同物的DNA制备的。编码抗体片段的DNA是通过 使除编码全长抗体的DNA所需部分之外的部分缺失而制备的。编码嵌合抗体的DNA可通过 使编码人恒定区的DNA重组而制备，它们基本上或仅仅来源于相应的人抗体区，还可通过 使编码可变区的DNA重组而制备，它们基本上或仅仅来源于除人之外的哺乳动物可变区序 列。编码人源化抗体的DNA可通过使编码除互补决定区(CDRs)之外的恒定区和可变区的 DNA重组而制备，它们基本上或仅仅来源于相应的人抗体区，还可通过使编码⑶Rs的DNA重 组而制备，它们基本上或仅仅来源于除人之外的哺乳动物。编码抗体片段的DNA分子的适宜来源包括细胞，如杂交瘤，它可表达全长抗体。该 片段自身可被用作抗体等同物，或按照上面所述被重组成等同物。这部分描述的DNA缺失 和重组可通过已知方法进行，如在名为“抗体的功能等同物”部分所列的专利申请中公开的 那些，和/或其它标准重组DNA技术，如下面描述的那些。用于进行载体转化和本发明受体拮抗剂表达的优选宿主细胞是哺乳动物细胞，例 如，C0S-7细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和淋巴来源的细胞系，如淋巴瘤，骨髓瘤，或杂交 瘤细胞。也可选择性使用其它真核宿主，如酵母。例如，小鼠胎儿肝基质细胞系2018可结 合 AP 标记-flkl 和 Ap 标记-flk-2 融合蛋白，即，含有 VEGFR-2 和 flk-2 (ATCC,Manassas, VA, CRL 10907)的配体，人胎儿脾细胞系Fsp 6沘91含有f lk_2配体(ATCC CRL 10935), ^P 人基质胎儿胸腺细胞系，F. thy62891含有VEGFR-2配体(ATCC CRL 10936)。转化的宿主细胞是利用本领域已知的方法在液体培养基中培养的，所述液体培养 基含有可同化的碳源(碳水化合物，如葡萄糖或乳糖)，氮源(氨基酸，肽，蛋白或它们的降 解产物，如胨，铵盐等)，和无机盐(钠，钾，镁和钙的硫酸盐，磷酸盐和/或碳酸盐)。此外， 培养基还含有，例如，促进生长的物质，如微量元素，例如，铁，锌，锰等。当需要在酵母中表达基因构建体时，用于酵母中的适宜选择基因是存在于酵母质粒 YRp7 中的 trpl 基因。Stinchcomb 等，Nature, 282 :39(1979) ；Kingsman 等，Gene, 7 141(1979)。trpl基因可为酵母突变株提供选择标记，所述酵母缺乏在色氨酸中生长的能 力，例如，ATCC No. 44076 或 PEP4-1。Jones，Genetics，85 12 (1977)。酵母宿主细胞基因 组中trpl的损害可为通过在色氨酸缺乏情况下的生长而检测转化提供有效的环境。同样， Leu2-缺陷酵母株(ATCC 20，622或38，626)是由含有Leu2基因的已知质粒补充的。可选择性地，编码受体拮抗剂的DNA可被克隆到来源于病毒，如腺病毒腺伴随病 毒，疱疹病毒，逆转录病毒或慢病毒的载体中。基因表达可由诱导型或非诱导型调节序列控 制。简单地说，选择含有表达所需DNA，如抗体，抗体等同物或VEGF受体的核酸分子的 适宜细胞来源。总RNA是通过标准过程从适宜来源制备的。总RNA用于指导cDNA合成。分 离RNA及合成cDNA的标准方法在分子生物学的标准手册中提供，例如，上述那些。cDNA可通过已知方法扩增。例如，cDNA可被用作通过聚合酶链反应(PCR)进行扩 增的模板；见 Saiki 等，Science, 239,487 (1988)或 Mullis 等，美国专利 4，683，195。进行 PCR扩增的寡核苷酸引物序列来源于被扩增的已知序列。寡核苷酸是通过本领域已知的方 法合成的。话宜的方法包括由Caruthers在Science230, 281-285 (1985)描述的那些。PCR扩增使用上游和下游寡核苷酸的混合物。按照标准过程，根据每个特定的引物 对优化条件。利用电泳分析PCR产物的cDNA，所述cDNA具有与引物间序列相对应的适宜大 小。可选择性地，编码区可在两个或多个重叠片段中扩增。重叠片段被设计成包括一个限 制性位点，从而使片段的完整cDNA组装。为了分离VEGF受体完整的蛋白编码区，例如，上游的PCR寡核苷酸引物与5’端的 序列互补，优选含有ATG起始密码子和起始密码子的至少5-10个上游核苷酸。下游的PCR 寡核苷酸引物与所需DNA序列的3’端序列互补。所需DNA序列优选编码VEGF受体的整个 胞外部分，且任选编码跨膜区的全部或一部分，和/或胞内区的全部或一部分，包括终止密 码子。扩增的DNA，如编码抗体，抗体等同物，或VEGF受体的DNA可在各种宿主细胞中的 各种克隆载体中复制。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。其中剪接DNA的载体可含有染色体，非-染色体及合成DNA序列的片段。一些适 宜的原核克隆载体包括来源于大肠杆菌的质粒，如colEl，pCRl，pBR322, pMB9, pUC，pKSM， 和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA的衍生物，如M13和其它丝状单链DNA噬菌体。用于克 隆编码VEGF受体的核酸的优选载体是杆状病毒载体。把含有所要表达的DNA的载体转染到适宜的宿主细胞中。宿主细胞在适宜的培养 基中维持，并在细胞和载体复制的条件下生长。载体可从细胞回收。所要表达的DNA可从 载体回收。所要表达的DNA，如编码抗体，抗体等同物，或受体的DNA被插入到适宜的表达载 体中，并在适宜的原核或真核细胞中表达。例如，插入到宿主细胞中的DNA可编码VEGF受体的整个胞外部分，或编码VEGF受 体胞外部分的可溶性片段。DNA编码的VEGF受体胞外部分任选在5’端或3’端或两个末 端与附加氨基酸序列连接。附加氨基酸序列可与VEGF受体的胞外区连接，如VEGF受体的 前导序列，跨膜区和/或胞内区。附加氨基酸序列也可以是不与VEGF受体连接的序列。优选，这种附加氨基酸序列可发挥特殊的作用，如提高表达水平，分泌，溶解性，或免疫原性。用于在细菌，特别是大肠杆菌中表达蛋白的载体是已知的。这种载体包括由 Dieckmann 和 iTzagoloff 在 J. Biol. Chem. 260,1513-1520(1985)中描述的 PATH 载体。这些 载体含有编码邻氨基苯甲酸盐合成酶(TrpE)的DNA序列，然后是羧基末端多接头。其它表 达载体系统是以半乳糖苷酶(PEX) ；麦芽糖结合蛋白(pMAL)；和谷胱甘肽S-转移 酶(pGST)为基础的，见 Gene 67,31(1988) ^P PeptideResearch 3,167(1990) 在酵母中使用的载体也是可用的。适宜的例子是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的适宜载体也是已知的。这种载体包括熟知的SV-40 衍生物，腺病毒，逆转录病毒衍生的DNA序列和来源于功能性哺乳动物载体组合的穿梭载 体，如上面描述的那些，和功能性质粒及噬菌体DNA。其它真核表达载体是本领域已知的(例如，P. J. Southern和P. Berg，J. Mo 1. App 1. Genet.，丄，327-341 (1982) ；Subramani 等，Mol. Cell. Biol.，1 :854-864(1981) ；Kaufmann 和Siarp，“用调节物二氢叶酸盐还原酶互补DNA基因共转染的序列的扩增和表达”，J. Mol. Biol.159,601-621 (1982) ；)Kaufmann 和 Sharp, Mol.Cell.Biol.159,601-664(1982)； Scahill等，“中国仓鼠卵巢细胞中人免疫干扰素DNA基因产物的表达和描述”，Proc. Nat，IAcad. Sci. USA迎，4654-4659 (1983) ；UrIaub 和 Chasin，Proc. Nat，IAcad. Sci. USA77, 4216-4220， (1980)。本发明所用表达载体含有至少一个表达控制序列，它与所要表达的DNA序列或片 段可操作性连接。把控制序列插入到载体中，从而控制并调节克隆DNA序列的表达。有效 的表达控制序列的例子是Iac系统，trp系统，tac系统，trc系统，噬菌体λ的主要操纵子 和启动子区，fd外被蛋白的控制区，酵母的糖酵解启动子，例如，3-磷酸甘油酸激酶的启动 子，酵母酸磷酸酶的启动子，例如，Pho5，酵母α-交配因子的启动子，和来源于多形瘤，腺 病毒，逆转录病毒，和猿猴病毒的启动子，例如，早期和晚期启动子或SV40，和其它序列，已 知它们可控制原核或真核细胞和它们的病毒或其组合的基因表达。把含有控制信号和所要表达的DNA，如编码抗体，抗体等同物，或VEGF受体的DNA 的载体插入到宿主细胞中进行表达。一些有效的表达宿主细胞包括熟知的原核及真核细 胞。某些适宜的原核宿主包括，例如，大肠杆菌，如大肠杆菌SG-936，大肠杆菌ΗΒ101，大肠 杆菌W3110，大肠杆菌Χ1776，大肠杆菌，大肠杆菌DHI，和大肠杆菌MRCl，假单胞菌属， 杆菌属，如枯草杆菌，和链霉菌属。适宜的真核细胞包括组织培养物中的酵母和其它真菌， 昆虫，动物细胞，如COS细胞和CHO细胞，人类细胞和植物细胞。在维持于适宜培养基中的宿主细胞中表达之后，可从培养基中分离所要表达的多 肽或肽，如编码抗体，抗体等同物，或VEGF受体的多肽或肽，并利用本领域已知的方法进行 纯化。如果多肽或肽没有分泌到培养基中，那么在分离和纯化之前，要先溶解宿主细胞。此外，本发明的抗体可通过使用可溶性受体给哺乳动物免疫接种而制备。所述可 溶性受体自身可被用作免疫原，或与载体蛋白或其它物体，如珠子，即，琼脂糖珠连接。在 哺乳动物产生抗体之后，分离产生抗体的细胞混合物，如脾细胞。单克隆抗体可通过从混合 物中分离产生抗体的各个细胞，并通过把细胞与肿瘤细胞，如骨髓瘤细胞融合使它们无限 增殖而制备。所得杂交瘤保存在培养基中，并表达单克隆抗体，它们是从培养基中采集的。抗体还可从与细胞表面结合的受体制备，所述细胞可表达目标特异性受体。与受体结合的细胞可以是天然表达受体的细胞，如用于表达VEGFR的血管内皮细胞。可选择性 地，与受体结合的细胞可以是其中已经转染了编码受体的DNA的细胞，如3T3细胞，它已经 用VEGFR转染。受体可被用作免疫原，从而得到本发明的抗体。受体肽可从天然来源获得，如从表 达受体的细胞获得。例如，VEGF受体肽可从血管内皮细胞获得。可选择性地，合成的受体 肽可使用市售的机器制备。在这种实施方案中，fIt-I (VEGFR-I)的VEGF受体氨基酸序列 例如由 Shibuya 等在 Oncogene 5,519-524(1990)中提供；KDR(VEGFR_2)的 VEGF 受体氨基 酸序列由 PCT/US92/01300 和 iTerman 等，0ncogene6 :1677-1683(1991)提供；f Ik-I 的 VEGF 受体氨基酸序列由 Mattews 等，Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA,88 :9026-9030(1991)提供。作为又一个选择，编码受体的DNAJn cDNA或其片段可被克隆并表达，回收所得多 肽，将其用作免疫原，从而得到本发明的抗体。例如，为了制备针对抗体的VEGF受体，可使 用标准重组DNA技术，如下面描述的那些，把编码本发明VEGF受体的核酸分子，或其一部 分，特别是其胞外部分插入到用于在宿主细胞中表达的已知受体中。这种核酸分子的适宜 来源包括表达VEGF受体的细胞，即，血管内皮细胞。抗体可在任何哺乳动物中制备；除人之外的适宜哺乳动物包括，例如，兔，大鼠，小 鼠，马，山羊，或灵长类动物。优选小鼠。抗体可以是下列其中一类免疫球蛋白的成员IgG， IgM，IgA，IgE，及其亚类，优选IgGl抗体。本发明的抗体及其等同物可以是任何一类免疫球 蛋白的成员或其组合。非抗体VEGFR拮抗剂除了上面讨论的抗体，或抗体的功能等同物之外，本发明所用受体拮抗剂还可以 是其它生物分子和小分子，特别是与上述疗法联合。生物分子包括所有脂类和单糖聚合物，氨基酸及分子量大于450的核苷酸。因此， 生物分子包括，例如，寡糖和多糖；寡肽，多肽，肽，和蛋白；及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷 酸和多核苷酸包括，例如，DNA和RNA。生物分子还包括上述任何一种分子的衍生物。例如，生物分子的衍生物包括脂类 和寡肽，多肽，肽及蛋白的糖基化衍生物。生物分子的衍生物还包括寡糖和多糖的脂类衍生 物，例如，脂多糖类。在本说明书中，不是生物分子的任何分子都被认为是小分子。本发明的小分子是 具有碳和氢原子，及杂原子的物质，其中杂原子包括，但不限制于，氮，硫，氧和磷。小分子中 的原子经由共价键和离子键连接；前者通常用于小的有机化合物，例如，小分子酪氨酸激酶 抑制剂，如Iressa 和Tarceva ，后者通常用于小的无机化合物。小的有机分子中的原子排 列可以是一个链，例如，碳-碳链或碳-杂原子链，或含有碳原子的环，例如，苯，或碳与杂原 子的组合，即，杂环，例如，嘧啶或喹唑啉。与环系统连接的小的有机分子中一个或多个链的 结合构成取代的环系统，两个环的稠合构成稠合的多环系统，它们可被简单称作多环系统， 其中一个例子是Iressa 的母体构架。小分子包括天然存在的化合物，如激素，神经递质， 核苷酸，氨基酸，糖，脂类，及其衍生物，和通过常规的有机合成，生物合成，或其组合合成的 那些化合物。见，例如，Ganesan，Drug Discov. Today, 7(1) :47-55 (2002 年 1 月)；Lou，Drug Discov.Today,6(24) :1288-1294(2001 年 12 月)。小分子的某些例子包括有机化合物，有机金属化合物，有机化合物和有机金属化合物的盐，糖，氨基酸，核苷及核苷酸。应当强调的是，小分子可具有任何分子量。它们被称 作小分子仅仅是因为它们的分子量通常小于450。小分子包括天然存在的化合物及合成的 化合物。小分子和生物药对人类患者的给药是通过本领域已知的方法进行的。对于小分子 而言，这种方法的例子在Spada，美国专利5，646，153第57栏第47行-第59栏第67行描 述。给予小分子的描述引入此处作为参考。中和VEGF受体的VEGF活化内皮或非内皮细胞，如肿瘤细胞样品中VEGF受体活化的中和可在体外或体内进 行。中和VEGF-受体表达细胞样品中VEGF受体的VEGF活化包括使细胞与本发明的拮抗剂， 例如抗体接触。细胞是在把VEGF加入到细胞样品中之前，同时，或之后，在体外与拮抗剂， 例如抗体接触的。本发明的拮抗剂，例如抗体与VEGF受体的体内接触是通过把它给予哺乳动物而 实现的。给予哺乳动物的方法包括，例如，口服，静脉内，腹膜内，皮下，或肌内给药。这种体内中和法可用于抑制哺乳动物血管发生。血管发生的抑制是一种有效的治 疗方法，如用于预防或抑制与病理状况，如肿瘤生长有关的血管发生。因此，本发明的拮抗 剂，例如抗体是抗-血管发生并抗肿瘤的免疫治疗剂。术语哺乳动物是指任何哺乳动物。哺乳动物的一些例子包括宠物，如狗和猫；饲养 动物，如猪，牛，绵羊和山羊；实验室动物，如小鼠和大鼠；灵长类动物，如猴，无尾猿，黑猩 猩 ’及人类。VEGF受体可在某非-内皮细胞，如肿瘤细胞上找到，表明自分泌和/或旁分泌环在 这些细胞中的意外存在。本发明的拮抗剂，例如，抗体可中和这种细胞上VEGF受体的活性， 由此阻断自分泌和/或旁分泌环，并抑制肿瘤生长。抑制哺乳动物血管发生及病理状况，如肿瘤生长的方法包括全身给予哺乳动物， 或直接给予哺乳动物内的肿瘤有效量的本发明任何一种拮抗剂，例如抗体，包括其任何一 种功能等同物。哺乳动物优选人。该方法可有效治疗患有实体瘤，优选血管瘤，和非实体瘤 的患者。肿瘤生长的抑制或减轻包括阻止或抑制肿瘤，如癌性肿瘤或非癌性肿瘤的进展。 肿瘤的进展包括侵入，转移，复发和肿瘤大小的增力卩。肿瘤生长的抑制或减轻还包括破坏肿瘤。所有类型的肿瘤都可通过本发明的方法进行治疗。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤。可用本发明拮抗剂治疗的实体瘤的一些例子包括癌，肉瘤，胚细胞瘤或神经胶质 瘤。这种肿瘤的一些例子包括表皮样肿瘤，鳞状细胞肿瘤，如头和颈部肿瘤，结肠直肠肿瘤， 前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤，包括小细胞和非-小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤， 卵巢肿瘤，和肝肿瘤。其它例子包括卡波济氏肉瘤，CNS肿瘤，成神经细胞瘤，毛细血管成血 管细胞瘤，脑膜瘤和脑转移瘤，黑素瘤，胃肠癌和肾癌，及肉瘤，横纹肌肉瘤，成胶质细胞瘤， 优选多形性成胶质细胞瘤，和平滑肌肉瘤。可使用本发明拮抗剂有效治疗的血管化皮肤癌 的例子包括鳞状上皮细胞癌，基底细胞癌，和皮肤癌，它们通过抑制恶性角质形成细胞，如 人恶性角质形成细胞治疗。
非实体瘤的一些例子包括白血病，多发性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些例子包 括急性髓细胞性白血病(AML)，慢性髓细胞性白血病(CML)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)， 慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，红细胞性白血病或单核细胞性白血病。淋巴瘤的一些例子包 括与何杰金氏病和非何杰金氏病有关的淋巴瘤。随后描述的实验结果证实，本发明的抗体可特异性阻断VEGF诱导的，在转染的 3T3细胞中表达的，小鼠胞外flk-1 (VEGFR-2) (VEGFR-幻/胞内fms嵌合受体的磷酸化。所 述抗体对CSF-I完全刺激的嵌合胞外fms/胞内FLK-2受体没有作用。下面所述的体内研 究表明，所述抗体可显著抑制裸鼠的肿瘤生长。VEGF受体拮抗剂，例如，单克隆抗体的混合物可为抑制肿瘤细胞生长提供一种特 别有效的方法。该混合物可含有少至2，3或4种抗体，多至6，8或10种抗体。预防或抑制血管发生还可用于治疗特征在于过量血管发生的非瘤性病理疾病，如 新血管性青光眼，增生性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病，关节炎，黄斑变性，血管 瘤，血管纤维瘤，和牛皮癣。使用本发明的拮抗剂分离并纯化VEGF受体使用常规方法，如亲和色谱法，本发明的拮抗剂可用于分离并纯化VEGF受体 (Dean 等，Affinity Chromatography :A PracticalApproach, IRL Press， Arlington， VA(1985))0本领域熟知的其它方法包括使用抗体包被的磁珠的磁性分离技术，使用与固体 基质连接的抗体的“淘选”技术，和流式细胞术。VEGF受体的来源通常是血管细胞，特别是血管内皮细胞，它可表达VEGF受体。血 管内皮细胞的适宜来源是血管，如脐带血细胞，特别是人脐带血管内皮细胞(HUVEC)。VEGF受体可用作生产其它物质的起始材料，如用于制造其它单克隆和多克隆抗体 的抗原，所述抗体可识别并结合VEGF受体或表达VEGF的细胞表面上的其它抗原。使用本发明的拮抗剂分离并纯化flk-1 (VEGFR-2)阳性肿瘤细胞使用常规方法，如亲和色谱法，本发明的拮抗剂可用于分离并纯化 flk-1 (VEGFR-2) (VEGFR-2)阳性肿瘤细胞，S卩，表达flk_l (VEGFR-2)受体的肿瘤细胞(Dean 等，Affinity Chromatography :APractical Approach,IRL Press,Arlington,VA(1985))。 本领域熟知的其它方法包括使用抗体包被的磁珠的磁性分离技术，细胞毒性剂，如与抗体 偶联的补体，使用与固体基质连接的抗体的“淘选”技术，和流式细胞术。体外或体内监测VEGF和VEGF受体的水平使用标准测定法和本领域已知的方法，本发明的拮抗剂，例如抗体可用于在体外 或体内监测生物样品中VEGF或VEGF受体的水平。生物样品的一些例子包括体液，如血液。 标准测定法包括，例如，标记抗体并进行标准免疫测定法，如本领域熟知的放射性免疫测定法。用于进行本发明的标准重组DNA技术由Sambrook等，在“分子克隆”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987)中和 Ausubel 等(Eds.)在“分子生物学的当前 方案”，Green Pub lishingAssociates/ffi ley-Inter science, New York (1990)中描述。给药为进行治疗，可把本发明的受体拮抗剂给予肿瘤患者，给药量足以预防，抑制，或 减轻肿瘤的进展，例如，肿瘤的生长，侵入，转移和/或复发。足以达到这一目的的量被定义 为治疗有效量。用于这种用途的有效量取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状况。给药方案还可根据疾病状况和患者的状态而改变，通常每天给药一次或连续输注多 次给药(例如，每隔4-6小时)，或由主治医生根据患者的情况决定。然而，应当注意，本发 明不限于任何特定的剂量。本发明可用于治疗任何适宜的肿瘤，包括，例如，乳腺，心脏，肺，小肠，结肠，脾， 肾，膀胱，头和颈，卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾丸，子宫颈或 肝的肿瘤。优选，当肿瘤是结肠肿瘤或非小细胞肺癌(NSCLC)时，使用本发明的方法。此外，本发明的肿瘤优选过量表达EGFR。在很多人类肿瘤中，都能检测到升高的 EGFR 表达；例如，头和颈(80-100% )，结直肠(25-77% )，胰腺(30-50% ) J^ (40-80% ), 食管03-89%)，肾细胞(50-90 % )，前列腺(65%)，膀胱(31-48 ，子宫颈/子宫 (90% )，卵巢(35-70% )和乳腺(14-91% )。EGFR的表达已被证实是预后不良，存活率降 低，和某些肿瘤类型转移增加的指标。此外，本发明的肿瘤优选具有VEGFR的异常表达或信号传递。VEGFR信号传递的 提高可在多种不同的人类癌症中观察到。高水平VEGFR-2是由浸润神经胶质瘤的内皮细胞 表达的(Plate等，(1992)Nature359 :845-848)。VEGFR-2的水平可由人成胶质细胞瘤产生 的 VEGF 特异性上调(Plate 等，(199 Cancer Res. 53 :5822-5827)。VEGFR-2 在成胶质细 胞瘤相关性内皮细胞(GAEC)中的高水平表达表明，受体活性很可能是在肿瘤形成过程中 被诱导的，这是因为在正常的脑内皮细胞中，几乎检测不到VEGFR-2的转录物。这种上调被 限定在与肿瘤邻近的血管内皮细胞。本发明可用于抑制或减轻肿瘤生长。肿瘤生长的抑制或减轻是指预防，抑制，或减 轻肿瘤的发展，例如肿瘤的生长，侵入，转移和/或复发。此外，本发明还可用于治疗血管发 生状况，如动脉粥样硬化，关节炎，黄斑变性和牛皮癣。对于所患状况可用本发明进行治疗 的那些患者的鉴定是本领域技术人员能力和知识范围之内的事情。在本发明中，任何适宜的方法或途径都可用于给予EGFR拮抗剂和/或VEGFR拮抗 剂，例如，口服，静脉内，腹膜内，皮下，或肌内给药。拮抗剂的给药剂量取决于多种因素，包 括，例如，拮抗剂的类型，所治疗肿瘤的类型和严重程度，以及拮抗剂的给药途径。然而，应 当强调的是，本发明不限于任何一种特定的给药方法或途径。在其中一个选择性实施方案中，EGFR拮抗剂和VEGFR拮抗剂可与一种或多种抗肿 瘤剂联合给药。见，例如，美国专利号6，217，866 (khlessinger等)(抗EGFR抗体与抗 肿瘤剂联合给药)；美国申请号09/312，286 (Waksal等)(抗EGFR抗体与放疗联合治疗)。 任何适宜的抗肿瘤剂都可使用，如化疗剂或放疗。化疗剂的例子包括，但不限制于，顺钼，阿 霉素，紫杉醇，伊立替康(CPT-Il)，拓扑替康或其组合。当抗肿瘤剂是指进行放疗时，放射 源对于所治疗的患者而言，可以是外在的(外在光束放疗-EBRT)或内在的(近程放射治 疗-BT)。抗肿瘤剂的给药剂量取决于多种因素，包括，例如，药剂的类型，所治疗肿瘤的类型 和严重程度，及药剂的给药途径。然而，应当强调的是，本发明不限制于任何特定的剂量。在其它选择性实施方案中，EGFR拮抗剂和VEGFR拮抗剂可与一种或多种适宜的佐 剂，例如，细胞因子(例如，IL-10和IL-13)或其它免疫刺激剂联合给药。见，例如，LarriWe 等，supra.然而，应当理解，仅给予EGFR拮抗剂和VEGFR拮抗剂的治疗有效方式就足以预 防，抑制，或减轻肿瘤的进展。此外，EGFR拮抗剂和/或VEGFR拮抗剂可作为配体偶联物给药，它特异性结合受体，并在配体-毒素内化后，传递中毒性致死负荷量。毒素和受体间的偶联物是为了研究 对EGFR-或VEGFR-过量表达的肿瘤细胞特异的毒剂，同时使非特异性毒性达到最小而设计 的。例如，由EGF和假单胞菌内毒素(PE)组成的偶联物在体外对表达EGFR的HeLa细胞是 毒性的。各种药剂，包括硫利达嗪和腺病毒，都可提高细胞对偶联物的摄取，并增加偶联物 的细胞毒性。应当理解，为预防或治疗目的而用于哺乳动物中的本发明的EGFR和/或VEGFR 拮抗剂可以组合物的形式给药，所述组合物还含有药学上可接受的载体。适宜的药学上可 接受的载体包括，例如，水，生理盐水，磷酸盐缓冲的盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等的一种或多 种，及其组合。药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂，防腐剂 或缓冲剂，它们可提高结合蛋白的保存期或有效性。正如本领域熟知的，可把组合物配制成 注射液，从而在给予哺乳动物后，快速，持续或延迟释放活性成分。本发明的EGFR拮抗剂和/或VEGFR拮抗剂可以是各种形式。这些形式包括，例如， 固体，半-固体和液体剂型，如片剂，丸剂，粉剂，液体溶液，分散液或混悬液，脂质体，栓剂， 可注射和可输注的溶液。优选形式取决于目标给药模式和治疗应用。这种拮抗剂可按照制药领域熟知的方法制备。在制造组合物时，活性成分通常与 载体混合，或用载体稀释，和/或封在载体内，例如，封入胶囊，药袋，纸或其它容器中。当载 体作为稀释剂使用时，它可以是固体，半-固体，或液体材料，它还可作为活性成分的载体， 赋形剂或介质。因此，组合物可以是片剂，锭剂，药袋，扁囊剂，酏剂，混悬液，气溶胶(固体 或液体基质)，含有10重量％活性化合物的软膏剂，软明胶胶囊和硬明胶胶囊，栓剂，注射 液，悬浮液，无菌包装的粉剂和局部用药膏。抑制肿瘤生长的试剂盒本发明还包括抑制肿瘤生长的试剂盒，试剂盒中含有治疗有效量的EGFR拮抗剂 和治疗有效量的VEGFR拮抗剂。本发明试剂盒的EGFR或VEGFR拮抗剂可以是任何适宜的拮 抗剂，它们的例子已经在上面描述。优选，试剂盒的EGFR拮抗剂包含对EGFR特异的抗体，或 其功能等同物。可选择性地，还优选试剂盒的EGFR拮抗剂包含对EGFR特异的小分子。试 剂盒的VEGFR拮抗剂优选包含对VEGFR特异的抗体，或其功能等同物。可选择性地，试剂盒 的VEGFR拮抗剂优选包含对VEGFR特异的小分子。此外，本发明的试剂盒还可含有抗肿瘤 剂。本发明适宜的抗肿瘤剂的例子已经在这里描述。本发明的试剂盒还可含有佐剂，它们 的例子也已经在上面描述。因此，本发明的受体拮抗剂可用于体内体外的研究，诊断，预防或治疗方法，它们 是本领域熟知的。当然，应当了解并预期本领域的技术人员可根据这里公开的本发明原理 进行改变，这种改变也落在本发明的范围之内。这里提到的所有参考文献全部引入此处作为参考。实施例提出下列实施例的目的是为了帮助理解本发明，而不是，也不应被解释为以任何 方式限制本发明的范围。实施例中不包括常规方法的详细描述，例如在构建载体和质粒， 把编码多肽的基因插入到这种载体和质粒中，或把质粒引入到宿主细胞中时所用的那些方 法。这种方法是本领域那些普通技术人员熟知的，而且已经在很多公开出版物中描述，包 Sambrook, J.，Fritsch，E. F.和Maniatis，T. (1989)分子克隆实验室指南，第二版，ColdSpring Harbor LaboratoryPress0实施例1.细胞系和培养基NIH 3T3细胞是从美国典型培养物保藏中心(Rockville MD)获得的。C441细胞系 是用嵌合受体小鼠flk-1 (VEGFR-幻/人fms转染3T3细胞构建的。10A2是含有嵌合受体人 fms/小鼠FLK-2的3T3转染子，它的分离和特性已经描述过(Dosil等，Mol. Cell. Biol. 13 6572-6585(1993))。细胞通常维持在Dulbecco，s改良Eagle，s培养基(DME)中，其中补 充了 10%小牛血清(CS), ImM L-谷氨酰胺，抗生素，和 600 μ g/ml G418 (Geneticin ；Sigma, St Louis MO)。成胶质细胞瘤细胞系，GBM-18维持在补充了 5%小牛血清，ImM L-谷氨酰胺，和抗 生素的DME中。生产分泌可溶性嵌合蛋白，小鼠flk-1 (VEGFR-2) =SEAPs (分泌型碱性磷酸酶)的 稳定3T3系，并把它维持在DMEM和10%小牛血清中。收集条件培养基。从条件培养基中分 离出可溶性 flk-1 (VEGFR-2) :SEAP。实施例II.单克隆抗体的分离实施例II-1.大鼠抗小鼠flk-1 (VEGFR-2)单克隆抗体DC-101 (IgGl)用免疫复合物使Lewis大鼠(Charles River Labs)超免疫，所述免疫复合物含有 小鼠flk-1 =SEAPs可溶性受体，兔抗-碱性磷酸酶多克隆抗体和G蛋白琼脂糖珠。动物在 3个月内，腹膜内注射7次这种复合物(第0，14，21，28，49，63，77天)。在不同的时间，从 动物尾静脉采集血液，并通过ELISA筛选与mflk-1 (VEGFR-2) =SEAPs高滴定度结合的免疫 血清。最后一次注射5天后，杀死大鼠，无菌除去脾脏。洗涤脾细胞，计数，并与鼠骨髓瘤细 胞系NSl以2 1的比例融合。在HAT培养基中选择杂交瘤，并通过ELISA筛选特异性结 合mflk-1 (VEGFR-2) SEAPs而不结合SEAPs蛋白的集落。许多阳性杂交瘤进一步扩增并 通过限制稀释而被克隆三次。下面研究其中一个被称为DC-IOl的亚克隆。实施例II-2小鼠抗小鼠flk-1 (VEGFR-2)单克隆抗体Mab25和Mab73鼠抗flk-1 (VEGFR-2)单克隆抗体(Mabs)是按照与DC-101所用类似的方法生产 的。简单地说，使用结合抗SEAP-蛋白/A琼脂糖复合物或来源于转染NIH 3T3细胞条件 培养基的小麦胚凝集素琼脂糖的flk-1 (VEGFR-2)/SEAP可溶性受体给小鼠注射。6个月 内，定期使小鼠超免疫。收集免疫脾细胞，与鼠骨髓瘤细胞系NSI融合。在HAT培养基中 选择杂交瘤，温育之后，筛选产生小鼠Mab的集落。与DC-IOl所用的方法不同，首先筛选 结合flk-1 (VEGFR-2)/fms受体的阳性上清液，所述受体捕获自ELISA平板上的C441细 胞溶解产物，所述ELISA平板包被有针对fms C-末端区的肽产生的多克隆抗体。然后通 过ELISA测定与完整C441细胞，和纯化f lk_l (VEGFR-2) /SEAP及单独的SEAP结合的活性 Mabs。使结合C441，与flk_l (VEGFR-2) /SEAP反应，而不与SEAP反应的杂交瘤上清液扩增， 在腹水中生长，并纯化(EZ-PREP，Pharmacia)。在C441细胞上对纯化的Mabs进行测定， 通过FACS测定它们的细胞表面结合能力，并在磷酸化测定法中测定它们抑制VEGF诱导的 flk-1 (VEGFR-2)/fms活化的能力。这些研究的结果得到了 Mabs25和73的克隆(同种型 IgGl)，用于根据它们特异性结合flk-1 (VEGFR-2)，以及以与DC-IOl相似的水平阻断受体 活化的能力而进一步进行表征。实施例III测定法
实施例II1-1. ELISA 方法抗体是通过固态ELISA筛选的，其中比较了各种mAbs与flk-l(VEGFR_2) =SEAP 和SEAP蛋白的结合特征。50-100ng/孔，用ρΗ9· 6碳酸盐缓冲液中的flk-1 =SEAP或AP 包被微量滴定板，4°C过夜。37°C时，用补充有10%新生小牛血清(NBlO)的磷酸盐缓冲盐 水封闭平板1小时。37°C时，把杂交瘤上清液或纯化抗体加入到平板中温育2小时，然后 加入与辣根过氧化物酶(Tago)偶联的山羊抗-大鼠IgG温育1小时。充分洗涤后，加 入TMB (Kirkegaard和Perry，Gaithersburg MD)和过氧化氢作为色原，在ELISA阅读器的 450nm处对平板读数。实施例II1-2同种型分析各单克隆抗体的同种型分析是按照先前所述(SongsakphisarmR.和Goldstein， N. I.，Hybridoma 12 :343-348,1993)使用大鼠同种型特异性试剂(Zymed Labs, South San Francisco CA)进行的。实施例II1-3磷酸化，免疫沉淀和免疫印迹测定法对前述方法(Tessler等)进行改进后，使用C441和10A2细胞进行磷酸化测定和 蛋白质印迹分析。简单地说，细胞在DME-10% CS中生长至90%汇合，然后在实验前，使血 清在DME-0. 5% CS中饥饿M小时。HUVEC细胞在EGM基础培养基中生长至亚汇合。对于 中和测定法而言，在有和没有mAb DC-101存在时，在没有血清的条件下(DME-0. 1 % BSA)， 用各种浓度的适宜配体室温刺激细胞15分钟。配体VEGF和CSF-I分别以10-80ng/ml和 20-40ng/ml的浓度进行测定。单克隆抗体以0. 5 μ g/ml-10 μ g/ml的浓度测定。为了评估 mAb DC-101对VEGF诱导的flk_l (VEGFR-2) -fms受体活化的作用，同时加入抗体(竞争性 抑制)或在加入配体之前，使抗体与细胞预结合15分钟。没有和有DC-101存在时，在没有 血清的培养基中温育的细胞分别用作没有和有抗体存在时的受体自磷酸化的对照。使表达 fms/FLK-2嵌合受体(10A2)的对照细胞系饥饿，用20和40ng/ml CSF-I刺激，在有和没有 5μ g/mlDC-101存在的情况下测定。刺激后，用含有ImM原钒酸钠的冰冷PBS洗涤细胞单层。然后，把细胞溶解在 溶解缓冲液(20mM Tris-HCl, ρΗ7· 4，1 % Triton X-100，137mM NaCl，10 % 甘油，IOmM EDTA，2mM 原钒酸钠，IOOmM NaF，IOOmM 焦磷酸钠，5mM Pefabloc (Boehr inger Mannheim Biochemicals, Indianapolis I N))，100 μ g 抑肽酶和 100 μ g/ml 亮抑蛋白酶肽)中， 14000xg离心10分钟。利用多克隆抗体，使蛋白从转染细胞的澄清溶解产物中免疫沉淀 出来，其中所述多克隆抗体是由与人fms受体C-末端区(Tessler等，J. Biol. Chem. 269, 12456-12461,1994)或与A蛋白琼脂糖珠偶联的鼠FLK-2内激酶结构域(Small等，Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA，91，459-463，1994)相对应的肽产生的。与 DC-101 或无关大鼠 IgG 的免疫沉淀是用10μ g与G蛋白珠偶联的抗体进行的。然后用0. 2% Triton X-100, IOmM Tris-HCl ρΗ8. 0,150mM NaCl，2mMEDTA(缓冲液 Α)洗涤珠子一次，用含有 500mM NaCl 的缓 冲液A洗涤珠子两次，用Tris-HCl，pH8. 0洗涤珠子两次。把滴干的珠子与30 μ 12xSDS加 样缓冲液混合，并在4-12%梯度凝胶(Novex，San Diego CA)中经过SDS PAGE。进行电泳 后，把蛋白印在硝酸纤维素滤膜上进行分析。使滤膜在含有5%牛血清白蛋白和10%脱脂 奶粉(Bi or ad, CA)的封闭缓冲液(50mM Tris-HCl, pH7. 4,150mM NaCl (TBS))中封闭过夜。 为了检测磷酸化受体，用封闭缓冲液中，针对磷酸酪氨酸的单克隆抗体(UBI，Lake Placid,NY)室温探测印迹1小时。然后用含有0. 吐温-20 (TBS-T)的0. 5x TBS洗涤印迹，并用 与辣根过氧化物酶(Amersham)偶联的山羊抗-小鼠Ig温育。用TBS洗涤印迹，并用化学 发光试剂(ECL，Amersham)温育1分钟。与磷酸化蛋白反应的抗磷酸酪氨酸是通过曝光高 效发光检测胶片(Hyperfilm-ECL，Amersham)0. 5-10分钟检测的。为了检测C441细胞中flk-1 (VEGFR-2) /fms的受体水平，按照制造商(Amersham) 提供的方法分离印迹，并用抗-fms兔多克隆抗体再次探测。实施例II1-4流式细胞计结合测定法C441细胞在IOcm平板中生长至近汇合。用非-酶促解离缓冲液(Sigma)把细胞移 出，在没有血清的冷培养基中洗涤，并重悬浮在补充了 BSA(HBSS-BSA)的Hanks平衡盐 溶液中，浓度为每只试管1百万个细胞。在每只试管中加入10 μ g单克隆Ab DC-101或同种 型匹配的无关抗体抗FLK-223H7，在冰上再保持60分钟。洗涤后，加入5 μ 1与FITC(TAGO) 偶联的山羊抗-小鼠IgG，在冰上保持30分钟。洗涤细胞3次，在Iml HBSS-BSA中重悬浮， 并在Coulter Epics Elite细胞计数器上进行分析。荧光第二抗体的非特异性结合是根据 缺少第一抗体的样品测定的。实施例II1-5完整细胞的结合测定法使用在M孔培养皿中生长至汇合的细胞对C441细胞进行测定。HUVEC细胞在6 孔培养皿中生长至汇合。用结合缓冲液(DMEM，50mMHEPES pH7. 0，0. 5%牛血清白蛋白)中 不同量的mAb DC-1014°C温育细胞单层2小时。然后用冷的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗 涤细胞，用终浓度为2. 5 μ g/ml，与生物素偶联的第二抗-大鼠IgG抗体温育。4°C温育1小 时后，洗涤细胞，并用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶复合物4°C温育30分钟。洗涤后，通 过用比色检测系统(TMB，Kirkeggard和Perry)测量MOnm处的吸光度而测定细胞结合抗 体。单独的第二抗体的OD 540nm用作非特异性结合的对照。实施例II1-6细胞增殖测定法促有丝分裂测定法是用Cell Titer 96非放射性细胞增殖测定试剂盒(Promega Corp. ,Madison，WI)进行的。在该测定法中，根据活细胞把四唑盐还原成甲脂产物所获 得的值比色测量增殖。简单地说，HUVEC细胞以1000个细胞/孔的密度，在EGM基础培养 基中的M孔明胶包被的平板中生长。温育48小时后，向孔中加入各种成分。在有和没有 1 μ g/ml mAb DC-101存在时，向培养基中加入10ng/ml VEGF0加入肝素(Sigma)至最终浓 度为1 μ g/ml。然后再温育该细胞3天。为测量细胞生长，向各孔中加入20 μ 1四唑染料的 等分试样，37°C温育该细胞3小时。溶解细胞，测量甲腊产物的吸光度(0D570)，从而量化 增殖。实施例IV.体外活性测定法实施例IV-1.鼠抗-flk-1 (VEGFR-2)Mabs 25 和 73 弓丨起 VEGF 诱导的 flk-1 (VEGFR-2)/fms受体活化的特异性中和测定法是用从等浓度flk-1 (VEGFR-2) /fms转染的3T3细胞系C441中免疫沉淀出 来的FLK/fms和PDGF受体进行的，而人EGFR是从肿瘤细胞系KB中免疫沉淀出来的。细 胞在有和没有10 μ g/ml鼠抗-fIk-IMabs 25和37存在时，用含有20ng/ml VEGF (flk-1/ fms), DMEM-10% 小牛血清(PDGFR)，或 10ng/ml EGF (EGFR)的 RPMI-0. 5% BSA 刺激。刺激 后，用PBS-ImM原钒酸钠洗涤细胞并溶解。Flk-1/fms和PDGFR是从溶解产物中免疫沉淀的，所述溶解产物具有分别针对c-fms (IM133) C-末端区和PDGF (UBI)受体的肽产生的多克 隆抗体。EGFR用针对人受体N-末端区温育的Mab ￠22 免疫沉淀。免疫沉淀的溶解产物 经过SDS聚丙稀酰胺电泳，接着进行蛋白质印迹分析。用抗-PTyr Mab(UBI)探测印迹，以 检测受体活化。相对于无关Mab和未受刺激的对照组评估受刺激细胞的受体中和。实施例IV-2使用Mab25和Mab73作为探针，通过蛋白质印迹检测 flk-1 (VEGFR-2) /fms 受体受体是用鼠抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs 在 flk_l (VEGFR-2)/fms 受体的蛋白质印 迹上检测的，所述flk-1 (VEGFR-2)/fms受体是由针对c-fms受体C-末端区的肽产生的 多克隆抗体免疫沉淀的，而c-fms受体则来源于等浓度转染的3T3细胞系C441的溶解产 物。通过SDS凝胶电泳和蛋白质印迹分析后，把印迹分成四部分，每部分都用50yg/ml的 抗-flk-1 (VEGFR-2)Mabs 25和73探测。然后分离印迹，并用抗-fms多克隆抗体再次探测， 以证实由各Mab检测的带代表flk-1 (VEGFR-2) fms受体。实施例IV-3通过用抗-flk-1 (VEGFR-2) Mabs免疫沉淀而检测来源于VEGF刺激的 HUVEC 和 0VCAR-3 细胞的活化 KDR(VEGFR-2)蛋白是用来源于新鲜分离的HUVEC溶解产物的不同抗体免疫沉淀的。在溶解前， 用RPMI-0. 5 % BSA中的20ng/ml VEGF室温刺激细胞10分钟，并用含ImM原钒酸钠的PBS洗 涤。各次免疫沉淀是用等体积溶解产物进行的，然后经过SDS聚丙烯酰胺电泳，接着进行蛋 白质印迹。最初用抗-PTyr Mab (UBI)探测印迹，随后分离，并用针对flk_l/KDR(VEGFR_l/ VEGFR-2, IM 142)内激酶的肽产生的多克隆抗体再次探测，接着用针对flk_l (VEGFR-2) C-末端区的多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology, Inc.)探测。免疫沉淀是用无关大 鼠 Mab，23H7，无关小鼠 Mab，DAB8，和抗 flk-1 (VEGFR-2) Mabs, DC-101，73，25，和抗 flk-1/ KDR(VEGFR-l/VEGFR-2)多克隆抗体，IM142进行的。在某些情况下，分离印迹，并用抗 flk-lMabs 73和25再次探测，以检测交叉反应带。类似方法用于检测卵巢癌细胞系0VCAR-3的KDR(VEGFR_2)受体形式。实施例V抗体的活性实施例V-IELISA和用DC-101免疫沉淀人们发现大鼠IgGl单克隆抗体DC-IOl对鼠酪氨酸激酶受体flk_l (VEGFR-2)特 异。ELISA数据表明，抗体与纯化的flk-1 (VEGFR-2) :SEAP结合，但不与碱性磷酸酶或其它 受体酪氨酸激酶如FLK-2结合。如图1所示，DC-IOl可使鼠flk_l (VEGFR-2) SEAPS免疫 沉淀，而不能使单独的SEAPS免疫沉淀。实施例V-2用DC-IOl抑制Flk_l (VEGFR-2)受体磷酸化进行实验以便确定DC-IOl是否能通过其关联配体VEGF165中和C441细胞中 flk-1 (VEGFR-2)的磷酸化。在这些研究中，单克隆抗体和VEGF在室温同时加入到细胞单层 中15分钟。这些条件被设计成测定抗体对受体/配体结合的竞争性作用(竞争性抑制)。 图加所示的这些测定结果表明，当在有DC-IOl存在的情况下测定细胞时，VEGF165诱导的 flk-1 (VEGFR-2)/fms受体磷酸化显著降低。此外，这些数据表明，Mab与VEGF165竞争阻止 配体导致的受体完全活化。为了测定VEGF-fIk-I (VEGFR-2)相互作用对DC-101所致抑制 的敏感性，C441细胞是以最大刺激浓度的VEGFlfj40ng/ml)结合各种水平的抗体测定的。 这些Mab滴定的结果在图2b中给出。当DC-101的浓度大于0. 5 μ g/ml时，VEGF165所致的flk-1 (VEGFR-2)磷酸化显著降低。这些数据表明，相对较低浓度的抗体(< 1 μ g/ml)足以 抑制配体所致的受体活化。在80ng/ml的配体过量存在时，5 μ g/ml抗体就能够中和VEGF165 对flk-1 (VEGFR-2)的刺激。作为对照，使用CSF-I在完全刺激的fms/FLK-2受体(10A2细 胞系)上测试DC-101的作用。在这些条件下，DC-101对受体活化没有影响。实施例V-3利用DC-101进行抑制研究通过研究进一步评估Mab抑制的程度和特异性，其中在加入配体之前，用细胞预 温育DC-101，以便使抗体与受体充分作用。在这些实验中，用5 μ g/ml DC-101，通过常规 方法(ImClone, NY)制备的大鼠抗_FLK_2Mab (2A13)，和对照组大鼠IgGl (Zymed Labs)室 温温育细胞单层15分钟，然后加入40ng/ml VEGF165再温育15分钟。为了比较而进行 测定，其中同时加入DC-101和VEGF165(竞争性抑制)。这些研究的结果(图4)表明，用 flk-1 (VEGFR-2)/fms转染的细胞预温育的抗-flk_l (VEGFR-2)单克隆抗体可完全消除 VEGF165所致的受体活化。类似结果是用VEGF121进行刺激观察到的。当加入无关同种型匹 配的大鼠抗体不会影响VEGF所致的flk-1 (VEGFR-2)磷酸化时，用抗-fms多克隆抗体探测 的相同印迹的活性显示，每道受体蛋白的水平相同。这些数据表明，使用DC-101观察到的 磷酸化抑制是由于受体活化的阻断，而不是试验样品中缺少受体蛋白。实施例V-4通过FACS分析DC-101与C441细胞的结合通过FACS分析测定mAb与flk-1 (VEGFR-2)/fms受体(C441细胞)转染的3T3细胞 的结合。图6所示结果证明，在C441细胞表面上表达的嵌合flk-1 (VEGFR-2)/fms可被mAb DC-101特异性识别，而不能被针对相关酪氨酸激酶受体，FLK-2温育的同种型抗体识别。 HiAb-受体在细胞表面相互作用的效率是根据测定法确定的，其中在完整的C441细胞上测 量mAb结合的不同水平。图7所示的这些结果表明，mAb以大约500ng/ml相对较显著亲和性 与flk-1 (VEGFR-2)/fms受体结合。这些结果表明，mAb对细胞表面表达的flk_l (VEGFR-2) 具有较强的亲和性。实施例V-5通过免疫沉淀测定DC-101的反应性DC-101与flk-1 (VEGFR-2)/fms受体的反应程度是在被VEGF活化后，测定抗 体使受体免疫沉淀的能力而进一步评估的。图8表示VEGF刺激的C441细胞磷酸化 flk-1 (VEGFR-2)/fms受体的mAb DC-101所致的免疫沉淀。结果表明DC-101单克隆抗 体和抗fms多克隆抗体具有相似的受体作用水平，而大鼠抗FLK-2抗体2H37 (IgGl)和 2A13(IgG2a)则没有反应性。然后进行实验，确定mAb DC-101是否能够在配体的最大刺激 浓度(40ng/ml)中和VEGF诱导的flk_l (VEGFR-2)/fms磷酸化。在这些研究中，把单克隆 抗体与配体同时加入到细胞单层中，或在配体刺激之前加入，室温测定15分钟。对这些条 件进行研究，以确定抗体对受体/配体结合的竞争性作用(竞争性抑制)和预结合抗体阻 止受体活化效果。图4所示的这些测定结果表明，flk-1 (VEGFR-2)/fms的磷酸化是通过 同时加入mAb和VEGF降低的，并可被与受体预结合的抗体明显抑制。这些数据的光密度扫 描揭示，mAb DC-101与flk-1 (VEGFR-2)/fms相互作用，抑制磷酸化至完全刺激的受体对照 组G道)的6% (5道，P)和40% (6道，C)。根据这些数据我们可推断mAb DC-101与配 体-受体相互作用激烈竞争，中和flk-Ι受体的活化。为了确定VEGF-flk-1 (VEGFR-2)相 互作用对mAb DC-101所致抑制的敏感性，在抗体浓度逐渐增加时，用最大的VEGF水平测定 C441细胞。测定是在竞争和预结合条件下，用mAb进行的。这些mAb滴定的结果在图9中给出。当mAb DC-101与浓度大于0. 5 μ g/ml的VEGF抗体竞争时，可观察到f lk_l (VEGFR-2) 磷酸化的显著降低。这些数据还表明，相对较低浓度的预结合抗体(< 1 μ g/ml)足以完全 抑制配体所致的受体活化。实施例V-6通过磷酸化测定法测定DC-101的活性为进一步评估mAb DC-101对受体活化的拮抗作用，进行磷酸化测定，其中把固定 量的抗体(5 μ g/ml)加入到用量逐渐增加的配体所刺激的C441细胞中(图3a)。通过光密 度测定法的读数量化有和没有mAb DC-101时各配体浓度诱导的磷酸化水平。图北给出的 这些数据的图表明，即使有过量VEGF存在，抗体也能部分中和受体磷酸化。为了评估mAb DC-101对受体活化的特异性，测试了抗体竞争性抑制3T3转染细胞系10A2中，CSF-I诱导 的fms/FLK-2受体活化的能力。在这些实验中，测试了 5 μ g/ml的mAb DC-101和已知导 致受体完全活化的CSF-I浓度O0-40ng/ml)。图10所示的这些结果表明，mAb DC-101对 CSF-I介导的fms/FLK-2受体磷酸化没有作用。实施例V-7通过预温育研究DC-101的抑制作用通过研究进一步评估抗体抑制的程度和特异性，其中DC-101或无关抗体是在加 入配体前用细胞预温育的，以确保抗体与受体充分作用。在这些实验中，细胞单层是在加 Λ 40ng/ml VEGF 前，用 5 μ g/mlDC-101，大鼠抗 FLK_2mAb (2A13)或对照大鼠 IgGl (Zymed Labs)预温育的。为了进行对比，还进行了竞争性测定，其中同时加入抗体和VEGF。这些研 究的结果表明，只有把抗flk-l(VEGFR-2)单克隆抗体与flk-l(VEGFR-2)/fms转染的细胞 预温育才能够完全消除VEGF所致的受体活化，而加入无关同种型匹配的大鼠抗体则不能 影响VEGF所致的flk-1 (VEGFR-2)磷酸化。用抗-fms多克隆探测同一印迹的活性(图11) 显示，每道的受体蛋白水平相等。这些数据表明，用mAb DC-101处理过的细胞观察到的磷 酸化不足是由于阻断了 VEGF-诱导的等量表达受体的磷酸化。实施例V-8抗体与同源受体形式的相互作用然后进行实验，确定抗flk-l(VEGFR_2)单克隆抗体是否与人内皮细胞上的同源 受体形式相互作用。在克隆的HUVEC细胞(ATCC)上，对浓度逐渐增加的DC-101进行的滴定 表明，抗体具有复杂的结合行为。数据表示不同抗体与存在于内皮细胞上的VEGF受体的相 互作用(Vaisman等，J. Biol. Chem. 265，19461-19466，1990)。然后在与图8报道的那些相 似的条件下，利用磷酸化测定法描述DC-101与VEGF刺激的HUVEC细胞相互作用的特异性。 在这些研究中，当扣除配体成分时，DC-101可使HUVEC细胞的蛋白带免疫沉淀，所述蛋白带 分子量与交联VEGF-受体带的那些相似(图12)。当VEGF刺激细胞时(比较图12中的1道 和2道)，这些带显示磷酸化的增加。此外，VEGF诱导的受体带磷酸化是通过在测定时加入 1 μ g/ml肝素而加强(图12中的3道)。这些发现与先前报道过的，存在低浓度肝素时，VEGF 与内皮细胞结合的增加相一致(Gitay-Goren 等，J. Biol. Chem. 267,6093-6098. 1992)。很难确定免疫沉淀蛋白与DC-101相互作用可产生图12观察到的复杂的磷酸化 带，图12给出了各种受体形式与HUVEC上VEGF的结合，及刺激后它们缔合的可能性。据报 道，分子量约为180 (KDR(VEGFR-2) ),155,130-135，120-125和85的细胞表面表达的受体形 式可结合HUVEC上的VEGF。这种发现强调了若干不同受体形式在配体刺激后异二聚的可能 性，其异二聚的方式与KDR-flk-l(VEGFR-2/VEGFR-l)相似。然而，除了 KDR(VEGFR_2)夕卜， 这些受体形式的准确特性和作用还不明确。所以，抗体反应性可能是因为与其中不依赖于KDR(VEGFR-2)的VEGF受体中之一相互作用而引起的。通过FACS分析可知，DC-101既不与ELISA形式的人KDR(VEGFR_2)反应，也不与 新鲜分离的HUVEC结合。这些结果表明，DC-101与人KDR(VEGFR-2)直接作用是不大可能 的。通过FACS分析可知，与DC-101不同，Mab 25和Mab 73都与ELISA形式的人 KDR(VEGFR-2)反应，并结合新鲜分离的HUVEC。实施例V-9HUVEC的促有丝分裂测定法有和没有抗体存在时，在用VEGF刺激的HUVEC细胞(ATCC)的促有丝分裂测定法 中对抗体进行试验，可观察到DC-101对内皮细胞的抑制作用。这些结果表明，VEGF所致的 细胞增殖的显著增加可被DC-101大约减少35%。在这些测定法使用的生长条件下，肝素对 细胞生长没有不同的作用。因为DC-101可对VEGF诱导的增殖和HUVEC的受体磷酸化起作用，因此可以想得 到这些结果是由于Mab与不定受体形式相互作用，其中不定受体形式很难接近细胞表面， 但可对HUVEC生长发挥某些作用，尽管这种作用很小。且，DC-101可把分子量合适的磷酸 化带从VEGF-刺激的HUVEC中免疫沉淀出来的事实表明，DC-101可与和活化受体有关的不 定fIk-I (VEGFR-2)样蛋白相互作用。实施例V-IOMab 25和Mab 73与C441细胞和HUVEC的结合通过FACS分析可知，Mabs 25和73可结合C441和HUVEC，并可在两个细胞系中内 化。蛋白质印迹的结果表明，两种抗f Ik-IMabs都可检测由抗fms多克隆抗体从C441细胞 中免疫沉淀出来的FLK/fms受体带。(见上面实施例IV-2的方法)。这些抗体可引起VEGF 诱导的f Ik-I (VEGFR-2) /fms受体的特异性中和，而且对PDGF所致的小鼠PDGF受体磷酸化 或EGF所致的人EGF受体磷酸化没有作用。(见上述实施例IV-I的方法)。由增殖测定法 可知，它们具有抑制VEGF刺激的HUVEC至50%的能力，而DC-101则影响生长至很小的程 度。实施例V-IIKDR (VEGFR-2)与 Mab25 和 Mab73 的免疫沉淀KDR (VEGFR-2)代表一类可利用Mab 25和Mab 73从活化HUVEC中免疫沉淀出 来的磷蛋白。KDR(VEGFR-2)是在蛋白质印迹中检测的，并使用抗f lk_l/KDR(VEGFR_l/ VEGFR-幻多克隆抗体(IMl^)从VEGF-刺激的早期传代HUVEC进行免疫沉淀分析。相 反，利用这些抗体从VEGF-刺激的HUVEC中免疫沉淀出来的带与IM142交叉反应，而不与 抗-flt-Ι (抗-VEGFR-1)多克隆抗体交叉反应。以实验证据为基础，根据这些发现推断出， Mabs可影响HUVEC中KDR(VEGFR_2)的活性，并且暗示作为VEGF受体的KDR(VEGFR_2)与活 化内皮细胞中的增殖反应有关。(见上面实施例IV-3的方法)实施例VI非内皮(肿瘤)细胞上VEGF受体形式的存在通过免疫沉淀对若干肿瘤系进行筛选，以确定它们与DC-101的蛋白反应性，并用 抗磷酸酪氨酸检测。细胞系8161(黑素瘤)和A431(表皮样癌)的免疫印迹可产生分子量 约为170和120kd的磷酸化带。这些结果表明，人VEGF受体形式在非内皮细胞，如肿瘤细 胞中表达。类似的实验显示，KDR(VEGFR-2)样受体在卵巢癌细胞系，0VCAR-3中表达。这 些细胞似乎也分泌VEGF。磷酸化带是利用抗-KDR (VEGFR-2)多克隆抗体从VEGF-刺激的0VCAR-3细胞中免疫沉淀出来的，通过蛋白质印迹分析可知，它可与抗f Ik-I (VEGFR-2) Mabs反应。且，利用鼠Mabs从这些细胞中免疫沉淀出来的带可与同一多克隆抗体交叉反 应。此外，由增殖测定法可知，某些鼠抗-flk-l(VEGFR-2)Mabs可引起对这些细胞的抑制 作用。这些结果证实了人VEGF受体形式的非内皮表达(即，在肿瘤细胞上表达)。磷酸化 和增殖测定的数据还表明，VEGF可调节肿瘤发生过程中，自分泌和旁分泌方式的受体活性。 (见上述实施例IV-3的方法)实施例VII使用DC-101进行体内研究实施例VII-I利用DC-101体内抑制血管发生设计进行体内研究是为了确定抗flk-1 (VEGFR-2)单克隆抗体能否阻断表达VEGF 的肿瘤细胞生长。在这些实验中，使用了人多形性成胶质细胞瘤细胞系，它具有高水平的 VEGF信息，而且可在没有血清的培养基中处理M小时后，分泌大约5ng/ml的VEGF生长因 子(图5)。第0天，给无胸腺裸鼠(nu/nu ；Charles River Labs)侧腹注射1_2百万个成胶质 细胞瘤细胞。在同一天开始，给动物腹膜内注射DC-101或对照抗体(100μ g/动物)。随后， 在第 3,5,7,10,12, 14，17，19，和 21 天，小鼠接受抗体治疗。在第 0，3，5，7，10，12，14，17， 19，和21天，给动物注射100 μ g DC-101或鼠FLK-2 (2A13)受体的对照大鼠抗体，每只动物 共接种lmg。肿瘤在第5天开始出现，一直持续50天。每天用测径规测量肿瘤大小，并利用 下列公式计算肿瘤体积p/6x较大直径x(较小直径)2(Baselga J. Nat'l Cancerlnst. 85 1327-1333)。每周至少测量3次，并按照上面所述计算肿瘤体积。DC-101组中，有一只患有 肿瘤的动物在研究的早期死亡，不能用于测定两组之间的统计学显著差异。图1 和14b表示38天后，DC-101和2A13对照组之间，各动物肿瘤生长减轻的 比较。虽然在研究过程中，所有动物肿瘤的大小和数量都发生了变化，但用DC-101治疗过 的小鼠在肿瘤进展过程中表现出全面的延迟。DC-101组的其中一只小鼠保持没有肿瘤一直 到第49天才发现较小的生长。尽管那样，肿瘤生长还是被显著抑制。对数据进行统计学分 析，以便评估两组之间肿瘤大小的差异。对数据进行协方差的标准分析，其中肿瘤大小随治 疗时间而减小。结果表明，在肿瘤大小随时间而减小的方面，DC-101组与注射2A13的小鼠 明显不同(P < 0. 0001)。图15表示DC-101对无胸腺裸鼠的治疗效果，所述无胸腺裸鼠中移植了分泌VEGF 的人成胶质细胞瘤细胞系GBM-18。给裸鼠皮下注射GBM-18细胞，并把它们分成3个治疗 组PBS对照组，无关大鼠IgGl对照组，和DC-101。治疗与肿瘤的异种移植同时进行，并持 续4周。结果表明，与对照组相比，用DC-101治疗过的裸鼠中的GBM-18肿瘤生长显著降低。 该实验表明，DC-101通过阻断肿瘤相关性血管内皮细胞上flk-1 (VEGFR-2)的VEGF活化而 抑制肿瘤生长，且DC-101作为针对分泌VEGF的血管化肿瘤的抗-血管发生剂具有治疗价 值。flk-1 (VEGFR-2)受体酪氨酸激酶的单克隆抗体可通过消除血管发生而抑制肿瘤 侵入。侵入性生长和血管发生是恶性肿瘤的重要特征。两个现象都被证实适于在表面移植 测定法中区分良性和恶性的角质形成细胞。把与胶原凝胶结合的细胞单层移植到裸鼠背肌 上后，最初形成的所有肿瘤细胞构成鳞状上皮，但只有恶性角质形成细胞在2-3周内侵入 性生长。良性及恶性细胞都可诱导血管发生。然而，恶性细胞的血管发生反应发生较早，更强，且毛细血管向着恶性上皮生长。此外，在良性肿瘤细胞的移植物中，毛细血管在2-3周 后消退，而恶性角质形成细胞则维持不间断的血管发生水平。血管内皮生长因子(VEGF)及 其关联配体在肿瘤血管发生中起着关键的作用。DC-101的给药可破坏不间断的血管发生， 从而抑制肿瘤侵入。抗体可阻止新形成的血管网的成熟及进一步扩展，但不能显著干扰最 初的血管发生诱导。这些结果证实肿瘤侵入需要在先的血管发生，VEGF受体在维持这种模 型系统的血管发生中至关重要。实施例VII-2不同浓度的DC-101对所确立的成胶质细胞瘤(gbm_18)的作用给无胸腺小鼠(nu/nu)皮下接种GBM_18(人多形性成胶质细胞瘤)。当肿瘤的 平均体积达到100-200mm3时，开始抗体治疗。治疗包括下列6次注射(每周2次，注射3 周)⑴每次注射200，400或800g的DC-101 ； (ii)无关同种型匹配的大鼠IgG(每次注射 400 μ g)；或(iii)PBS。用测径规测量肿瘤体积。与PBS和无关单克隆抗体组相比，DC-101 组的肿瘤抑制比较显著(*)。其它实验可证实大鼠抗flk-1 (VEGFR-2)单克隆抗体DC-101对裸鼠GBM-18肿瘤 生长的作用。第0天，给动物(nu/nu ；Charles RiverLabs ；10只动物/组)皮下注射GBM-18 细胞(人成胶质细胞瘤[100] ； 1百万/只动物)。第7天开始用PBS或DC-101 (每次注射 200 μ g)治疗，每周两次，持续3周(6x)。曲线图表示各组随时间改变的平均肿瘤体积和 消退数据，图中还给出了它们各自的肿瘤生长速度(斜率以λ表示；实线)和99%置信限 (虚线)。用DC-101处理过的动物的曲线斜率与PBS的明显不同(ρ<0.01)。值得注意的 是，无关大鼠IgGl单克隆抗体(抗小鼠IgA ；Pharmigen)对GBM-18异种移植物的生长没有 影响，其结果与使用PBS观察到的相似(没有给出数据)。实施例VIII抗flk-1 (VEGFR-2)抗体可选择性增加放疗诱导的裸鼠中人肿瘤异种 移植物的治愈率该实施例是为了评估可阻断鼠肿瘤血管内皮细胞上的重要VEGF受体-2， flk-1 (VEGFR-2)的单克隆抗体DC-101能否增加分次放疗(RT)导致的肿瘤异种移植物的治 愈可能性，以及该抗体能否同时调节正常组织(小鼠皮肤)的放疗反应。材料&方法把人小细胞肺癌54A和多形性成胶质细胞瘤U87皮下植入到裸鼠的 后腿中。当肿瘤直径达到8mm时(第0天)开始治疗。每3天腹膜内注射20或40mg/kg 体重的DC-101，共注射6次。连续5天，每天给予相等的分次放疗总剂量。第0天，小鼠第 一次注射抗体，或开始RT。对于联合疗法而言，DC-101给药在第0天开始，RT在第1天开 始。治疗后，每周测量肿瘤大小2-3次。在任一组中观察到肿瘤复发后，跟踪有局部对照肿 瘤的小鼠90天。在开始RT后的前30天内，使用记分量表评估肿瘤放疗区域的急性皮肤反 应。结果单独使用的抗体可以剂量依赖性的方式抑制两种肿瘤的生长(但不会消 退)。这种作用在54A中比在U87异种移植物中更显著。在任一模型中，与单独进行RT相 比，把最低剂量(共25-30Gy)的放疗与DC-101联合可进一步延迟肿瘤的生长。抗体也是 以剂量依赖性的方式增加RT的治愈效果。例如，较高剂量的DC-101可使局部控制50%肿 瘤所需的放疗剂量降低在54A异种移植物中为1. 7倍(从单独进行RT时的67. 6Gy降至 联合疗法的39. IGy)；在U87中为1. 3倍(从97. 8-74. 8Gy)。还有一点特别重要，那就是 DC-101的这种作用对肿瘤是选择性的。即，没有检测到抗体对皮肤放疗反应的平行改变。正如在其它实验中评估的，DC-101诱导的肿瘤放疗反应的提高与它们的辐射敏化或氧化的 改变无关，而与抗体显著降低肿瘤间质液压有关。结论结果共同表明，针对这些生长因子分子主要受体的抗体对VEGF-信号传递 途径的阻断可选择性加强分次RT的肿瘤治愈反应；并因此提供一种治疗法。实施例IX.生产单链抗体实施例IX-I材料实施例IX-I (a)细胞系和蛋白 原代培养的HUVEC维持在37°C，5% CO2的EBM-2培养基中。使用2-5代的细胞进行 所有测定。VEGF165蛋白在杆状病毒中表达并纯化。通过RT-PCR从人类胎儿肾脏的mRNA中 分离编码KDR(VEGFR-2)胞外域的互补DNA，并把它亚克隆到载体AP-Tag的BglII和BspEI 位点中。在该质粒中，KDR(VEGFR-2)胞外域的cDNA在读框中与人胎盘AP的cDNA融合。 所述质粒与新霉素表达载体PSV-Neo —起被电穿孔到OTH 3T3细胞中，并用G418选择稳定 的细胞克隆。使用AP的固定化单克隆抗体，通过亲和色谱法从细胞培养物上清液中纯化出 可溶性融合蛋白KDR-AP。实施例IX-I (b)小鼠免疫法和单链抗体噬菌体展示文库的构建给雌性BALB/C小鼠腹膜内(i. p.)注射200 μ 1 RIBI佐剂系统中的10 μ g KDR-AP 两次，接着在2个月内，在没有RIBI佐剂系统的条件下，腹膜内注射1次。在第一次免疫接 种时，给小鼠皮下(s. c.)注射200 μ 1 RIBI中的10 μ g KDR-AP。实行安乐死前，给小鼠腹 膜内加强20 μ g KDR-AP三天。除去供体小鼠的脾脏，并分离细胞。提取RNA并从脾细胞的 总RNA中纯化出mRNA。使用mRNA构建scFv噬菌体展示文库，它是在丝状噬菌体M13的表 面展示的。scFv在丝状噬菌体表面展示时，抗体的Vh和\结构域是通过15个氨基酸长的接 头(GGGGS)3连接在一起的，并与噬菌体蛋白III的N-末端融合。为了进行检测和分析，把 15个氨基酸长的E标记(其后面是琥珀密码子(TAG))插入到\的C-末端和蛋白III之 间。位于E标记和蛋白III间的琥珀密码子可使该构建体在转移到抑制宿主(如TGI细 胞)中时，构成表面-展示形式的scFv，并在转移到非抑制宿主(如HB2151细胞)中时，构 成可溶性形式的scFv。把组装的scFv DNA连接到pCANTAB 5E载体中。把转化的TGl细胞铺于2YTAG平 板上并进行温育。把集落刮在IOml 2YT培养基中，与5ml 50%甘油混合，_70°C贮存，作为 文库的原液。实施例IX-I (c)生物淘选文库原液生长至对数期时，把它引入到Mi;3K07辅助噬菌体中，并于30°C时，在 2YTAK培养基QYT含有100 μ g/ml氨苄西林和50 μ g/ml卡那霉素)中过夜扩增。噬菌体 制品在4% PEG/0. 5M NaCl中沉淀，在3%脱脂奶/含500 μ g/ml AP蛋白的PBS中重悬浮， 37°C温育1小时，以捕获展示抗AP scFv的噬菌体并阻断其它非特异性结合。首先于37°C 时用 3%奶/PBS 封闭包被有 KDR-AP (10 μ g/ml)的 Maxisorp Mar 试 管(Nunc,Denmark) 1小时，然后用噬菌体制品室温温育1小时。用PBST洗涤试管10次，然 后用PBS (PBS含0. 1 %吐温20)洗涤10次。用Iml新鲜制备的IOOmM三乙胺溶液室温洗 脱结合噬菌体10分钟。37°C用IOml对数中期的TGl细胞温育洗脱的噬菌体30分钟，静置30分钟，振摇。然后把感染的TGl细胞铺于2YTAG平板上，30°C过夜温育。在第三轮淘选后筛选出来的克隆有99% (185/186)是特异性的KDR(VEGFR_2)结 合剂。然而，在这些结合剂中，只有15(8% )个能阻断KDR(VEGFR-2)与固定化VEGF的结 合。这15个克隆的DNA BstN I指纹表明存在2种不同的消化模式；而21个随机抽取的 VEGF非阻断剂产生了 4种不同的模式。第二轮淘选之后，可在已经鉴定的克隆中见到所有 的消化模式。各消化模式的代表克隆是从第二轮淘选后回收的克隆中挑选的，并进行DNA 测序。在15个测过序的克隆中，鉴定了 2个独特的VEGF阻断剂和3个非阻断剂。其中一 个scFv，p2A7既不结合KDR(VEGFRj)，又不阻断VEGF与KDR(VEGFRj)的结合，因此被选 作所有研究的阴性对照。实施例IX-I (d)噬菌体的ELISA各TGl克隆37°C时在96孔平板中生长，并按照上面所述把它引入到Μ1!3Κ07辅助 噬菌体中。用1/6体积的18%奶/PBS室温阻断扩增的噬菌体制品1小时，然后加入到包 被有KDR-AP或ΑΡ(1μ g/ml χ 100 μ 1)的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)中。室温温 育1小时后，用PBST洗涤该平板3次，并用兔抗M13噬菌体Ab-HRP偶联物温育。洗涤平板 5次，加入TMB过氧化物酶底物，使用微量平板读数器读出450nm处的0D，鉴定并对scFv抗 体测序。实施例IX-I (e)可溶性scFv的制备各个克隆的噬菌体用于感染非抑制大肠杆菌宿主HB2151和在2YTAG-N平板上 选择的感染物。scFv在HB2151细胞中的表达是通过30°C时，在含有ImM异丙基-1-硫 代-B-D-吡喃半乳糖苷的2YTA培养基中培养细胞诱导的。细胞的胞质提取物是通过把细 胞沉淀重悬浮在25mMTris(pH 7. 5)中，并于4°C时，轻轻振摇温育1小时制备的，其中25mM Tris (pH 7.5)含有 20% (w/v)蔗糖，200mM NaCl, ImM EDTA 禾Π 0. ImMPMSF。15，OOOrpm 离 心15分钟后，使用RPAS PurificationModule (Pharmacia Biotech)通过亲和色谱法从上 清液中纯化出可溶性scFv。实施例IX-2测定法实施例IX-2(a)定量KDR (VEGFR-2)结合测定法使用两种测定法定量检测纯化的可溶性scFv与KDR(VEGFRj)的结合。4个不同的克隆，包括两个VEGF阻断剂，PlCll和plF12，一个非阻断剂，优势克隆 P2A6和非结合剂p2A7是利用非抑制宿主大肠杆菌HB2151细胞在摇瓶中表达的。可溶性 scFv是通过抗-E标记亲和色谱法从大肠杆菌的胞质提取物中纯化出来的。这些克隆的纯 化scFv的产率为100-400 μ g/1培养物。在直接结合测定法中，把不同量的可溶性scFv加入到KDR(VEGFRj)包被的96孔 Maxi-sorp微量滴定平板中，室温温育1小时，用PBST洗涤平板3次。然后用100 μ 1小鼠 抗E标记抗体室温温育该平板1小时，接着用IOOpl兔抗-小鼠抗体-HRP偶联物培养。在 进行上述噬菌体ELISA过程后，洗涤平板并显影。在另一测定法，即竞争性VEGF阻断测定法中，把不同量的可溶性scFv与固定量的 KDR-AP(50ng)混合，室温温育1小时。然后把混合物转移到包被有VEGF165QOOng/孔)的 96孔微量滴定平板中，室温温育2小时，之后洗涤平板5次，加入AP的底物，从而量化结合 的KDR-AP分子。然后计算IC5tl，即，抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50%所需的scFv浓
图16表示通过直接结合ELISA测定的，scFv与固定化KDR(VEGFR_2)的剂量依赖 性结合。如图17所示，克隆PlCll和plF12也可阻断KDR(VEGFR-2)与固定化VEGF的结合， 但P2A6不能。图17所示的数据是三次测量的平均值士SD。阴性对照克隆p2A7，既不结合 KDR(VEGFR-2)，也不阻断KDR(VEGFR_2)与VEGF的结合(图16禾口 17)。克隆plCll,即每轮 淘选后的优势克隆，显示出最高的KDR(VEGFR-2)结合能力和阻断VEGF与KDR(VEGFR_2)结 合的最高效力(表1)。使克隆PlCll与KDR(VEGFR-2)结合最大的50%所需的抗体浓度 和抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50%所需的浓度分别为0. 3nM和3nM(图17)。FACS 分析证实，plCll，plF12和p2A6也能结合在HUVEC细胞表面表达的受体。实施例IX-2 (b)可溶性scFv的BIAcore分析可溶性scFv与KDR(VEGFR_2)的结合动力学是用BIAcore生物传感器(Pharmacia Biosensor)测量的。把KDR-AP融合蛋白固定在传感器芯片上，注射62. 5nM-1000nM浓度的 可溶性scFv。获得各浓度的传感图，并使用BIA Evaluation 2. O程序评估，以测定速率常 数kon和koff。Kd是根据速率常数koff/kon的比值计算的。表1表示BIAcore仪器上表面等离子共振的结果。阻断VEGF的scFv，plCll和 P1F12分别以2. 1和5. 9nM的Kd与固定化的KDR(VEGFR_2)结合。非阻断性scFv，p2A6与 KDR(VEGFR-2)结合时，其亲和性比最好的结合剂plCll弱6倍，这主要是由于其更快的解离 速率。正如所预期的，p2A7不与BIAcore上的固定化KDR(VEGFR_2)结合。实施例IX_2(c)磷酸化测定法磷酸化测定法是按照前述方法，用早期传代HUVEC进行的。简单地说，在有或没有 5 μ g/ml scFv抗体存在时，在补充了 0. 5 %牛血清白蛋白，没有血清的EBM-2基础培养基中 室温温育HUVEC 10分钟，接着用20ng/ml VEGF165室温刺激15分钟。溶解细胞，使用与兔 抗-KDR(抗VEGFR-2)多克隆抗体(ImClone Systems Incorporated)偶联的蛋白A琼脂糖 珠把KDR(VEGFRj)受体从细胞溶解产物中免疫沉淀出来。洗涤珠子，与SDS加样缓冲液混 合，对上清液进行蛋白质印迹分析。为了检测KDR(VEGFRj)的磷酸化，用抗-磷酸酪氨酸 Mab,4G10探测印迹。对于MAP激酶活性测定法而言，用SDS-PAGE分辨细胞溶解产物，接着 使用磷酸-特异性MAP激酶抗体进行蛋白质印迹分析。所有信号都是用ECL检测的。结果表明，阻断VEGF的scFv plCll能够抑制VEGF刺激的KDR(VEGFR_2)受体磷 酸化，而非阻断性scFv p2A6则不能。此外，plCll还可有效抑制VEGF-刺激的MAP激酶 p44/p42活化。相反，plCll和p2A6都不能抑制FGF-刺激的MAP激酶p44/p42活化。实施例IX-2 (d)抗有丝分裂测定法把HUVEC(hl03个细胞/孔)铺于96孔组织培养平板上的200 μ 1没有VEGF， bFGF或EGF的EBM-2培养基中，37 °C温育72小时。把不同量的抗体一式两份加到孔中， 37°C预温育1小时，之后加入VEGF165至16ng/ml的终浓度。温育18小时后，向各孔中加入 0. 25 μ Ci的[3H=-TdR(Amersham)，再温育4小时。把细胞放在冰上，用含血清的培养基洗 涤两次，然后用10% TCA在4°C时温育10分钟。然后用水洗涤细胞1次，并在25 μ 1的2% SDS中溶解。加入闪烁液(150 μ 1/孔)，在闪烁计数器(ffallach, Model 1450 Microbeta ScintillationCounter)上测定已掺入DNA的放射性。scFv抗体阻断HUVEC上VEGF-刺激的促有丝分裂活性的能力在图18中表示。阻断VEGF的scFv plCll可有力抑制HUVEC上VEGF诱导的DNA合成，其EC5tl，即抑制50% VEGF-刺激的HUVEC促有丝分裂的抗体浓度约为5nM。非阻断性scFv p2A6对VEGF所致的 促有丝分裂活性没有抑制作用。plCll和p2A6都不能抑制HUVEC中bFGF诱导的DNA合成 (没有标出)。图18所示数据表示至少3次独立的实验。(！)仅有VEGF ； (A)没有VEGF。实施例IX-3从plCll生产嵌合抗体实施例IX_3(a)细胞系和蛋白原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在37°C，5%C02mEBM-2培养基中维持。用 2-5代的细胞进行全部测定。VEGF165和KDR(VEGFR-2)碱性磷酸酶融合蛋白(KDR-AP)分别 在杆状病毒和NIH 3T3细胞中表达，并按上述过程纯化。抗-KDR(抗-VEGFR^scFv plCll 和scFv p2A6，一种结合KDR (VEGFR-2)，但不阻断KDR (VEGFR-2) -VEGF相互作用的抗体，是 从噬菌体展示文库中分离出来的，噬菌体展示文库是按上面所述，从使用KDR(VEGFR-2)免 疫的小鼠构建的。C225是一种针对表皮生长因子(EGF)受体的嵌合IgGl抗体。见上文。实施例IX-3 (b) scFv plCll可变结构域的克隆ρICll 的轻链(Vl) (SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO 16)和重链(Vh) (SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 15)的可变结构域是分别使用引物1和2，引物3和4，通过PCR从scFv表达载 体克隆的。然后分别使用引物5和2，引物5和4，通过PCR把哺乳动物细胞分泌的蛋白前 导肽序列加到八和5’端。引物 1 :5，CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAGCTC 3，[SEQ ID No 37]引物 2 :5，TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG 3，BamHI [SEQ ID No 38]引物3 :5，CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC AAGCTG 3，[SEQ ID No 39]引物 4 5' TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT 3，BamHI [SEQID No :40]引物 5 :5，GGT CAA AAG CTT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTTHind III CTA GTA GCA ACT 3，[SEQ ID No :41]实施例IX-3 (c)嵌合plCllIgG表达载体的构建构建用于表达嵌合IgG轻链和重链的独立载体。克隆八基因是用Hind III和 BamH I消化的，并连接到含人κ轻链恒定区(Q)的载体ρΚΝΙΟΟ中，从而制造嵌合plCll 轻链，c-plCll-L的表达载体。克隆乂11基因是用Hind III和BamH I消化的，并连接到含人 IgGl(y)重链恒定区(Ch)的载体PGID105中，从而制造嵌合plCll重链，c-plCll-H的表 达载体。两个构建都是通过限制酶消化检验的，并通过双脱氧核苷酸测序加以证实。如图19所示，Vh和\结构域在它们的5’端与编码所标前导肽序列(SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24)的基因片段准确融合。V1^P \结构域分别经由Hind III/BamH I位 点连接到表达载体PG1D105中，含有人γ 1恒定区基因的cDNA形式，和表达ρΚΝΙΟΟ中，含有 人κ链恒定区基因的cDNA形式。在两种情况下，表达都是在HCMVi启动子的控制下进行 的，并由人工终止序列终止。根据Kabat等在高变序列定义中的规定，轻链和重链互补决定 区(OTR)残基是下面划线的部分，并分别标出了⑶R-Hl至H3，⑶R-Ll至L3。⑶R-Hl (SEQ ID NO 1 和 SEQ IDNO 9) ；CDR_H2(SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 10) ；CDR_H3(SEQ ID NO 3和 SEQ ID NO 11) ；CDR-Ll (SEQ ID NO :4禾口 SEQ ID NO 12) ；CDR-L2 (SEQID NO :5禾口 SEQ ID NO 13) ；CDR-L3(SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 14)。实施例IX-3 (d) IgG的表达和纯化COS细胞与等量c-plCll-L和c-plCll-H质粒共转染，进行瞬时IgG表达。把在 150mm培养皿的DMEM/10% FCS中生长的亚汇合COS细胞用20ml含40mM Tris (pH 7. 4)的 DMEM 冲洗一次，然后用 4mlDMEM/DEAE-葡聚糖 /DNA 混合物(DMEM 含有 40mM Tris, 0. 4mg/ ml DEAE-葡聚糖(Sigma)，和 20 μ g c-plCll-L 和 c-plCll-H 质粒)37°C温育 4. 5 小时。把 细胞用鈿1 DMEM/含IOOnM氯喹(Sigma)的2% FCS在37°C时培养1小时，接着用1. 5ml 20%甘油/PBS室温温育1分钟。用DMEM/5% FCS洗涤细胞两次，在20ml相同的培养基中 37°C过夜温育。然后用纯DMEM洗涤细胞两次后，把细胞培养基更换成没有血清的DMEM/ HEPES0在转染后的第48和120小时，收集细胞培养物的上清液。按照制造商(Pharmacia Biotech)描述的方法，使用G蛋白柱通过亲和色谱法从合并的上清液纯化嵌合IgG。收集 含IgG的部分，把缓冲液更换成PBS，并用Centricon 10浓缩器(Amicon Corp.，Beverly, ΜΑ)浓缩。IgG纯度是通过SDS-PAGE分析的。纯化抗体的浓度是使用山羊抗-人y链特异 性抗体作为捕获剂，使用HRP-偶联的山羊抗-人k链抗体作为检测剂，利用ELISA测定的。 使用临床级抗体校准标准曲线。用G蛋白进行亲和纯化后，在SDS-PAGE中见到一个约150kD的单一蛋白带。使用 HRP-偶联的抗人IgGlFc特异性抗体进行的蛋白质印迹分析证实，纯化蛋白中存在人IgG的 Fc部分(没有标出)。ELISA的结果表明，与亲代scFv相比，c-plCll可更有效地结合固定化的 KDR(VEGFR-2)(图 20)。实施例IX-4测定和分析实施例IX-4 (a) FACS 分析早期世代的HUVEC细胞在缺失生长因子的EBM-2培养基中生长过夜，从而诱导 KDR(VEGFR-2)的表达。采集细胞，并用PBS洗涤3次，用c-plCll IgG(5 μ g/ml) 4°C温育1 小时，接着用 FITC标记的兔抗人Fc 抗体(Capper，Organon Teknika Corp. ,West Chester, PA)再温育60分钟。洗涤细胞，利用流式细胞计(Model EPICS , CoulterCorp. ,Edison, NJ)进行分析。图21是表示c-plCll与表达KDR(VEGFR_2)的HUVEC结合的FACS分析曲线图。 正如先前使用亲代scFv plCll所见，c-plCll特异性结合在早期世代的HUVEC上表达的 KDR(VEGFR-2)。 实施例IX-4 (b)定量的KDR (VEGFR-2)结合测定法把不同量抗体加入到包被有KDR (VEGFR-2)的96孔Maxi_sorp微量滴定平板 (Nunc. Danmark)中，室温温育1小时，然后用含0. 1 %吐温20的PBS洗涤平板3次。室温 使该平板用100 μ 1 scFv的小鼠抗E标记抗体-HRP偶联物(Wiannacia Biotech)，或嵌合 IgG的兔抗人IgGFc特异性抗体-HRP偶联物(Cappel，Organon Teknika Corp.)温育1小 时。洗涤平板5次，加入TMB过氧化物酶底物(KPL，fetitherSburg，MD)，利用微量平板读数 器(Molecular Device, Sunnyvale, CA)读出 450nm 处的 0D。图20是表示抗体与固定化KDR(VEGFR-2)直接结合的曲线图。与亲代scFv相比，c-plCll可更有效地结合固定化的KDR(VEGFRj)受体。实施例IX-4 (c) BIAcore 分析抗体与KDR (VEGFR-2)的结合动力学是用BIAcore生物传感器(Pharmacia Biosensor)测量的。把KDR(VEGFR-2)-AP融合蛋白固定在传感器芯片上，注射25nM_200nM 浓度的抗体或VEGF。获得各浓度的传感图，并用BIA Evaluation 2. O程序评估，从而测定 速率常数kon和koff。Kd是用速率常数koff/kon的比值计算的。BIAcore分析揭示，与亲代scFv相比，c-plCll与KDR(VEGFR_2)的结合亲和性更 高(表2)。c-pICll的Kd为0. 82nM，而scFv的Kd为2. InM0 c-plCll亲和性的增加主要 是由于二价嵌合IgG的解离速率(koff)较低。值得注意的是，c-plCll与KDR(VEGFR-2)的 结合亲和性与天然配体VEGF与KDR(VEGFRj)的结合亲和性类似，在BIAcore分析中测定 为 0. 93nM (表 2)。实施例IX-4 (d)竞争性VEGF结合测定法在第一个测定法中，把不同量抗体与固定量的KDR(VEGFRD-AP(50ng)混合，室 温温育1小时。然后把混合物转移到包被有VEGF165 QOOng/孔)的96-孔微量滴定板中，室 温温育2小时，然后洗涤平板5次，加入AP的底物(对-硝基苯基磷酸，Sigma)，从而量化 结合的KDR(VEGFR-2)-AP分子。然后计算EC5tl，即，抑制KDR(VEGFR_2)与VEGF结合的50% 所需的抗体浓度。图22表示c-plCll可阻断KDR(VEGFR_2)受体与固定化VEGF的剂量依赖性结合。 与scFv 2. OnM的IC5tl值相比，嵌合抗体可更有效地阻断VEGF-KDR (VEGFR-2)的相互作用， 其IC5tl值(即，抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50%所需的抗体浓度)为0. 8nM。对照 scFv p2A6也可结合KDR (VEGFR-2)(图20)，但不阻断VEGF-KDR (VEGFR-2)的相互作用(图 22)。在第二个测定法中，把不同量的c-plCll抗体或冷的VEGF165蛋白与固定量125I标 记的VEGF165混合，加入到包被有KDR(VEGFRj)受体的96孔微量滴定板中。室温温育该平 板2小时，洗涤5次，计算结合固定化KDR(VEGFR-2)受体的放射性标记的VEGF165量。测 定阻断放射性标记的VEGF与固定化KDR(VEGFR-2)受体结合的50%所需的c-plCll和冷 VEGF165的浓度。放射性标记的VEGF165的结合抑制结果在图23中表示。所示数据为三次测 量的平均值。c-plCll可以剂量依赖性方式与125I标记的VEGF有效地竞争结合固定 化KDR(VEGFR-2)受体。正如所预期的，C225，一种针对EGF受体的嵌合抗体既不结合 KDR(VEGFR-2)受体，也不阻断VEGF-KDR (VEGFR-2)的相互作用(没有表示)。实施例IX_4(e)磷酸化测定法在进行实验前，使亚汇合的HUVEC细胞在缺失生长因子的EBM-2培养基中生长 M-48小时。用50nM原钒酸钠预处理30分钟后，在有或没有抗体存在时，温育该细胞15分 钟，接着用20ng/ml的VEGF165或lOng/ml的FGF室温刺激15分钟。然后在溶解缓冲液(50nM Tris, 150mM NaCl, 1% NP-40,2mM EDTA，0. 25%脱氧胆酸钠，ImM PMSF，1 μ g/ml 亮抑蛋白 酶肽，1 μ g/ml胃蛋白酶抑制剂，10 μ g/ml抑肽酶，pH7. 5)中溶解该细胞，细胞溶解产物用 于KDR(VEGFRj)和MAP激酶磷酸化测定。KDR(VEGFRj)受体是用与抗KDR(VEGFRj)抗体， Mab4. 13(ImClone Systems)偶联的 A 蛋白琼脂糖珠(Santa CruzBiotechnology，Inc.，CA)从细胞溶解产物中免疫沉淀出来的。蛋白用SDS-PAGE分辨，并经过蛋白质印迹分析。为了 检测 KDR(VEGFR-2)磷酸化，用抗磷酸酪氨酸 Mab，PY20 (ICN Biomedicals, Inc. Aurora, OH) 探测印迹。对于MAP激酶活性测定而言，细胞溶解产物是用SDS-PAGE分辨的，接着使用磷 酸特异性MAP激酶抗体(New EnglandBioLabs, Beverly, ΜΑ)进行蛋白质印迹分析。所有 信号都是用ECL(AmershanuArlington Heights, IL.)检测的。在两个测定法中，用多克隆 抗KDR(VEGFR-2)抗体(ImClone Systems)再次探测该印迹，从而确保在SDS-PAGE凝胶各 道中加样等量的蛋白。c-plCl 1可有效抑制VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受体磷酸化和p44/p42MAP激酶 的活化。相反，C225则对VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受体活化和MAP激酶没有任何抑制作 用。单独的c-plCll和C225对KDR(VEGFR-2)受体和p44/p42MAP激酶的活性没有任何作 用。正如前面使用scFv plCll所见到的，c-plCll不能抑制FGF-刺激的p44/p42MAP激酶活 化(没有表示)。此外，scFv p2A6和p2A6的嵌合IgG形式(c-p2A6)都不能抑制VEGF-刺 激的KDR(VEGFR-2)受体和MAP激酶的活化(没有表示)。实施例IX-4 (f)抗有丝分裂测定抗KDR(VEGFR_2)抗体对VEGF-刺激的人内皮细胞有丝分裂的作用是用HUVEC，通 过[3H]-TdR DNA掺入测定法测定的。把HUVECGxlO3个细胞/孔)铺板于96-孔组织培养 平板上200 μ 1没有VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培养基中，37°C温育72小时。把不同量抗 体一式两份加入到孔中，37°C预温育1小时，然后加入VEGF165至16ng/ml的终浓度。温育 18小时后，向各孔中加入0.25 μ Ci的[3H]-TdR，再温育4小时。用闪烁计数器测定已掺入 DNA的放射性。图M所示数据表示至少3次的独立实验。c-plCl 1和scFv plCll可有效抑制VEGF刺激的HUVEC有丝分裂(图。与亲 代scFv相比，c-plCll对VEGF-诱导的HUVEC有丝分裂而言，是一种更强的抑制剂。抑制 VEGF-诱导的HUVEC有丝分裂的50%所需的抗体浓度分别是c_plCll为0. 8nM，scFv为 6nM。正如所预期的，scFv p2A6对VEGF-刺激的内皮细胞增殖没有任何抑制作用。根据上述说明以及很容易获得的参考文献和起始材料，本发明是可行的。然 而，申请人已经在美国典型培养物保藏中心，12301ParklawnDrive，Rockville，Md.， 20852USA(ATCC)中，保藏了下列产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系1994年1月沈日保藏的，产生大鼠抗小鼠flk_l (VEGFR-2)单克隆抗体的杂交瘤 细胞系 DC-IOl (ATCC 保藏号 HBl 1534)。1996年7月19日保藏的，产生小鼠抗小鼠flk_l (VEGFR-2)单克隆抗体Mab 25的 杂交瘤细胞系M25. 18A1 (ATCC登记号HB12152)。1996年7月19日保藏的，产生小鼠抗小鼠flk_l (VEGFR-2)单克隆抗体Mab 73的 杂交瘤细胞系M73. 24 (ATCC保藏号HB12153)。保藏是根据布达佩斯条约的规定，在用于专利程序及其条例(布达佩斯条约)的 国际微生物保藏机构进行的。这样做可确保活培养物自保藏之日起维持30年。根据布达 佩斯条约，在申请人和ATCC之间达成协议的情况下，可从ATCC获得生物体，这样可确保在 相关美国专利公开之后，不受限制地使用它。按照专利法的规定，在实行该发明时，无须在 任何行政机构的授权下使用保藏菌株。表1 抗-KDR (VEGFR-2) scFv 抗体的 KDR (VEGFR-2)结合分析
权利要求
1.治疗有效量的血管内皮VEGFR拮抗剂在制备用于与化疗剂联合抑制人肿瘤生长的 药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述肿瘤过量表达VEGFR。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肿瘤是乳腺，心脏，肺，小肠，结肠，脾，肾， 膀胱，头和颈，卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾丸，子宫颈或肝的 肿瘤。
4.根据权利要求1-3任何一项所述的用途，其中所述肿瘤是结肠肿瘤。
5.根据权利要求1-3任何一项所述的用途，其中所述肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)。
6.根据权利要求1-5任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂是用于静脉内给药。
7.根据权利要求1-5任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂是用于口服给药。
8.根据权利要求1-7任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂抑制VEGFR与其配 体结合。
9.根据权利要求1-8任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂结合VEGFR。
10.根据权利要求1-9任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂包含对VEGFR特异 的抗体，或其功能等同物。
11.根据权利要求1-10任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂是DClOl。
12.根据权利要求2-11任何一项所述的用途，其中所述EGn 拮抗剂是C225。
13.根据权利要求2-10任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂是DClOl，并且所 述EGFR拮抗剂是C225。
14.根据权利要求1-10任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂包含对VEGFR特 异的小分子。
15.根据权利要求1-10任何一项所述的用途，其中所述VEGFR拮抗剂是fms样酪氨酸 激酶受体(flt-1) VEGFR-I的拮抗剂。
16.根据权利要求1-15任何一项所述的用途，其中该药物进一步包含一种佐剂。
17.根据权利要求1-16任何一项所述的用途，其中所述肿瘤过量表达EGFR。
18.根据权利要求2-17任何一项所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂用于静脉内给药。
19.根据权利要求2-17任何一项所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂用于口服给药。
20.根据权利要求2-19任何一项所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂抑制EGFR与其配 体结合。
21.根据权利要求2-20任何一项所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂结合EGFR。
22.根据权利要求2-21任何一项所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂抑制EGFR与ATP纟口口。
23.根据权利要求2-22任何一项所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂包含对EGFR特异 的抗体，或其功能等同物。
24.根据权利要求2-22任何一项所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂包含对EGFR特异 的小分子。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述抗体含有人类抗体的恒定区。
26.根据权利要求23所述的用途，其中所述抗体是含有小鼠抗体可变区的嵌合抗体。
27.根据权利要求23所述的用途，其中所述抗体是含有可变区的人源化抗体，而可变区则含有小鼠抗体的互补决定区(CDRs)和人类抗体的构架区。
28.根据权利要求23所述的用途，其中所述抗体是含有人类抗体可变区的人类抗体。
29.根据权利要求1-11和14-17任何一项所述的用途，其中所述化疗剂选自顺钼，阿霉 素，紫杉酚及其组合。
30.根据权利要求1-11、14-17和四任何一项所述的用途，其中所述化疗剂不与VEGF 受体拮抗剂偶联。
31.根据权利要求1-11、14-17和30任何一项所述的用途，其中所述化疗剂选自顺钼， 达卡巴嗪，更生霉素，双氯乙基甲胺，链脲霉素，环磷酰胺，卡莫司汀，罗氮芥，阿霉素，柔红 霉素，丙卡巴胼，丝裂霉素，阿糖孢苷，依托泊苷，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，长春花碱，长春新 碱，博莱霉素，紫杉醇，多西他赛，阿地流津，天门冬酰胺酶，白消安，卡钼，克拉屈滨，达卡巴 嗪，氟尿苷，氟达拉滨，羟基脲，异环磷酰胺，干扰素α，利普安，甲地孕酮，美法仑，巯基嘌 呤，普卡霉素，米托坦，培加帕酶，喷司他丁，哌泊溴烷，光辉霉素，链脲霉素，他莫昔芬，替尼 泊苷，睾内酯，硫鸟嘌呤，噻替派，尿嘧啶氮芥，维诺利宾，苯丁酸氮芥，紫杉酚及其组合。
全文摘要
本发明涉及用血管内皮生长因子受体拮抗剂抑制肿瘤生长的联合疗法。具体地，本发明提供一种减轻或抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，包括用治疗有效量的VEGF受体拮抗剂与放疗，化疗，和/或其它受体拮抗剂联合治疗哺乳动物。
文档编号A61P35/00GK102133403SQ20101058401
公开日2011年7月27日 申请日期2002年3月4日 优先权日2002年3月4日
发明者I·戈尔茨坦 尼尔, 帕特里夏·罗克韦尔 申请人:英克隆有限责任公司