脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液及其制备工艺的制作方法

专利名称：脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液及其制备工艺的制作方法
脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液及其制备工艺
(-)发明领域本专利发明属于医药领域，特别涉及一种口服胰岛素脂质体新剂型，具体说是涉 及脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液及其制备工艺和药学用途。同时，本发明专利的工 艺设计和制备技术，为其它蛋白多肽类生物工程药物的口服给药或其它给药方式提供制备 技术方法，从而为其发展新药剂型和开辟给药新途径。
(二)技术背景糖尿病是继心血管疾病、癌症之后致残率、致死率最高的全球第三大疾病。国际糖 尿病联盟大会估计全球糖尿病患者约达一亿八千万，每年以2-3%的速度增长，各国都大力 开发糖尿病治疗的新剂型研究。糖尿病分I型和II型。I型糖尿病患者胰脏不能产生胰岛素，青少年为主，约占 10-15%。II型患者以中老年为主，是由于体内胰岛素释放延迟，受体数量减少或其敏感性 降低所引起的胰岛素相对缺乏，约占85-90%。临床证明I型患者绝对依赖胰岛素治疗才 能维持生命；II型患者中约占50%的下列严重类型也需胰岛素治疗；包括(1)感染严重、 中度创伤、精神受刺激和手术治疗的患者，他们体内抗胰岛素激素增多口服降糖药无效； (2)肝、肾功能损害者需长期使用胰岛素；(3) 口服降糖药无效需改用胰岛素治疗；(4)糖 尿病眼底病变出血时需用胰岛素治疗；(5)糖尿病急性病发症时需用胰岛素控制；(6)线粒 体糖尿病是新发现的II型糖尿病特殊亚型(我国患病率中约占0. 5-1 % )，比一般II型 糖尿病预后差，慢性并症发生率高，需用胰岛素治疗。因此，胰岛素是约60%糖尿病患者不 可替代的核心药物。目前胰岛素治疗糖尿病仍是注射等外周给药为主，包括长期使用的肌 肉注射、皮下注射、静脉注射等，它虽能暂时控制外周血糖，但外周给药的三大严重弊端始 终存在并危及患者康复和生命(1)除了不便和痛苦，主要是不能避免并发症，包括心脑血 管病变，肾病视网膜病变等；约90%糖尿病患者最后都可能死于心脑血管并发症。注射还 会产生红肿、皮下小结和脂肪萎缩，甚至引起肌肉坏死和造成终生残疾；( 静脉注射造成 血液中胰岛素水平相对过高(circulationhyperinsulinezation)和肝内胰岛素浓度过低 (hepatic hypoinsulinezation),造成高血胰岛素症(hyperinsulinemia)弓I发低血糖及 视力模糊等严重不适，违背了生理条件下肝内胰岛素浓度比外周血中大3-11倍的正常需 求[曾明德等，肝脏与内分泌，1995，plll-119] ； (3)注射胰岛素只使肌肉和脂肪吸收外周 血糖并以糖原沉积；但肝脏得不到高浓度胰岛素，难以发挥其调控血糖和血脂的主导作用， 不能清除血清HbAcl、氧自由基、多元醇等对肝器官等的损伤，不能避免并发症。因此，国 际糖尿病联盟号召发展非注射型胰岛素等口服新药剂型，来代替外周注射。Lichtenberg， D. (1988)总结了 40多年脂质体技术与其它学科技术相互关系及其生产基本原理，为解决 这一世界难题提供了理论依据和可行性生产技术基础[Lichtenberg，D. (1988) Liposomes preparation, characterisation, and preservation. Methods Biochem. Anal. ,33, 337-362.]。首先，胰岛素口服给药途径必要性及其理论依据。胰岛素是在胰腺β-细胞内合成的一种蛋白质激素，在生物体内生理活动时限(半寿期)为70分钟。胰岛素在细 胞内合成后在体内的运输和转移，多以被包裹在脂质膜泡内(Membrane vesicle)的形式， 通过与细胞质膜融合外吐(Exocytosis)从胰腺分泌进入肠系膜-胰静脉汇入肝门静脉， 再与细胞膜表面受体蛋白结合形成膜泡以膜融合内吞(Endocytosis)等方式进入肝脏，以 及再以膜融合外吐(Exocytosis)入血。大量文献证明，胰岛素在肝脏内停留63分钟(占 其生理活动时限的90% )，首先起着调控血糖、脂和蛋白等代谢的主导和核心作用；包括 (1)促进外周血糖吸收和糖原合成，抑制肝糖原降解和糖原异生，降低肝内葡萄糖生成的 基础速率(HGP，Hepatic Glucose Production)。此种‘短期效应’约能控制血糖总量的 60-70% ； (2)调控脂质代谢的‘中期效应’，抑制脂解(lipolysis)、脂肪酸和甘油酯动用 (FFA mobolization)以及血酮体症生成(ketogenesis) ； (3)调控肝内蛋白代谢以及细胞 生长和分裂的‘长期效应’，对免疫功能重要。此外⑷胰岛素在肝中促进库否’(Kupffer) 细胞和内皮细胞及肝实质细胞大量吸收外周血糖和清除血清糖化蛋白终末产物(AGEsjn HbAlc)的‘独特效应’，以及清除氧自由基，多元醇等有害物质，对保护肝功能和预防糖尿病 并发症有特别意义；(5)胰岛素在肝中‘灭活’(‘首过效应’)后余下约50%胰岛素再从肝 细胞中以‘外吐’膜融合途径流入外周血，在血中循环6-7分钟，促进肝外的肌肉和脂肪等 摄取外周血糖(Extra-h印atic GlucoseUptake，E⑶)达到控制外周血糖总量的25%左右， 从而使HGP < EGU,导致外周血糖的稳定。胰岛素在血循环中还抑制脂解、抑制脂肪酸和甘 油酯动用及其引起的血酮体症等。因此，只有口服脂质体胰岛素剂型才能模拟以膜泡形式 使包裹的胰岛素进入肠道和肝脏，模拟生理条件下，胰岛素在肝内在肝外血循环两个时段 能发挥作用，以治疗糖尿病高血糖，高血脂，高血酮体，高HbAlc和恢复肝脏调控代谢功能， 达到肝内HGP <肝外E⑶，以维持血糖稳定，并防止并发症的发生。这是发挥胰岛素药效作 用的最佳途径选择。 第二，‘脂质体包裹胰岛素’是‘ 口服胰岛素’各剂型中的最佳选择。80年代世 界各国实验室报道的包裹胰岛素的口服制剂有脂质体、微囊剂、纳米材料微粒、油乳剂等 多种非注射的口服剂型。但是，唯有脂质体口服剂型有下述特点和优点(1)脂质体与生 物体内天然磷脂双分子层膜泡结构完全相似，有生物组织相溶性，无毒性及免疫原性；(2) 可制成不同粒径大小，不同电荷，膜脂流动性、稳定性和寿命以及靶向性等[Lichtenberg， D. (1988)Liposomes preparation, characterisation, andpreservation. Methods Biochem. Anal.，33，337-362. ] ； (3)可完全生物降解，安全性好；(4)最为重要的是，脂质 体膜泡与胰岛素类活性蛋白在体内存储和运转的膜泡形式完全相同或相似，能模拟胰岛素 进入肝脏和血循环中调控外周血糖，维持肝脏细胞结构和正常代谢功能。因此各国都寄 希望于脂质体。事实上，口服脂质体胰岛素剂型也是最早经动物实验证明成功的事例之 一。1976年，英国著名脂质体研究先驱Gregoriadis报道它可降低大鼠血糖[Dapergolas， G. &GregoriadisG.，1976，Lancet，2，824-827]。直到上世纪末，全球十多家实验室研究进一 步证实口服脂质体胰岛素具有抵抗胃肠道消化和降低外周血糖的效果证明口服脂质体胰 岛素能通过内吞(Endocytosis)的膜融合方式被小肠上皮细胞微绒膜吸收，然后在小肠细 胞内以小膜胞运动到肠细胞另一侧，再以胞吐(Exocytosis)膜融合方式释放出胰岛素；后 者以自由分子溢出和进入血流汇入肠系静脉和肝门静脉，再与肝细胞膜受体结合形成膜泡 进入肝脏。但也可能在肠细胞内融合于Endosomes膜或溶酶体膜而被降解，或者通过淋巴管体系进入肝脏；如果高浓度的自由胰岛素分布在细胞表面，也可以胞饮方式进入肠细胞。 多种试验证明，脂质体通过适当修饰，可对胃酸、胆酸盐和胃肠道消化酶稳定；口服脂质体 胰岛素在降低外周血糖同时，也发现糖尿病动物外周血有外源胰岛素出现，而无平行的胰 岛素C肽。这也是口服脂质体胰岛素通过肠道和肝脏细胞膜再进入外周血循环，模拟生理 条件下胰岛素在肝脏和血循环中发挥降糖作用的进一步证明。脂质体膜结构研究的这些优 势奠定了生产技术可靠性和临床应用可行性的坚实基础，是其它口服方式和非生物磷脂膜 材料包裹胰岛素的口服剂型不可能具备的！第三，但是，直到目前，“口服脂质体胰岛素”和其它“ 口服胰岛素”新剂型 一样者β 尚未成功问世[Adel Pinhasi Mila Gomeberg, Patent application title SolidComposition for Intra-Oral Delivery Insulin, Patent No :20090274756, USPC, Class :424484 ；Martin fferle, et al.，Sci Pharm. (2008)76 :751-760, doi :10.3797/ scipharm. 0806-04 ；Τ. 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Ozawa (1992)实验证明， 外周注射胰岛素仅起到表面降低血糖效果，但不能恢复肝脏的ATP的合成能力和能量代谢 正常化。相反，同一剂量胰岛素进入肝门静脉不但可使严重糖尿病大鼠的血糖恢复正常化， 而且还会使肝脏ATP的合成能力和能量代谢正常化[Ozawa，k.，MedicalTribune, Tokyo, Japan, 1992，p35_37]。因此采用包括降血糖在内的多指标治疗糖尿病病症来全面评价口服 胰岛素剂型的综合药效，以便能符合胰岛素在生物体内有多途径，多时相，多部位的生理功 能，包括抗脂解、抗血酮症、降血糖、促进生长发育、降低糖化血红蛋白等；也可符合治疗糖尿病需要降低高血糖，高血清糖基化血红蛋白，高血脂，高血酮体，肥胖等多种病症指标的 客观病理实际。但目前尚很少见到用多病症指标和长期多次口服胰岛素剂型来评价其治疗 糖尿病药效标准的研发报道。第四，本发明专利的目的是提高口服脂质体胰岛素包裹率，增加脂质体结构在体 内外的稳定性，促进口服脂质体胰岛素进入肝脏和血循环及提高其生物利用度，拓宽口服 胰岛素包括降血糖在内的多指标综合治疗糖尿病的效果范围，从治本治标两方面达到治疗 糖尿病要求。因此，集中解决下述关键技术(1)模拟生物体内胰岛素以单室膜囊泡形式进 行分泌，融合和运转规律和特点，(2)根据磷脂在水化反应中形成封闭单室膜囊泡和相互融 合，及其与蛋白相互作用的物理化学机制和环境条件，(3)采用了相应周全的配制单室脂质 体组成比例和工艺设计，(4)创新地应用了真空冷冻‘控制去水化/保湿’制备工艺和程序， 制备了 ‘脂质体包裹胰岛素冻干制剂(SCLI) ’，使其小单室脂质体(平均粒径为30-120纳 米)在水化力改变过程中相互融合增大为大单室脂质体(平均粒径为1000纳米)[图1，图 2]，胰岛素包裹率提高达80%以上，(5)新创了 ‘分别定容/分步液化’制备程序和工艺，在 液化SCLI时能保护大单室磷脂脂质体的结构完整使其平均粒径保持1000纳米[图2]，胰 岛素不泄漏，使大单室磷脂脂质体的胰岛素包裹率80%以上；相反，通常一次直接水化的 脂质体胰岛素包裹率仅在40%。本专利发明克服了普遍存在的脂质体包裹率和生物利用度低，剂型生产稳定性 差等诸多难题，提供了的一种全新的大单室磷脂脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即 O-SCULI ；其脂质体胰岛素包裹率高，生物利用度高，结构稳定性好，工艺简便新颖，既解决 了 ‘脂质体包裹胰岛素冻干制剂’储存运输难题，又解决了 O-SCULI剂型的大单室脂质体膜 易破裂和胰岛素泄漏问题及其口服精确定量问题，因而，O-S⑶LI 口服悬液具有包括降低外 周血糖(生物利用度高达22. 2%)以及其它综合治疗糖尿病多指标的创新功能；O-SCULI 新药剂型是口服脂质体胰岛素剂型的新发展，其制备程序及工艺方法也为制备其它多肽与 蛋白类生物工程药物的非注射给药开辟新途径。

发明内容
本发明专利的目的和解决关键问题在于提高口服脂质体胰岛素包裹率，增加脂 质体结构在体内外的稳定性，促进口服脂质体胰岛素进入肝脏和血循环及提高胰岛素的生 物利用度，拓宽口服胰岛素包括降血糖在内的多指标综合治疗糖尿病的效果范围，从治本 治标两方面达到治疗糖尿病的要求。因此，本发明专利主要涉及提供一种脂质体包裹胰岛 素冻干制剂口服悬液O-SCULI新剂型来集中解决上述长期存在的口服脂质体胰岛素制剂 的诸多关键性难题。本发明专利同时还提供一种脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶Li，新 剂型的制备工艺和药学用途。为上述目标的全面实现，本发明专利的实施技术方案是首先提供一种脂质体包裹 胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶Li，包括以下成分及其在每1升O-S⑶LI 口服悬液中毫 摩尔数为卵磷脂，5-50;胆固醇，5-50;
聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-EthyleneGlycol Fatty Acid Esters), 5-50 ；维生素E，0· 1-0. 5 ；胰岛素，1-10;氯化钠，1-20;磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液，1-80 ；在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI的上述口 服水悬液也是包括脂质体包裹胰岛素冻干制剂，即SCLI制剂，和特定比例的能使SCLI制剂 液化为O-SCULI 口服水悬液的定容分步液化溶液，所述SCLI制剂的组份为卵磷脂、胆固 醇、聚乙二醇脂肪酸酯、维生素E、生物胰岛素和水，所述SCLI制剂中的卵磷脂、胆固醇、聚 乙二醇脂肪酸酯三种脂质组份之间的摩尔(mole)比为1-10 1-10 1_10，维生素E和 胰岛素与所述三种脂质组份重量和之比分别为0. 5-5%和5-50%，水和SCLI的重量比为 0. 01-2. 5%。在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI的上述 口服水悬液中尚包含有定容分步液化溶液，所述定容分步液化溶液是由特定配比浓度为 0. 01-0. 3M氯化钠溶液(液化溶液A)，和浓度为0. 01-0. IM中性pH磷酸钠缓冲溶液(液化 溶液B)所组成，所述液化溶液A与液化溶液B的用量比为0. 1% -20%，以用于分别定容/ 分步液化技术将上述SCLI制剂液化成O-S⑶LI 口服悬液。在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI中，所 述卵磷脂，是指蛋黄卵磷脂，大豆卵磷脂，牛心卵磷脂或其它生物来源的卵磷脂中一种或 几种，所述卵磷脂总量中含有的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)和磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanylamine)的摩尔％比分别为50-95%和5-25%，所述卵磷脂也可以是 与上述生物卵磷脂含有相同比例的合成磷脂酰胆碱和合成磷脂酰乙醇胺组成。在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI中，所述 聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid Esters)，其组分中的脂肪酸组 分是二硬脂酸(Distearate)，二异硬脂酸(Diisostearate)、单硬脂酸(Monostearate) 的一种或几种，其组分中的聚乙二醇组分(Poly-ethylene glycol, PEG)，是二聚衍生物 (PEG-2)，四聚衍生物(PEG-4)、八聚衍生物(PEG-8)、十聚衍生物(PEG-10)或四十聚衍生物 (PEG-40)的一种或几种；所述聚乙二醇脂肪酸酯可组成包围磷脂脂质体膜双分子外面保 护层，能保护脂质体在胃肠道内的稳定，也能在肠道内中性PH条件下，被肠液酯酶水解，使 部分聚乙二醇脂肪酸酯被水解为一硬脂酸、二硬脂酸或异硬脂酸和聚乙二醇，并相应释放 出H+O在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI中，经冰 刻蚀电子显微镜检查，所述O-SCULI 口服悬液中的胰岛素是被包裹在SCLI制剂单室磷脂脂 质体内，所述被包裹的胰岛素多以二(聚)体和六(聚)体的形式排列在脂质体内膜表面， 显示其生物大分子天然立体结构的特性[图1]。在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI中，经 PAGE-SDS凝胶电泳检查，所述O-S⑶LI 口服悬液中的胰岛素是被包裹在SCLI制剂单室磷脂 脂质体内，与对照标准胰岛素相比具有完全相同的蛋白区带分布，显示其天然生物化学结 构和性质。
在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI中，所述 O-SCULI 口服悬液中被包裹在SCLI制剂单室磷脂脂质体内的胰岛素，按药典95版二部附 录XIIG检定法，经用四组昆明小鼠和进行三批O-S⑶LI生物测定，证明被包裹在单室磷脂 脂质体内的胰岛素与对照标准胰岛素具有完全相同对昆明小鼠的降血糖生物活性，按照生 物检定统计法中量反应平行线测定双交叉设计法计算效价及实验误差，结果证明回归非常 显著，偏离平行不显著，实验结果成立，从而说明，本发明专利所述的包裹于脂质体内的胰 岛素，仍保留其完好的天然降血糖生物活性。在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI中，所述 胰岛素是生物来源经人工纯化的猪胰岛素或牛胰岛素，也可以是基因重组人胰岛素，或其 各种长效，中效或速效的药用胰岛素衍生物。在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI中，所述 O-S⑶LI 口服悬液中含有的SCLI制剂单室磷脂脂质体，是经O-S⑶LI制备程序第一步独特 的真空冷冻控制去水化/保湿工艺制成，所述单室磷脂脂质体平均粒径为1000纳米[图 2]，其胰岛素包裹率为80%以上。本发明专利还提供一种脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI制备程 序第一步的独特的真空冷冻控制去水化/保湿工艺，即用于制备所述脂质体包裹胰岛素冻 干制剂，即SCLI制剂工艺，包含如下各步骤(a)将本发明专利所述的SCLI制剂的组成配比，选用任何一种制备小单室脂质体 方法，包括用有机溶剂完全溶解、减压旋转蒸发、充份干燥和加水充份水化，最后制成卵磷 脂浓度为0. 01-0. 15摩尔(M)的小单室磷脂脂质体及其平均粒径为30-120纳米的悬液A ；(b)将选用的胰岛素干粉，用重蒸去离子水制成胰岛素水溶液为溶液B ；(c)将上述方法步骤(a)和(b)制备的悬液A和溶液B，相互充份混合制成悬液A 和溶液B的小单室磷脂脂质体悬液和胰岛素溶液混合悬液C ；(d)所述混合悬液C经定容分装、充氮、真空冷冻控制去水化/保湿以制成大单室 磷脂脂质体包裹胰岛素冻干制剂，即SCLI制剂。在本发明专利所述的脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI中，所述 制备脂质体包裹胰岛素冻干制剂，即SCLI制剂的真空冷冻控制去水化/保湿工艺中，所述 步骤(a)包括(al)，用精制氯仿或氯仿甲醇有机溶剂在旋转蒸发瓶中完全溶解卵磷脂、胆固醇、 聚乙二醇脂肪酸酯，维生素E ；其在有机溶剂中相应含量，mg/ml，分别为5-50、5-50、5-50、 0. 1-0. 5 ；(a2)，将上述完全溶解的有机溶剂，在其沸点温度下减压旋转蒸发至有机溶剂完 全回收；(a3)，将上述有机溶剂完全回收后的卵磷脂脂质膜置于室温下充份干燥，加重蒸 去离子水充份水化制成水化液，使卵磷脂脂质浓度为0.01-0. 15摩尔(M)；(a4)用超声法或其它方法将上述卵磷脂脂质水化液制成平均粒径为30-120纳米 的小单室磷脂脂质体悬液为悬液A ；所述步骤(b)包括(bl)胰岛素干粉置于pH调到2. 0-2. 5的盐酸水溶液中完全溶解，浓度为5_50mg/ml ；(b2)再用氫氧化钾溶液将胰岛素酸性溶液调回到pH为7. 2以制成溶液B，所述步 骤(c)包括(cl)将上述(a4)步骤制成的悬液A与( )步骤制成的胰岛素溶液B按两者体积 比例为0.5-5.0 1.0-10.0相互混合制成小单室磷脂脂质体悬液和胰岛素溶液混合悬液 C ；(c2)将上述混合悬液C进行定容分装；(c3)定容分装后混合悬液C置于零下10-20°C下，经小时真空冷冻控制去 水/保湿程序，使SCLI制剂中保湿水分逐步达标到0. 01-2. 5%，使其小单室脂质体相互融 合逐步增大为大单室脂质体；所述步骤(d)包括(dl)将上述SCLI制剂进行充N气、压盖、密封后，零下10-20°C保存待用；(d2)在SCLI制剂保存的三年时期内，对SCLI制剂脂质体大单室膜结构及胰岛素 包裹率和胰岛素活性进行定期测定和检查。本发明专利还提供一种脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI制备程 序第二步的分别定容/分步液化工艺，即用所述定容分步液化溶液对所述SCLI制剂进行液 化处理以完成O-S⑶LI 口服悬液的工艺，包括下述步骤(a)所述定容分步液化溶液，是氯化钠溶液和中性PH磷酸缓冲液，所述分别定容/ 分步液化，其第一步液化是用一定容量氯化钠溶液对SCLI制剂进行液化处理；(b)其第二步液化是再加入一定容量的中性pH磷酸缓冲液对SCLI制剂进行液化 稀释，最终使SCLI制剂完全制成O-S⑶LI 口服悬液；(c)对SCLI制剂进行第二步液化后制成的O-S⑶LI 口服悬液进行脂质体胰岛素包 裹率测定，以计算单位体积口服悬液单室脂质体胰岛素包裹量作为口服用量参照；在本发明专利所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液制备程序第二步将SCLI 制剂制成O-S⑶LI 口服悬液工艺中，所述步骤(a)包括(al)所述先用一定量氯化钠溶液对SCLI制剂进行第一步液化，是指加入的氯化 钠溶液容量与用中性PH磷酸钠缓冲溶液第二步液化的容量的比为0. 1% -20% ；所述步骤(b)包括(bl)所述再加入一定容量的中性pH磷酸缓冲液对SCLI制剂进行第二步液化，是 指所加中性PH磷酸钠缓冲溶液容量为两步液化所用溶液总容量的80-99. 9% ；(b2)所述SCLI制剂总重量与被所述定容分步液化两步液化溶液的总容量比为 5-80mg/ml ；(b3)所述SCLI制剂中胰岛素总重量与被所述定容分步液化溶液两步液化的总容 量比为 2-20mg/ml ；(b4)所述SCLI制剂中胰岛素总重量与(b!3)步骤所述定容分步液化溶液两步液化 的总容量比，亦即与O-S⑶LI 口服悬液的总容量比为2-20mg/ml ；所述步骤(C)包括(cl)所述对O-S⑶LI 口服悬液进行脂质体胰岛素包裹率测定，即首先将4毫升最 终制成的O-S⑶LI 口服悬液进行35000rpm超速离心60分钟，使包裹胰岛素脂质体完全沉淀与离心上清液完全分开；(c2)再取出一定量离心上清溶液，平行三份，各加等量水和3毫升考马斯亮兰溶 液，室温下测定595nm的OD值，计算脂质体胰岛素平均包裹率和平均精确度；(c3)同时再取出一定量离心上清溶液和沉淀脂质体的甲醇溶液，各平行三份，用 紫外分析法分别读取278nm的OD值和279nm的OD值，即A278 (代表不含脂质体的离心上 清溶液)和A279 (代表沉淀脂质体)，按A279/A279+A278 X 100 %来计算脂质体胰岛素平均 包裹率及其平均精确度，与步骤(^)进行对比，根据本发明专利所述步骤(^)和步骤(c3) 的脂质体胰岛素平均包裹率都在80%以上，其平均精确度都在96-103%，两种方法结果完 全吻合和一致；(c4)，按上述步骤(c 2)和步骤(c 3)的脂质体胰岛素平均包裹率，根据每单位体 积的O-SCULI 口服悬液的脂质体包裹的胰岛素平均总量的IU数，来计算和标定口服用量。本发明专利所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI经过对本发明 专利设计建立的具有多项糖尿病病症的糖尿病大鼠进行急性口服实验，证明同时具有降血 糖(Hypoglycemic effect)，降游离脂肪酸(free fatty acids)和降血酮体(bloodKetone body)的明显效果，与注射胰岛素对照的降血糖相比，相对药理生物等效性最高达22. 2%, 具量效关系，其降低血游离脂肪酸效果明显优于注射胰岛素，降低血酮体效果比注射胰岛 素更为明显和持久[图3A，图3B ；图4A，图4B ；图5A，图5B]。本发明专利所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI经对本发明专 利设计建立的具多项糖尿病病症的糖尿病大鼠连续六周长期口服实验，证明其综合治疗效 果有降低血糖化血红蛋白(HbAlc)，降低甘油三脂(TG)和转氨酶(ALT)，降低氧自由基生 成(R0Q和氧化应激(Oxidative Mress)，降低MDA，提高清蛋白(Alb)合成和清/球蛋白 比(A/G)，提高GSH-Px活性和GSH-Px/MDA比值；明显恢复肝脏细胞和肝线粒体的显微和亚 显微结构，维持健康体重，避免长期注射胰岛素引起的肥胖，其中多项指标的改善显著优于 胰岛素注射外周给药[图6，图7，图8]。本发明专利所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI及其制备工艺 同样应用于包裹胰岛素以外的其它生物活性多肽和蛋白，包括细胞色素C，干扰素，清蛋白。总之，本发明专利首先是根据生物磷脂在水化反应中形成膜双分子层封闭膜囊泡 的原理和环境条件，膜脂和蛋白互动和膜融合的分子机制，为模拟生理条件下胰岛素包裹 在单室磷脂膜泡内的形式在体内储存和运行，口服后脂质体能抵抗胃肠道的蛋白酶水解， 并以膜融合‘内吞’和‘外吐’方式使脂质体内的胰岛素进入肠细胞和肝门静脉，并靶向肝 脏和部分再从肝脏分泌进入血循环这一生理过程作为所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口 服悬液，即O-SCULI及其制备工艺的全面参照指标。其次，本发明专利设计的特定配比的磷 脂膜组份，由于使用真空冷冻控制去水化/保湿的制备工艺，因而在使脂质体和胰岛素混 合悬液体系中疏水力逐步减弱过程中，小单室磷脂脂质体间相互融合增加，其单室磷脂脂 质体粒径加大约十倍，使平均粒径100纳米增大至1000纳米[图2]；在此过程中脂质体与 分散的胰岛素分子之间相互接触加强，导致胰岛素包裹率稳定增高达80%以上(这比通常 脂质体胰岛素包裹率为20-40%要高出1-2倍)，这是本发明专利所述的控制去水化/保湿 的制备工艺的创新性。同时，由于SCLI制剂组分配比合理使脂质体结构稳定性和安全性 好，包裹在脂质体内胰岛素分子结构及生化和药学活性保持完好，生产工艺简便新颖，SCLI制剂易于长期储存和运输，优越性突出。再者，由于使用于分别定容/分步液化技术的液化 溶液为生理浓度的无机盐溶液，其离子强度较大，可使磷脂脂质体分散，平均粒径保持1000 纳米左右[图2]，保持O-S⑶LI 口服悬液中的单室膜囊泡结构稳定不易破裂，封闭性好，因 而胰岛素不泻漏，使胰岛素包裹率保持80% (比通常冻干脂质体直接水化时泄漏率高达 40%，胰岛素包裹率高一倍)；第三，本发明专利的分别定容/分步液化技术，可将SCLI制 剂液化成O-SCULI 口服悬液，便于精确计算口服定量，克服了脂质体胰岛素冻干制剂不好 精确定量口服的缺点。上述O-SCULI脂质体剂型的单室膜囊泡结构方面的独特创新，既与本发明专利的 上述特定制备程序和工艺有关，也与单室脂质体剂型口服悬液含有特定组份配比有关首先，本发明专利的权利要求4所述，脂质体磷脂组成中的磷脂酰胆碱(PC)和磷 脂酰乙醇胺(PE)能组成脂质体膜双分子层封闭膜囊泡的基本结构；在O-S⑶LI的磷脂组成 特定配比中，PC和PE的比例分别占卵磷脂总量的摩尔比％为50-90%和5-50% ；该两种磷 脂特定配比既保证单室脂质体膜结构稳定，又利于在生理条件下单室脂质体膜表面有一定 比例PE头部结构，易于与肠肝组织的细胞膜相互作用和发生膜融合等‘内吞’和‘外吐’方 式实现转运，从而有利于胰岛素在体内的分泌和运输和进入肠细胞和肝脏。其次，在膜磷脂的特定配比中，卵磷脂和胆固醇的摩尔(mole)比为1-10 1-10； 维生素E和膜磷脂的总重量比为0. 5-5% ；加入的胆固醇由于与PC的亲和性高，加入的维 生素E由于其脂溶性和抗脂质过氧化功能，两者都能起到长时间加强和保护单室脂质体膜 囊泡双分子层膜结构稳固的作用。再者，本发明专利的权利要求5所述，在膜磷脂的特定配比中，聚乙二醇脂肪酸酯 (Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid Esters)和卵磷脂的摩尔(mole)比为:1-10 1-10 ； 聚乙二醇脂肪酸酯由于其脂肪酸链的疏水性能固定在脂质体膜双分子层结构中；其聚乙二 醇的多羟基糖链的亲水性能保护脂质体膜外表面水化层，因而在控制去水化/保湿的制备 过程中，既有利于水溶性胰岛素分子与磷脂膜的结合和在脂质体形成和脂质体融合中增加 胰岛素包裹量；也能起到在脂质体形成后有效保护和固定单室脂质体膜外表面结构，故能 在口服后抵抗胃肠道蛋白酶类和胆汁等对脂质体膜的消化破坏；本发明专利内容中的相关 实验证明，小鼠肠溶液中的酯酶可使O-SCULI脂质体中平均17%的聚乙二醇脂肪酸酯水解 为聚乙二醇和质子(H+)，质子能造成膜表面局部酸化和增加正电荷，聚乙二醇能改变水相 的结构性，两者都可能诱发和促进脂质体外表面与肠细胞膜负电性表面接触，易于发生内 吞等膜融合[S-s,Liu. Current Biochemical Research inChina, (Ed. C. L. Tsou) ,Academic Press, Inc. New York, 1989, pp : 161-172]，从而有利脂质体释放与转运胰岛素的独特效果， 并有利于促进胰岛素进入肠-胰系静脉汇入肝门静脉入肝和入血，能发挥胰岛素控制糖代 谢等多种生理功能的整合作用。最后，口服悬液中的生理浓度氯化钠和中性pH磷酸钠缓冲液，保持悬液中较强的 离子键力的作用，适合于包裹胰岛素的磷脂脂质体膜泡在体内运行的生理内环境，故能保 护和利于单室脂质体结构和功能的稳定。因此，按本专利说明书内的‘实施方案三’制备的具上述特点的O-S⑶LI 口服悬 液，及其对本专利申请书中所述对糖尿病大鼠模型急性口服O-SCULI实验证明，口服2，5， 10，20，40IU/kg的口服O-S⑶LI剂量与引起糖尿病大鼠血糖下降效果，分别相当于注射胰岛素阳性对照组降糖效果的23.8%，32. 2%，42. 1% -87%, 78%, 103% ；呈良好量效关系 [图3A，图: ]. 口服后6-9小时内的药理相对生物学等效性，分别达到注射胰岛素阳性对 照组的 21.0-21.6% (2IU/kg B. W.), 7. 5-22.2% (5IU/kg B. W.), 5. 4-13.9% (10IU/kg B. W. ),4. 0% (20IU/kg B. W. )4. 3% (40IU/kg B. W.)，与 口服剂量呈反向的量效关系[图 4A，4B]。这与生理条件下胰岛素对外周血糖反应的分泌量(胰岛素分泌反应μ U/ml -hr) 和胰岛素在血循环中刺激外周组织摄取血糖量(胰岛素降外周血糖效应:mg/m7min)的反 向量效关系十分吻合[Robert, Μ. Berne, Matthew. N. Levy =Physiology, 3rd, 1993, p867, USA]。用正常大鼠作预备实验证明口服O-S⑶LI后引起血糖下降的同时，也检测到血中胰 岛素含量的同步升高，但C肽水平不变；口服空白脂质体阴性对照则未见任何降血糖作用； 从而更进一步证明口服O-S⑶LI的降血糖效果是由于胰岛素经过肝脏到血循环过程都发 挥了调控糖脂代谢作用的结果。本专利发明所述的O-S⑶LI剂型的另一创新性功能和优越性还表现为急性口服 O-S⑶LI实验还证明，在降血糖的同时还明显降低血游离脂肪酸和血酮体，后者还显著优于 注射胰岛素[图5A，图5B]。本发明专利所述的O-SCULI剂型的其它创新性功能和优越性还表现为长期(六 周每日两次)连续口服O-S⑶Li，降低糖尿病大鼠血清糖基化血红蛋白(HbAlc)[附图6]、 血清甘油三脂(TG)[附图7]、转氨酶(ALT)、体内氧化应激(MDA)、心脏和肝脏线粒体氧自由 基(ROS)生成等；同时提高肝脏蛋白合成(Alb、TP)和白/球(A/G)比、GSH-Px/MDA比、血 清高密度脂蛋白(HDL-C)等；改善与恢复糖尿病动物肝细胞显微和亚显微结构和肝损伤， 保持健康体重等；避免注射胰岛素副作用和表现更佳综合疗效[附图8]。总之，本发明专利的O-S⑶LI经过对昆明小鼠的LD5tl测定，证明0_S⑶LI 口服剂型 非常安全可靠；在克服口服脂质体剂型普遍存在的包裹率和生物利用度低，生产稳定性三 大难题的基础上，实现了胰岛素包裹率高，生物利用度高，生产工艺新颖简便，结构稳定性 好，便于储存运输和口服精确定量，能模拟生理条件下胰岛素以膜泡包裹的形式和多种膜 融合的机制进入肠-胰系静脉汇入肝门静脉入肝和入血，因此具有包括降血糖在内的综合 治疗糖尿病多指标的创新功能；是口服脂质体胰岛素剂型的新突破，可应用于糖尿病I型 和严重II型患者的综合治疗，明显优于注射胰岛素外周给药途径。第五，本专利发明的O-S⑶LI 口服悬液新制剂的制备程序和生产工艺也为其它多 肽与蛋白类生物工程药物开辟非注射给药新途径和新用途，前景十分显著。


下面将结合附图及实施案例对本发明作进一步说明，附图中图1，脂质体包裹胰岛素制剂口服悬液，O-S⑶LI样品及空白脂质体电镜图片小单室脂质体，示锇酸固定口服悬液O-SCULI的单室脂质体电镜切片，平均粒径 1000纳米；负染图片，示口服悬液O-S⑶LI单室脂质体的磷钨酸负染图片，平均粒径1000纳 米hsulin，示O-S⑶LI样品的冰冻蚀刻电镜图片，图上部两个单室脂质体内膜上分 布的胰岛素颗粒，
多为二体和六体的排列(放大150，000X，其粒径在620纳米左右)；空白脂质体，图下部为空白单室脂质体，内膜无胰岛素颗粒(放大150，000X，其 粒径在600纳米左右)；图2脂质体包裹胰岛素制剂口服悬液中的单室脂质体粒径测定(单室脂质体平均 粒径1000纳米的常态分布)图3A，3B，口服0_S⑶LI和注射胰岛素对糖尿病大鼠降血糖作用比较(实验数据统 计见说明书)图4A，4B，口服0_S⑶LI剂量对糖尿病大鼠降血糖生物等效性(实验数据统计见说 明书)图5A，口服O-S⑶LI和注射胰岛素对糖尿病大鼠降血糖和游离脂肪酸的比较(实验数据统计见说明书)图5B，口服O-S⑶LI和注射胰岛素对糖尿病大鼠降血酮体的比较(实验数据统计见说明书)图6，六周长期连续口服O-S⑶LI和注射胰岛素对糖尿病大鼠降糖基化血红蛋白 的比较Normal Ref，正常大鼠血糖基化血红蛋白(HbAIc)值％Control，糖尿病大鼠血糖基化血红蛋白(HbAIc)值％0. 5IU/kg SC. hs，注射胰岛素的糖尿病大鼠血糖基化血红蛋白(HbAIc)值％10IU/kg oral LEI，口服10IU/kg 0-SCULI的糖尿病大鼠血糖基化血红蛋白 (HbAIc)值％5IU/kg oral LEI，口服5IU/kg0_SCULI的糖尿病大鼠血糖基化血红蛋白(HbAIc)
值Emp. Oral lipo，口服空白脂质体的糖尿病大鼠血糖基化血红蛋白(HbAIc)值图7，六周长期连续口服O-S⑶LI和注射胰岛素对糖尿病大鼠降甘油三酯(TG)的 比较Untreated，对照组为未给药的糖尿病大鼠血甘油三酯(TG值121. 1 士42. 9mg/dl (η = 19)( 口服等量空白脂质体对照糖尿病大鼠血TG值109. 9士30. 4mg/dl,n = 6图5未 示)S. C.，注射胰岛素(0. 5IU/kg 2次/日)的糖尿病大鼠TG值80. 9士34. 6mg/dl (η =20)Oral LEI 20U,六周口服 0-SCULI (10IU/kg 2 次 / 日)的糖尿病大鼠 TG 值 63. 8 士 19. 0mg/dl (η = 21)Oral LEI 10U,六周口服 0-SCULI (5IU/kg 2 次 / 日)糖尿病大鼠 TG 值 92. 0 士 40. 2mg/dl (η = 11)图8六周长期口服O-S⑶LI和注射胰岛素对糖尿病大鼠体重的变化比较(*P < 0. 05，t test,与对照 control 比较)Control，未处理对照(n = 19)；0. 5IU/kg SC ins，每日两次皮下注射胰岛素 0. 5IU/kg(n = 20)；Eqm. Liposomes，每日两次口服等molar空白脂质体(n = 6)10IU/kg Oral, 口服 10IU/kg0-SCULI (η = 19)；
5IU/kg Oral, 口服 5IU/kgO_SCULI (η = 19)
具体实施例方式实施案例一，(1)小单室脂质体悬液的制备大豆卵磷脂1563. ang，胆固醇2(Mmg，二硬脂酰酸 聚乙二醇122. 76mg，加入内含210mg维生素E的80ml精制氯仿中溶解，置于250ml的圆底 烧瓶内，45°C，200rpm旋转蒸发3. 5小时蒸发至干，室温下充分干燥后加入蒸馏水80ml充分 水化过夜，多次震荡后，用探头超声仪超声5-22分钟，用激光散射仪(Particle Sizer)测 量小单室脂质体粒径为40-120纳米后停止，室温静置；(2)胰岛素溶液制备将天然生物胰岛素干粉700mg(猪胰岛素)溶于80ml的酸 性(pH = 2. 5)水溶液中，后再用NaOH溶液调至pH为7. 2 ；(3)制备小单室磷脂脂质体包裹胰岛素冻干制剂小单室脂质体溶液(步骤1)与 胰岛素溶液(步骤幻按比例充分混合，制成小单室磷脂脂质体溶液和胰岛素混合悬液，定 容分装，放置在Virtis冷冻机零下(10-20°C )冷冻真空干燥M-48小时后，脂质体包裹胰 岛素冻干制剂SCLI制成后经充N气后压盖密封.零下低温(如-20°C)可长期保存待用。 临用前经分别定容/分步液化技术分别加入氯化钠和磷酸缓冲溶液分别进行定容分步液 化液制成O-S⑶LI 口服悬液。(4)脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液O-S⑶LI的胰岛素包裹率测定。其方法 是将細1定容分步液化溶液液化的O-S⑶LI 口服悬液进行35000rpm超速离心60分钟，取一 定量上清溶液，平行三份，各加等容量水和考马斯亮蓝试剂:3ml，混勻室温下测定595nm OD 值计算胰岛素平均包裹率及其平均准确度。同时也用紫外分析法在进行上清溶液和沉殿脂 质体的甲醛溶液，分别读取278nm的OD值(A278)和279nm的OD值(A279)，按A279 (沉殿 脂质体)/A279+A278(上清)X 100%计算脂质体胰岛素包裹率进行对比。两种方法测定结 果完全吻合。实施案例二，(1)小单室脂质体的制备大豆卵磷脂647. 56mg，胆固醇15;3mg，聚乙二醇二硬脂 酸368. ^mg,加入内含73mg维生素E的40ml精制氯仿中溶解，置于250ml的圆底烧瓶内， 45°C，200rpm旋转蒸发3. 5小时蒸发至干，室温下充分干燥后加入蒸馏水40ml充分水化过 夜，多次震荡后，用探头超声仪超声5-22分钟，用激光散射仪(Particle Sizer)测量小单 室脂质体粒径至40-120纳米后停止，室温静置；(2)胰岛素溶液制备将胰岛素干粉400mg (猪胰岛素)溶于40ml的酸性水溶液 中，后再用NaOH溶液调至pH为7. 2 ；(3)制备小单室脂质体包裹胰岛素冻干制剂。小单室脂质体溶液(1)与胰岛素溶 液(2)按比例充分混合，制成小单室脂质体悬液和胰岛素水溶液的混合悬液，定容分装，放 置在Virtis冷冻机零下(10-20°C )冷冻真空干燥M-48小时后，制成单室脂质体包裹胰 岛素冻干制剂，经充N气后压盖密封.零下低温(如-20°C)可长期保存待用。临用前经 分别定容/分步液化技术分别加入氯化钠和磷酸缓冲溶液分别进行定容分步液化液制成 O-SCULI 口服悬液。(4)脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液的胰岛素包裹率测定。取定容分步液化的口服悬进行35000rpm超速离心60分钟，取一定量上清溶液，平行三份，各加水等容 量和考马斯亮蓝试剂:3ml，混勻室温下测定595nm OD值计算胰岛素平均包裹率及其平均准 确度。同时也用紫外分析法在进行上清溶液和沉殿脂质体的甲醛溶液，分别读取278nm的 OD 值(A278)和 279nm 的 OD 值(A279)，按 A279 (沉殿脂质体)/A279+A278 (上清)X 100% 计算脂质体胰岛素包裹率进行对比。两种方法测定结果十分吻合实施案例三(1)小单室脂质体的制备大豆卵磷脂781.6mg，胆固醇lOang，二硬脂酰聚乙二醇 245. 6mg,加到内含80mg维生素E的40ml精制氯仿中溶解，置于250ml的圆底烧瓶内，45°C， 200rpm旋转蒸发2小时蒸发至干，室温下充分干燥后加入蒸馏水40ml充分水化过夜，多次 震荡后，用探头超声仪超声5-20分钟，用激光散射仪(ParticleSizer)测量小单室脂质体 粒径为40-120纳米后停止，室温静置；(2)胰岛素溶液制备将天然生物胰岛素干粉400mg(猪胰岛素)溶于40m]的酸 性水溶液中，后再用NaOH溶液调至pH为7. 2 ；(3)制备小单室磷脂脂质体包裹胰岛素冻干制剂。上述小单室脂质体溶液(1)与 胰岛素溶液( 按比例充分混合，制成小单室脂质体悬液和胰岛素水溶液的混合悬液，定 容分装，放置在Virtis冷冻机零下10-20°C冷冻真空干燥M-48小时后，制成单室磷脂包裹 脂质体胰岛素冻干制剂，经充N气后压盖密封.零下低温(如-20°C)长期保存待用。临用 前经分别定容/分步液化技术分别加入氯化钠和磷酸缓冲溶液分别进行定容分步液化液 制成O-SCULI 口服悬液。(4)脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液的胰岛素包裹率测定。取定容分步 技术液化的口服悬液进行35000rpm超速离心60分钟，取一定量上清溶液，平行三份，各加 水等容量和考马斯亮蓝试剂:3ml，混勻室温下测定595nm OD值计算胰岛素平均包裹率和平 均准确度。同时也用紫外分析法在进行上清溶液和沉殿脂质体的甲醛溶液，分别读取278nm 的 OD 值(A278)和 279nm 的 OD 值(A279)，按 A279 (沉殿脂质体)/A279+A278 (上清)X100% 计算脂质体胰岛素包裹率进行对比。两种方法测定结果完全吻合。实施案例四脂质体干扰素牛血清蛋白冻干口服悬液(1)小单室脂质体的制备大豆卵磷脂781.6mg，胆固醇lOang，二硬脂酰聚乙二醇 245. 6mg,加到内含80mg维生素E的40ml精制氯仿中溶解，置于250ml的圆底烧瓶内，45°C， 200rpm旋转蒸发2小时蒸发至干，室温下充分干燥后加入蒸馏水40ml充分水化过夜，多次 震荡后，用探头超声仪超声5-20分钟，用激光散射仪(ParticleSizer)测量小单室脂质体 粒径为40-120纳米后停止，室温静置；(2)干扰素牛血清蛋白溶液制备将比例为1-10 5-50的干扰素牛血清蛋白干 粉(400mg)溶于40ml的水溶液中，调至pH为7. 2 ；(3)制备冻干小单室脂质体干扰素牛血清蛋白。上述小单室脂质体溶液(1)与干 扰素牛血清蛋白溶液( 按比例充分混合，制成小单室脂质体素混合悬液，定容分装，放置 在Virtis冷冻机零下10-20°C冷冻真空干燥M-48小时后，制成冻干单室脂质体干扰素牛 血清蛋白，经充N气后压盖密封.零下低温(如-20°C)可长期保存待用。临用前经分别定 容/分步液化技术分别加入氯化钠和磷酸缓冲溶液分别进行定容分步液化液制成脂质体 干扰素牛血清蛋白冻干口服悬液。
(4)脂质体包裹干扰素牛血清蛋白冻干制剂口服悬液的干扰素牛血清蛋白包裹率 测定。取4ml定容液化.的口服悬液进行进行35000rpm超速离心60分钟，取一定量上清 溶液，平行三份，各加等容量水:3ml，混勻室温下测定清蛋白的OD值计算干扰素牛血清蛋白 平均包裹率及其平均准确度。实施案例五本发明专利上述实施案例一，实施案例二和实施案例三所制成的脂质体包裹胰岛 素冻干制剂口服悬液，即0-SCULI，包括用于本实施案例五所述的治疗糖尿病药学效的实施 案例，均包括以下成分及其在每1升O-SCULI 口服悬液中毫摩尔数为卵磷脂，5-50 ；胆固 醇，5-50 ；聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid Esters)，5-50 ；维生素 E，0. 1-0. 5 ；胰岛素，1-10 ；氯化钠，1-20 ；磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液，1_80。(I)O-SCULI 口服悬液的安全性按‘实施案例三’制备三个批号口服O-SCULi，经过对昆明小鼠的LD5tl测定，证明本 口服O-SCLI非常安全可靠。以55只昆明小鼠，雌雄兼用体重18-20g，随机分6组，禁食4小 时后分别 ig 等容量胰岛素 26000U/kg，18200u/kg, 12700u/kg,8900u/kg5242u/kg 0. 8ml. 各组间剂量比为0. 7。用改良寇氏法，检查记数各组小鼠7天内死亡率，中毒反应及死亡时 间。结果；LD50的50%可信度=14326. 83士3060. 7u/kg.对比的一组11只昆明小鼠(雌雄 兼用)，ig空白脂质体22. 4g/kg(相当于口服脂质体胰岛素急性实验所用最大剂量组所含 空白脂质体的量)，计数小鼠7天内死亡率和给药后反应，结果是11只小鼠全部生存，且无 明显中毒反应。另一组同样按‘实施案例三’制备口服O-SCULi，对四氧嘧啶诱发的SD糖尿病大 鼠(体重200克左右，病程三周，雄性，血糖值大于300mg/dl)进行的急性降血糖的实验； 在40IU/kg B. W.的最高口服计量的实验组中，口服后1小时的血糖下降接近正常血糖值 (< 140mg/dl)，相当于1. 0IU/kg注射胰岛素降糖效果的104%，并保持3小时血糖不变，三 小时出现2/8大鼠低血糖20mg/dl)死亡。但是，40IU/kg B. W.以下口服计量，包括2-25IU/ kg B. W各计量组180只糖尿病大鼠的一次急性实验，以及连续六周每日20IU/kg B. W，即 早晚两次各口服10IU/kg B. W 口服计量试验组中，均未发现死亡，或低血糖和中毒反应；而 且，与注射胰岛素组大鼠体重不断增加(+18% )和口服空脂质体组对照大鼠体重不断下降 (-12% )相比，连续六周口服O-SCULI组大鼠个体保持体重不变[图8]，毛色光亮，健康活 泼。证明2-25IU/kg B. W范围口服剂量安全可靠。(2)本发明专利所述口服O-SCULI对糖尿病大鼠模型的综合药效检查包括降血 糖、血脂、血酮体、和血清糖基化血红蛋白等多项病症指标和恢复肝脏结构和功能损伤本专利所述口服O-SCULI药效检查是用四氧嘧啶建立糖尿病大鼠实验模型为实 验对象，所述糖尿病大鼠实验模型的建立程序如下选200 士 IOg SD雄性大鼠，停食一夜 后尾静脉注射四氧嘧啶40mg/kg体重，三周后用血糖试剂盒检查血糖在250-500mg/dl之 间者确定为糖尿病模型，同时也全面检查糖尿病模型大鼠的糖基化血红蛋白(HbAlc)，血 脂(TG，LDL-C，HDL-C，)，血酮体(AC+β-Hb)，以及反映糖尿病肝脏功能多项相关病理指标 (A/g，ALT, Alb)，氧应激指标(GSH-Px、MDA、GSH-Px/MDA比)，肝线粒体超氧产生和肝脏细 胞的显微和亚显微结构的损伤。结果证明，由于四氧嘧啶产生的氧自由基特别迅速损害胰 岛β-细胞合成胰岛素功能，建模三周后，胰岛β-细胞已受损并导致血循环和肝脏减少和缺乏胰岛素，除了引起血糖升高至420士50mg/dl (正常140mg/dl)外，其它相关病变损 伤也同样十分明显HbAlc，3. 98士0. 51% of Hb (对照，1.86%) ；Serum TG，84. 3士39. 9mg/ dl(对照，63. 8 士 19);皿1^-(，43.2士1611^/(11(对照，32.7士8.9) ；Serum ALT 74. 4士 22. 8U/ L,(对照，45. 8士9. 8) ；Serum AC+β Hb，0. 295-0. 803 (对照，< 0. 2) ；A/G，0. 81 士0. 17 (对 照，1.19士0.13) ；Serum Alb，3. 02士0. 8g/dl (对照，4. M士0. 41)；肝线粒体超氧自由基生 成(μ mol/min/mgprotein)，1.5-1.8(对照，0.8-1. 2) ；GSH-Px/MDA 比，8.0士2.0(对照， 19. 0士2. 5)。此外，肝脏组织的显微和亚显微结构，特别是线粒体和内质网膜有明显病变。(3)本发明专利所述急性口服O-SCULI能同时明显降低糖尿病大鼠的外周血糖、 血清自由脂肪酸和血酮体，降血酮体作用明显优于注射胰岛素本项药效实验以本发明专利说明中所述‘实施案例三’制备的口服O-S⑶Li，用上 述的四氧嘧啶诱发的病程已三周的糖尿病模型大鼠，在断食3小时后尾尖取血，经抗凝后 取血清，葡萄糖氧化法测定血糖作为零时血糖值，依此血糖值为标准将糖尿病模型大鼠分 成匹配5组，每组8只大鼠，以皮下注射胰岛素0. 5-1. 0IU/kg体重为阳性对照，以等体积 含有口服空白脂质体的缓冲溶液进行一次口服灌胃为阴性对照，实验各组分别为含有2，5， 10，20，40IU/kg的口服OSCLI灌胃。灌胃前取血作零时血糖值测定，灌胃后每隔一小时采血 测定血糖，持续3-6小时内大鼠自由饮水。[图3A，3B]内的 5 组实验结果显示口服 2，5，10，(10)，20，40IU/kg 的口服 0-SCULI 剂量与引起糖尿病大鼠血糖下降效果，分别相当于注射胰岛素阳性组降糖效果的23.8%， 32.2%,42. 1% -87%,78%,103% ；呈量效关系.按5次实验组降糖曲线外推与阴性对照 和阳性对照曲线交叉时间点(6-9小时)曲线下的面积计算，所用各口服O-SCULI剂量的 药理学相对生物学等效性，分别达到注射胰岛素对照组的21. 0-21. 6% (2IU/kg B. W.), 7.5-22.2 % (5IU/kg B. W.), 5. 4-13. 9 (10IU/kg B. W.), 4. 0 (20IU/kg B. W.) 4. 3 (40IU/kg B. W.)；与注射胰岛素对照组相比，口服O-S⑶LI降低外周血糖效果随口服O-S⑶LI剂量呈 反方向量效关系[图4A，4B]。口服O-SCULI剂量20IU/kg B. W. 1小时后，大鼠血糖可降到正 常值范围(< 140mg/dl)，3小时降血糖仍呈平稳趋势，但注射胰岛素1. 0IU/kg体重组的血 糖下降到1小时后即开始明显回升；口服空白脂质体阴性对照组则未见任何降血糖作用。 从而证明口服O-S⑶LI是经过肝脏到血循环而缓慢起作用。正常大鼠作预备实验证明口服 O-SCULI后在引起血糖下降的同时，血中胰岛素含量同步升高，但C肽水平不变。上述口服 O-S⑶LI降低外周血糖效果随口服O-S⑶LI剂量呈反方向量效关系，与生理条件下胰岛素 对外周血糖反应的分泌量(胰岛素分泌反应μ u/ml · hr)和胰岛素在血循环中刺激外周 组织摄取血糖量(胰岛素降外周血糖效应mg/m2/min)的反向量效关系十分吻合[Robert， Μ. Berne,Matthew,N. Levy, Physiology, 3rd,Mosby-New book,Inc.，USA,1993，p，867，]。更 进一步证明口服O-SI⑶L是经过肝脏到血循环过程发挥了互相整合和调控的降血糖效果。口服O-S⑶LI对糖尿病大鼠有明显降血糖同时，还明显同步降低血清游离脂肪酸 [图5A]和血酮体[图5B]。以‘实施案例三’制备的口服O-SCULI，进行急性口月艮O-SCULI 实验取四氧嘧啶诱发病程已三周的糖尿病雄性大鼠，体重200士 10g，按空腹血糖值和体 重相匹配分三组，早晨断食3小时后开始实验，皮下注射胰岛素1. 0IU/kg体重为阳性对照， 口服等体积含空白脂质体缓冲溶液为阴性对照，口服O-S⑶LI灌胃20IU/kg体重作为实验 组。实验期间大鼠禁食，自由饮水。糖尿病大鼠在灌胃给药后的0，1，2，4，6小时分别从大鼠眼框放血0. 25毫升用于测定血糖以及血游离脂肪酸；在0，2，4，6小时取大鼠眼框血1毫 升用于测定血酮体。血清游离脂肪酸用铜离子结合显色用比色1法测定，酮体用酶法测定 AcAC和β-HB的浓度。[图5Α]降血糖和血自由脂肪酸组实验结果统计分析经Mudent't检验，阴性对 照组，注射胰岛素组和口服O-S⑶LI三组给药0时的血糖和血清自由脂肪酸水平无差别；口 服O-SCULI和注射胰岛素两组在给药后1，和2小时以及4小时的血清自由脂肪酸水平都 明显低于阴性对照(P <0.001)；在6小时，注射胰岛素与阴性对照组已无明显差别，但口 服O-SCULI组给药6小时的血清自由脂肪酸仍然明显低于注射胰岛素组和阴性对照组(P < 0. 001)。口服O-S⑶LI组糖尿病大鼠血清自由脂肪酸，给药后0时为0. 548士0. 088mmol/ L，2小时下降到0. 309士0. 067mmol/L，然后回升到6小时为0. 446士0. 065mmol/L。同时，血 糖也由0时420mg/dl，2小时下降到^Omg/dl和4小时的^Omg/dl达最大降血糖效果，到 6小时后略回升到^Omg/dl ；此时口服O-S⑶LI组大鼠的血清自由脂肪酸和血糖水平都明 显低于阴性对照组和注射胰岛素组。[图5A]提示，口服O-S⑶LI不仅在降低血糖同时能降低血清自由脂肪酸和血酮体 体，而且在口服后4-6小时的效果还明显优于注射胰岛素组。因为，口服O-S⑶LI降血酮体 的作用机制可能与注射胰岛素不同，不仅降低血中自由脂肪酸(FFA)，而且使胰岛素直接作 用于肝脏，更为持久地抑制肝内酮体生成。证明急性一次口服O-SCULI可相当多次注射胰 岛素的降低血酮体症的疗效，证明口服O-SCULI多指标的治疗糖尿病的优越性。[图5B]降血酮体实验组结果统计分析经Mudent’t检验，阴性对照，注射胰岛 素和口服O-S⑶LI三组给药0时的血酮体总浓度无差别，2小时后，口服O-SI⑶L和注射胰 岛素两组都明显低于阴性对照，4小时，注射胰岛素组与对照已无差别，6小时，反而更显著 高于对照组(P < 0. 001)。口服O-S⑶LI组血酮体总浓度4小时和6小时都显著低于对阴 性照组。说明.与口服空脂质体阴性组和皮下注射胰岛素组相比，口服O-S⑶LI糖尿病大 鼠组血酮体总浓度降低效果为，从给药0时的0. 329mmol/L到2小时下降为0. 198mmol/L, 后缓慢上升到6小时为0. 62mmol/L，血酮体总浓度仍低于阴性对照，血酮体下降效果也远 优于注射胰岛素组。(4)长期(六周)连续口服O-SCULI有改善糖尿多项病症指标和恢复肝脏细胞结 构和功能损伤的综合疗效。本项六周长期连续口服O-S⑶LI对糖尿病疗效检验仍以‘实施案例三’制备的‘口 服OSCLI ’剂型，以前述四氧嘧啶诱发，病程三周具糖尿病多种病理指标的实验大鼠为动物 模型，分下列各组口服缓冲液阴性对照组，胰岛素(0.5IU/kg B. W.)皮下注射阳性对照 组，口服O-SCULI (5IU/kg B.ff,10IU/kg B. W.)，和口服空白脂质体对照组三组试验灌胃。每 日两次给药，早晚各一次。每日早晨断食，3小时后给药，每晚给药1小时后给食物，各组同 步。大鼠自由饮水，保持18-25°C室温和12小时交替光照。另设一组健康大鼠作正常参照。 在开始治疗前，治疗第三周和第六周，三批分别从各组动物取血样或取肝脏样本作生物化 学分析和显微和亚显微组织处理之用。6周连续口服O-S⑶LI的疗效如下(4-1)血清糖化血红蛋白(HbAlc)[图6]治疗前糖尿病大鼠各组血清HbAlc值在3. 98 士0. 51 % %，健康大鼠血清HbAlc正 常值1.86% (η = 8)，显著高(p<0.001，t test)。六周治疗前后HbAlc值非给药阴性对照由3. 98士0. 51%升高到4. 63士0. 17%，升高15.8% 注射胰岛素组由3. 81 士0.41% 降为 3. 75士0.54% (n = 8)，下降 1.6% ；口服 OSCULI (10IU/kg B. W)组由 3. 81 士0.37% χ降为3. 72士0. 45 % (n = 8),下降2. 4% ；两给药组比阴性对照组降低HbAlc效果都明 显(P < 0.05，t test)。但口服O-SCULI (5 IU/kg B. W)组(n = 7)与阴性对照组无显著 差异。口服空白脂质体组与非给药阴性对照组无差异，无降低血清HbAlc作用；证明口服 O-S⑶LI(10IU/kg B. W)的效果不是由于脂质体本身，而是被包裹的胰岛素经过肠道吸收进 入肝脏和入血发挥降糖的结果。这是国内外都未见报道的首次新成果。(4-2)血清转氨酶(ALT)正常大鼠血清ALT = 45. 8 士9. 8u/L(n = 19)，糖尿病组血清治疗前ALT明显升高 至74. 4士22. 8u/L) (η = 77)，各组组间治疗前无差异。六周后，非给药阴性对照组上升到 97. 7士31. 9U/L ；六周给药治疗后，口服 O-SCULI (10u/kg B. W)组下降至 64. 7士21. lu/L，注 射胰岛素组下降至80士 lOu/L ；两给药组比非给药阴性对照组血清ALT降低效果都明显(P
<0.05)，但口服O-SI⑶L(10u/kg)组更佳；口服空白脂质体组与非给药对照差异不明显， 口服O-SICUL (5IU/kg B. W)组与之有差异，但不够显著。(4-3)血清白蛋白(ALB)正常大鼠血清ALB = 4.M士0.41g/dl(n = 8)；各糖尿病组治疗前血清ALB下 降至3.02士0.8g/dl(n = 56)，组间无明显差异。六周给药治疗后血清ALB水平口服 0-SICUL(10u/kg B. W)组提高至 3. 71 士0. 82g/dl，注射胰岛素组提高至 3. 52士0. 36g/dl。 两给药组比非给药对照组血清ALB水平(3. 02 士0. 8g/dl)提高效果都明显(P < 0. 05) ； 口 服O-SCULI (5IU/kg B. W)组血清ALB水平(3. 42士0. 76g/dl)与非给药阴性对照组也有显 著差异(P <0.05) ；口服空白脂质体组(3.09±0J6g/dl)与非给药对照无差异。(4-4)血清球蛋白比A/G:正常大鼠血清白/球蛋白比A/G = 1. 19士0. 13 (n = 8)，各糖尿病组治疗前A/ G <1.0。六周治疗后，口服 O-SCULI (10u/kg B. W)组 1. 17士0.洸(η = 15)，注射胰岛素 1.07士 1.0 (15)；两给药组比非给药阴性对照组(0.98士0. 15 (n = 14)提高效果都明显(P
<0.05)，但口服O-SCULI (10u/kg B. W)组A/G比已提高至正常比值，优于注射胰岛素组； 口服 O-SCULI (5IU/kg B. W)组也与之有显著差异(1. 11 士 0.20 (η = 6) (P < 0. 05)。但空脂 质体组(0. 99士0. 17 (n = 6)与非给药阴性对照组无差异。(4-5)血清三甘油脂TG [图7]正常大鼠血清三甘油脂TG = 63. 8士 19. 0mg/dl (η = 8)，糖尿病各组治疗前组间 无差异 84. 3 士 39. 9mg/dl (η = 77)。六周给药治疗后，口服 O-SCULI (10u/kg B. W)组 TG 值 为59. 2士33. 3mg/dl (η = 21)；注射胰岛素组为80. 9士34. 6mg/dl (η = 20)；两给药组比非 给药阴性对照组(121. 1 士42. 9mg/dl (η = 19)和空白脂质体组(109. 9士30. 4mg/dl (η = 6)的降低血清三甘油脂效果都明显(？<0.05)，但口服0-5^1^(1011/1^ B. W)组已达正常 值(63. 8士 19. 0mg/dl) ；口服 0-SCULI (5IU/kg B. W)组也与之有显著差异(92. 0士40. 2mg/ dl(n= 11)，虽比非给药阴性对照有所降低，但仍高于正常值，差异明显(P<0.05)。空白 脂质体组仍明显高于正常值(P < 0. 05)，但与非给药对照无明显差异。说明口服O-SI⑶L 的降血清TG的作用不是由于脂质体的磷脂成分，而主要是被包裹的胰岛素进入肝脏和血 循环的治疗效果，明显优于注射胰岛素组。
(4-6)血清高密度脂蛋白HDL-C 正常大鼠血清HDL-C正常值=32. 7士8.9mg/dl(n = 8)，糖尿病各组血清HDL-C 值无差异。六周给药治疗后，非给药阴性对照组为27. 3士 10. 8(n= 19)；注射胰岛素 组为 32. 3 士 9. 5 (n = 20) ； 口 月艮 OSCULI (10u/kg B. W)组为 34. 3 士 10. 2 (n = 21) ； 口 服 OSCULI (5IU/kg B. W)组31. 1 士 10。5 (n = 11)；空脂质体组为沈.9士4. 6，与非给药阴性对 照组无差异；3组给药组都有提高血清HDL-C值的作用。(4-7)肝功能和体重[图8]六周口服O-S⑶LI(10u/kg B. W)与注射胰岛素具有相同水平降低糖尿病大鼠 HbAlc含量效果条件下，口服OSI⑶L除了上述改善脂代谢(血清TG降低)外，并使总胆固 醇、低密度脂蛋白胆固醇、血清磷脂、高密度脂蛋白磷脂含量维持正常，使糖尿病大鼠保持 健康体重的良好效果[附图8]，相反，注射胰岛素组引起过度肥胖；非给药阴性对照组则使 体重下降，从而说明口服O-SCULI新剂型具有治疗II型糖尿病优于注射胰岛素的良好前景。(4-8)肝细胞显微亚显微结构6周口服O-S⑶LI (10u/kg B. W)除了上述有效地改善糖尿病大鼠肝功能(下降血 清ALT，降低超氧自由基生成，升高肝细胞GSH-Px/MDA比值，提高血清ALB，和TP以及G/A 比)，还能使糖尿病大鼠受损伤的肝脏组织形态结构恢复正常，肝细胞粗面内质网、滑面内 质网、细胞核、线粒体、糖原颗粒等超微结构基本恢复正常，显示比注射胰岛素更好的明显 效果。本发明专利的O-S⑶LI上述结果再次证明，口服O-S⑶LI可以经消化道进入肠细 胞和肝赃后转运入血，能模拟生理状态下胰岛素分泌后首先进入肝门静脉的分配途径，使 多量胰岛素直接作用于肝脏，发挥肝脏调节糖、脂代谢等的主导作用，并且有效治疗糖尿病 肝损害。因此，脂质体胰岛素口服给药途径优越于外周注射胰岛素。
权利要求
1.一种脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，亦称口服胰岛素单室脂质体悬液，即 O-S⑶Li，其特征在于含有下述特定组份及其在每1升O-S⑶LI 口服水悬液中的毫摩尔 (mmole)数卵磷脂，5-50;胆固醇，5-50 ；聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid Esters), 5-50 ；维生素 E，0. 1-0. 5 ；胰岛素，1-10 ；氯化钠，1-20 ；磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液，1-80 ；其中所述O-S⑶LI 口服水悬液也是包括脂质体包裹胰岛素冻干制剂，即SCLI制剂，和 特定比例的能使SCLI制剂液化为O-S⑶LI 口服水悬液的定容分步液化溶液。
2.根据权利要求1所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即0-SCULI，其特征在 于，所述SCLI制剂的组份为卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂肪酸酯、维生素E、生物胰岛素和 水，所述SCLI制剂的组份配比为，其中卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂肪酸酯三种脂质组份之 间的摩尔(mole)比为1-10 1-10 1_10，维生素E和胰岛素与该所述三种脂质组份重 量和之比分别为0. 5-5%和5-50%，水和SCLI的重量比为0. 01-2. 5%0
3.根据权利要求1所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即0-SCULI，其特 征在于，所述定容分步液化溶液是由特定配比浓度为0.01-0. 3M氯化钠溶液和浓度为 0. 01-0. IM中性PH磷酸钠缓冲溶液所组成，所述该两溶液之间的用量比为0. 1% -20%，用 于分别定容/分步液化技术将所述SCLI制剂制成O-S⑶LI 口服悬液。
4.根据权利要求1-3之一所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶Li，其特 征在于，所述卵磷脂，是指蛋黄卵磷脂，大豆卵磷脂，牛心卵磷脂或其它生物来源的卵磷脂 中一种或几种，所述卵磷脂总量中含有的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)和磷脂酰乙 醇胺(phosphatidylethanylamine)的摩尔％比分别为50-90%和5-50%，所述卵磷脂也可 以是与上述生物卵磷脂含有相同比例的合成磷脂酰胆碱和合成磷脂酰乙醇胺组成。
5.根据权利要求1-3之一所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶Li， 其特征在于，所述聚乙二醇脂肪酸酯(Poly-Ethylene Glycol Fatty Acid hters)，其 组分中的脂肪酸组分是二硬脂酸(Distearate)，二异硬脂酸(Diisostearate)、单硬脂酸 (Monostearate)的一种或几种，其组分中的聚乙二醇组分(Poly-ethylene glycol, PEG), 是二聚衍生物(PEG-幻，四聚衍生物(PEG-4)、八聚衍生物(PEG-8)、十聚衍生物(PEG-10)或 四十聚衍生物(PEG-40)的一种或几种；所述聚乙二醇脂肪酸酯可组成包围磷脂脂质体膜 双分子外面保护层，能保护脂质体在胃肠道内的稳定，也能在肠道内中性PH条件下，被肠 液酯酶水解，使部分聚乙二醇脂肪酸酯被水解为一硬脂酸、二硬脂酸或异硬脂酸和聚乙二 醇，并相应释放出矿。
6.根据权利要求1-3之一所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶Li，其特 征在于，所述O-S⑶LI 口服悬液中的胰岛素是被包裹在SCLI制剂单室磷脂脂质体内，经冰 刻蚀电子显微镜检查，被包裹的胰岛素多以二(聚)体和六(聚)体的形式排列在脂质体内 膜表面，显示其生物大分子天然立体结构的特性；经PAGE-SDS凝胶电泳检查，被包裹的胰岛素与对照标准胰岛素相比具有完全相同的蛋白区带分布，显示其天然生物化学结构的特 性；经按药典95版二部附录XIIG检定法进行昆明小鼠生物测定，证明被包裹的胰岛素与对 照标准胰岛素具有完全相同对昆明小鼠的降血糖生物活性，按照生物检定统计法中量反应 平行线测定双交叉设计法计算效价及实验误差，结果证明回归非常显著，偏离平行不显著， 实验结果成立，从而说明，经本发明专利所述的包裹于脂质体内的胰岛素，仍保留其完好的 天然降血糖生物活性。
7.根据权利要求1-3之一所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶Li，其特 征在于，所述胰岛素是生物来源经人工纯化的猪胰岛素或牛胰岛素，也可以是基因重组人 胰岛素，或其各种长效，中效或速效的药用胰岛素衍生物。
8.一种制备如权利要求1-7所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶LI的 方法，其特征在于，包含下列步骤(1)经O-S⑶LI独特的真空冷冻控制去水化/保湿工艺制成所述O-S⑶LI口服悬液中 含有的SCLI制剂单室磷脂脂质体，所述单室磷脂脂质体平均粒径为1000纳米，其胰岛素包 裹率为80%以上。(2)用定容分步液化溶液对SCLI制剂进行分别定容/分步液化，以制成O-SCULI口服悬液。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述步骤(1)包含如下各步骤(a)将权利要求2所述的SCLI制剂的组成配比，选用任何一种制备小单室脂质体方法， 包括用有机溶剂完全溶解、减压旋转蒸发、充份干燥和加水充份水化，最后制成卵磷脂浓度 为0. 01-0. 15摩尔(M)的小单室磷脂脂质体及其平均粒径为30-120纳米的悬液A ；(b)将所述胰岛素干粉，用重蒸去离子水制成胰岛素水溶液为溶液B；(c)将上述方法步骤(a)和(b)制备的悬液A和溶液B，相互充分混合制成悬液A和溶 液B的小单室磷脂脂质体悬液和胰岛素溶液混合悬液C ；(d)所述混合悬液C经定容分装、充氮、真空冷冻控制去水化/保湿以制成大单室磷脂 脂质体包裹胰岛素冻干制剂，即SCLI制剂。
10.根据权利要求9所述方法所述步骤(a)包括(al)，用精制氯仿或氯仿甲醇有机溶剂在旋转蒸发瓶中完全溶解卵磷脂、胆固醇、聚 乙二醇脂肪酸酯，维生素E ；其在有机溶剂中相应含量，mg/ml，分别为5-50、5-50、5-50、 0. 1-0. 5 ；(a2)，将上述完全溶解的有机溶剂，在其沸点温度下减压旋转蒸发至有机溶剂完全回收；(a3)，将上述有机溶剂完全回收后的卵磷脂脂质膜置于室温下充份干燥，加重蒸去离 子水充份水化制成水化液，使卵磷脂脂质浓度为0. 01-0. 15摩尔(M)；(a4)用超声法或其它方法将上述卵磷脂脂质水化液制成平均粒径为30-120纳米的小 单室磷脂脂质体悬液为悬液A ； 所述步骤(b)包括(bl)胰岛素干粉置于pH调到2. 0-2. 5的盐酸水溶液中完全溶解，浓度为5-50mg/ml ； (b2)再用氫氧化钾溶液将胰岛素酸性溶液调回到pH为7. 2以制成溶液B，所述步骤 (c)包括(Cl)将上述(a4)步骤制成的悬液A与( )步骤制成的胰岛素溶液B按两者体积比例 为0. 5-5. 0 1. 0-10. 0相互混合制成小单室磷脂脂质体悬液和胰岛素溶液混合悬液C ； (c2)将上述混合悬液C进行定容分装；(c3)定容分装后混合悬液C置于零下10-20°C下，经M-48小时真空冷冻控制去水/ 保湿程序，使SCLI制剂中保湿水分逐步达标到0. 01-2. 5 %，使其小单室脂质体相互融合逐 步增大为大单室脂质体； 所述步骤(d)包括(dl)将上述SCLI制剂进行充N气、压盖、密封后，零下10-20°C保存待用； (d2)在SCLI制剂保存的三年时期内，对SCLI制剂脂质体大单室膜结构及胰岛素包裹 率和胰岛素活性进行定期测定和检查。
11.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述步骤( 包括下述步骤(a)所述定容分步液化溶液，是指氯化钠溶液和中性pH磷酸缓冲液，所述分别定容/分 步液化，其第一步液化是用一定容量氯化钠溶液对SCLI制剂进行液化处理；(b)所述分别定容/分步液化，其第二步液化是再加入一定容量的中性pH磷酸缓冲液 对SCLI制剂进行液化稀释，最终使SCLI制剂完全制成O-S⑶LI 口服悬液；(c)对SCLI制剂进行第二步液化后制成的O-S⑶LI口服悬液进行脂质体胰岛素包裹率 测定，以计算单位体积口服悬液单室脂质体胰岛素包裹量作为口服用量参照。
12.根据权利要求11所述方法，其特征在于，所述步骤(a)包括(al)所述先用一定量氯化钠溶液对SCLI制剂进行第一步液化，是指加入的氯化钠溶 液容量与用中性PH磷酸钠缓冲溶液第二步液化的容量的比为0. 1% -20% ； 所述步骤(b)包括(bl)所述再加入一定容量的中性pH磷酸缓冲液对SCLI制剂进行第二步液化，是指所 加中性PH磷酸钠缓冲溶液容量为两步液化所用溶液总容量的80-99. 9% ；(b2)所述SCLI制剂总重量与被所述定容分步液化两步液化溶液的总容量比为 5-80mg/ml ；(b3)所述SCLI制剂中胰岛素总重量与被所述定容分步液化溶液两步液化的总容量比 为 2-20mg/ml ；(b4)所述SCLI制剂中胰岛素总重量与(b!3)步骤所述定容分步液化溶液两步液化的总 容量比，亦即与O-S⑶LI 口服悬液的总容量比为2-20mg/ml ； 所述步骤(c)包括(cl)所述对O-S⑶LI 口服悬液进行脂质体胰岛素包裹率测定，即将4毫升最终制成的 O-S⑶LI 口服悬液进行35000rpm超速离心60分钟，使包裹胰岛素脂质体完全沉淀与离心上 清液完全分开；(c2)再取出一定量离心上清溶液，平行三份，各加等量水和3毫升考马斯亮兰溶液，室 温下测定595nm的OD值，计算脂质体胰岛素平均包裹率和平均精确度；(c3)同时再取出一定量离心上清溶液和沉淀脂质体的甲醇溶液，各平行三份，用紫外 分析法分别读取278nm的OD值和279nm的OD值，即A278 (代表不含脂质体的离心上清溶 液)和A279 (代表沉淀脂质体)，按A279/A279+A278 X 100 %来计算脂质体胰岛素平均包裹 率及其平均精确度，与步骤(^)进行对比，根据本发明专利所述步骤(^)和步骤(c3)的脂质体胰岛素平均包裹率都在80%以上，其平均精确度都在96-103%，两种方法结果完全 吻合和一致；(c4)，按上述步骤(U)和步骤(c!3)的脂质体胰岛素平均包裹率，根据每单位体积的 O-SCULI 口服悬液的脂质体包裹的胰岛素平均总量的IU数，来计算和标定口服用量。
13.根据权利要求1-7所述脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即O-S⑶Li，其特 征在于该O-SCULI 口服悬液，经过对本发明专利设计建立的具有多项糖尿病病症的糖尿 病大鼠进行急性口服实验，证明同时具有降血糖(Hypoglycemic effect)，降游离脂肪酸 (free fatty acids)和降血酮体(blood Ketone body)的明显效果，与注射胰岛素对照的 降血糖相比，相对药理生物等效性最高达22. 2%，具量效关系，其降低血游离脂肪酸效果明 显优于注射胰岛素，降低血酮体效果比注射胰岛素更为明显和持久；该O-S⑶LI 口服悬液， 经对本发明专利设计建立的具多项糖尿病病症的糖尿病大鼠连续六周长期口服实验，其综 合治疗效果有降低血糖化血红蛋白(HbAlc)，降低甘油三脂(TG)和转氨酶(ALT)，降低氧 自由基生成(R0Q和氧化应激(Oxidative Mress)，降低MDA，提高清蛋白(Alb)合成和清 /球蛋白比(A/G)，提高6SH-I^活性和GSH-Px/MDA比值；明显恢复肝脏细胞和肝线粒体的 显微和亚显微结构，维持健康体重，避免长期注射胰岛素引起的肥胖，其中多项指标的改善 显著优于胰岛素注射外周给药。
14.根据权利要求8-12之一所述制备脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，即 O-SCULI的方法，同样能够应用于包裹胰岛素以外的其它生物活性多肽和蛋白，包括细胞色 素C，干扰素，清蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种脂质体包裹胰岛素冻干制剂口服悬液，称O-SCULI，含有卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂肪酸酯、维生素E、胰岛素、水、氯化钠和磷酸缓冲液。本发明还提供制备O-SCULI两步工艺1.控制去水/保湿工艺制备脂质体包裹胰岛素冻干制剂，SCLI，使脂质体融合增大胰岛素包裹率达80％；2.分别定容/分步液化工艺将SCLI制成O-SCULI口服悬液，保持SCLI脂质体不泄漏和胰岛素包裹率不变。本发明通过急性口服O-SCULI，使脂质体胰岛素有效进入肠-肝门静脉和肝脏及血循环，能高利用度地降血糖、降血脂肪酸和血酮体；六周连续口服降血糖化血红蛋白、甘油三脂、转氨酶、氧应激及恢复肝细胞结构损伤、提高肝功能多指标治疗糖尿病的综合疗效。本发明也为活性多肽蛋白如细胞色素C、清蛋白和干扰素等非注射给药开辟新途径。
文档编号A61P3/10GK102144968SQ20101918501
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者刘树森 申请人:刘树森