专利名称：重组腺相关病毒载体及其制备和应用的制作方法
重组腺相关病毒载体及其制备和应用本发明属于生物医药领域，涉及内皮抑素(Endostatin，ES)与TRAIL目的基因的克隆，及Plkl的RNAi序列设计。进一步地，本发明涉及含有Endostatin-TRAIL-ShPlkl的重组腺相关病毒载体及其构建方法和抗肿瘤效应。本发明的重组腺相关病毒载体具有明显的抗肿瘤作用，且毒副作用小，具有良好的应用前景。
背景技术：
恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。目前临床上主要是采用放射治疗及化学疗法。然而，有些恶性肿瘤对放射治疗不敏感，且有些患者对化疗易产生耐药性，因此寻找新的有效治疗肿瘤的方法是临床医生与患者的急切愿望 。随着生物工程技术的发展，基因治疗肿瘤成为研究热点，其中治疗基因可以是抑癌基因或诱使肿瘤死亡的基因，也可以是各种细胞因子或免疫原性基因。如将多种抑癌基因或凋亡诱导基因导入肿瘤细胞以抑制肿瘤生长或凋亡。还可以使用反义基因技术，核酸技术或RNA干扰技术来封闭或降解基因或其产物以达到治疗目的。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的生成，通过抑制肿瘤新生血管生成，也是治疗肿瘤的一种途径。在内源性血管生成抑制因子中，内皮抑素最引人注目，在体外它对内皮细胞具有明显的增殖抑制活性。在体内，其可特异性地抑制内皮细胞增殖和新生血管形成，从而抑制肿瘤生长。但国内外均有文献报道ES需与化疗药物联用才有较好的效果(ClinCancer Res，2004，10 (I pt I) :33-42.;中国肺癌杂志，2005，8 (4) :283-290.临床肿瘤学杂志，2007，12(10) :728-735.)肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)超家族的成员之一，它能选择性地杀死肿瘤细胞，而对大多数正常细胞却无杀伤作用(生命科学，2007，19 :492-495)。TRAIL与受体结合后，除激活凋亡诱导信号途径外，还能激活Akt途径、核因子KB(NF-KB)、蛋白激酶C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员等。反过来，这些被活化的途径或因子能调节TRAIL的凋亡诱导活性(Int J Mol Med, 2006,18 505-510.)。Polo样激酶I (polo-like kinase I, PLK1)是一种广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸激酶，在细胞周期调控中发挥关键的作用。现已发现PLKl在多种肿瘤中表达增高并与某些肿瘤的预后密切相关。通过利用反义寡核苷酸、RNA干扰技术和化学合成PLKl小分子抑制剂等方法阻断PLKl的表达或降低其激酶活性，可显著抑制Plkl基因及其蛋白表达，有效阻止肿瘤细胞的生长和增殖，进而能够有效抑制肿瘤细胞的增殖并介导肿瘤细胞的凋亡(Nature Chemical Biology, 2006, 2 (12) :711-717, World J Gastroenterol, 2005,11(29) :4596-4599)。但RNA干扰技术存在稳定性和脱靶效应等问题(Gerie Ther, 2006,13:464 Nucleic Acids Res,2005，33 :452)。腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒。迄今为止，尚未发现与AAV相关的疾病报道，因此被公认为是最安全的病毒载体，成为目前基因治疗载体研究的热点。但由于包装容量的限制，其多用于单一基因的转导(Curr Opin Mol Ther. 2003 ;5 (4) :367-75.)。
发明内容
恶性肿瘤的发生主要是由于多种因素诱发机体细胞的基因突变，即基因的缺陷或异常所致。本发明率先选择多途径抑制肿瘤新生血管生成；诱导肿瘤细胞凋亡；并结合RNA干扰PLKl的表达来抑制肿瘤细胞生长来联合抗肿瘤。具体而言，本发明首次将Endostatin、TRAIL、ShPlkl三基因克隆构建于同一 AAV载体上，经包装纯化后获得新型重组腺相关病毒载体。经实验显示，本发明的新型重组腺相关病毒载体具有显著的抗癌作用。所以，本发明的第一方面提供了一种重组载体，该载体含有如下三种能在体内表达的基因或核苷酸序列Endostatin、TRAIL和ShPlkl。优选地，本发明的载体为病毒载体， 例如腺相关病毒载体。备选地，本发明所提供的重组载体中所含有的三种基因或核苷酸序列是通过沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接的。例如通过沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接有Endostatin基因或核苷酸序列、IRES序列、TRAIL基因或核苷酸序列、ShPlkl基因或核苷酸序列。示例性地,本发明的重组载体是如图I所示的。示例性地,本发明的Endostatin基因或核苷酸序列的序列是Endostatin基因的序列通过以从人胎盘组织提取的总RNA为模板，以SEQ ID NO :1和2为引物进行RT-PCR扩增获得的目的Endostatin (612bp)基因或核苷酸序列。示例性地，本发明的TRAIL基因或核苷酸序列是通过以TRAIL (SolubleTRAIL，95-281AA)基因为模板，以SEQ ID NO :5和6为引物进行PCR扩增获得的目的TRAIL(I14-281 AA，507bp)。示例性地，本发明的ShPlkl基因或核苷酸序列是以PGPHl载体(上海吉玛制药技术有限公司，商品名pGPHl Plasmid.)模板，以SEQ ID NO :7和8为引物通过PCR扩增，获得的ShPlkl (392bp)的目的片段。应当理解，本发明在的上述或在实施例中所述的导入至载体中的目的序列仅仅是示例性的。本领域技术人员将会明白，可以对本发明的导入的目的序列进行适当的修饰，前提是修饰后的目的序列保持各自的生物学活性。在本发明的教导下，这种修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如通过保守性突变可将Endostatin基因或核苷酸序列和/或TRAIL基因或核苷酸序列进行修饰。对于本发明的ShPlkl基因或核苷酸序列，本领域技术人员根据干扰RNA的设计原理可对其序列进行适当的改变或修饰，只要修饰或改变后的ShPlkl基因或核苷酸序列能抑制Plkl基因及其蛋白表达。总之，发明人认为，不应当将本发明的导入的目的基因或核苷酸序列限制为实施例中所例举的那些。本发明另一方面提供了制备本发明的重组载体的方法，具体包括以下步骤(I) pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 质粒的制备具体地，先从人胎盘提取RNA，进行Endostatin基因克隆，获得目的基因大小为612bp，同样从人胎盘的RNA，克隆TRAIL基因，获得507bp大小的目的基因；再用PCR法从P1424 质粒扩增获得 392bp ShPlkl (1424)片段。将 pAAV_IRES_hrGFP 质粒改造，在 PolyA的下游的Cpo I的位点处插入ShRNA序列元件，获得pAAV-IRES-hrGFP-ShRNA质粒，分别依次将 TRAIL 与 Endostatin 插入 pAAV-IRES-hrGFP-ShRNA，获得 pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl。(2)rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 的制备同常规，本发明制备方法还包括包装和纯化该重组腺相关病毒载体的步骤将pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 及辅助质粒 pAAV-RC 和 pHelper 三种质粒共转染至HEK293细胞，例如用磷酸钙共沉淀法；经肝素一琼脂糖亲和层析方法纯化，制得高纯度高滴度重组腺相关病毒载体 rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl。根据本发明，所述的包装细胞可以是现有技术中常用的包装细胞，例如人胚肾细胞HEK293或者金黄地鼠胚胎肾细胞BHK-21等。对于本发明所述的三种质粒共转染，优选采用磷酸钙共沉淀法。
根据本发明制备的rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl用于肿瘤细胞株及肿瘤模型鼠显示出明显的抗肿瘤效应。根据本发明，本发明所述的腺相关病毒优选用AAV2型。本发明的再一方面提供了本发明的病毒载体的医药用途，例如在制备对抗癌症的药物或试剂中的作用。
从下面给出的说明，并结合本发明的附图，本申请的内容将变得更清楚、明了。图I :质粒 pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 的结构不意图。图 2 :纯化的 rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 的 SDS-PAGE 凝胶电泳图，其中其外壳蛋白分子量为VP1，VP2，VP3 ；M为低分子量蛋白标记物。图3 :用地高辛标记的IRES基因做探针，点杂交检测纯化后rAAV-Endostatin-TRAIL-ShPlkl 的滴度。其中Al-6 0. 5ng 的质粒 pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 作 I : 2 的系列稀释；B1-6 :5μ I 的 rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 作 I : 2 的系列稀释。图4 rAAV-Endostatin-IRES-Trail-ShPlkl 转染 A549 及人血管内皮细胞 96 小时后细胞形态。Al，A2，A3分别为A549细胞未加病毒处理组、50 μ L(25M0I)病毒处理组和100yL(50M0I)病毒处理组。81，82，83分别为八549细胞未加病毒处理组、5(^1^病毒处理组和100 μ L病毒处理组；C1，C2，C3分别为血管内皮细胞未加病毒处理组、50 μ L病毒处理组和100 μ L病毒处理组；以及D1，D2，D3分别为血管内皮细胞未加病毒处理组、50 μ L病毒处理组和100 μ L病毒处理组。图5 :rAAV-Endostatin-IRES-TraiI-ShPlkl 的体外有效性实验 图6 :采用RT-PCR检测基因的表达。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实施例中所采用的分子生物学技术可参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》;所使用的工具酶均购自New England Biolab公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书；所使用的胶回收试剂盒购自安比奥生物技术公司，使用方法参考商品说明书。实施例I.构建重组腺相关病毒载体rMV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl质粒。I) · Endostatin 基因的克隆用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从人胎盘组织提取总RNA (生物技术通讯，2002，5 (13) =346-348)，进行 RT-PCR扩增，获得Endostatin (612bp)目的基因，同时在其上游具有EcoR I酶切位点，下游具有XhoI酶切位点。PCR扩增Endostatin基因所用引物如下上游引物:5，-ggaattc atgcacagccaccgcgacttcc-3’ (SEQ ID NO:I)；下游引物5，-CCgctcgag ttacttggaggcagtcatg-3，(SEQ ID NO :2)。PCR扩增Endostatin基因体系如下
权利要求
1.重组载体，该载体含有如下三种能在体内表达的基因或核苷酸序列Endostatin、TRAIL 和 ShPlkl。
2.根据权利要求I所述的载体，其为病毒载体，例如腺相关病毒载体。
3.根据权利要求I或2所述的载体，其中含有的三种基因或核苷酸序列是通过沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接的，例如通过沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接有Endostatin基因或核苷酸序列、IRES序列、TRAIL基因或核苷酸序列、ShPlkl基因或核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的载体，其是如图I所示的重组腺病毒载体。
5.根据上述权利要求任一项所述的重组载体，其中Endostatin基因或核苷酸序列的序列是Endostatin基因的序列通过以从人胎盘组织提取的总RNA为模板，以SEQ ID NO : I和2为引物进行RT-PCR扩增获得的目的Endostatin (612bp)基因或核苷酸序列；和/或 TRAIL基因或核苷酸序列是通过以TRAIL(Soluble TRAIL,95-281AA)基因为模板，以SEQ ID NO :5和6为引物进行PCR扩增获得的目的TRAIL(114-281AA，507bp);和/或 ShPlkl基因或核苷酸序列是以PGPHl载体(上海吉玛制药技术有限公司，商品名pGPHl Plasmid.)模板，以SEQ ID NO 7和8为引物通过PCR扩增，获得的ShPlkl (392bp)的目的片段。
6.制备权利要求1-5中任一项的的重组载体的方法，包括以下步骤 (a)用基因工程方法构建质粒pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl，其包含沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接的Endostatin基因或核苷酸序列、IRES序列、TRAIL基因或核苷酸序列、ShPlkl基因或核苷酸序列； (b)将(a)中构建的质粒和辅助质粒共转染包装细胞； (c)收获(b)中的细胞并获得目的病毒载体。
7.权利要求6所述的方法，其中所述的辅助质粒可以为pAAV-RC和pHelper;和/或所述包装细胞为包装细胞是人胚肾细胞HEK293或者金黄地鼠胚胎肾细胞BHK-21，优选人胚肾细胞HEK293 ;和/或所述转染方法可以是电穿孔法、显微注射法、基因枪法、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、多种阳离子物质或病毒介导的转染方法，优选磷酸钙共沉淀法。
8.权利要求1-5中任一项的的重组载体在制备肿瘤治疗药物中的用途。
9.权利要求1-5中任一项的的重组载体用于抑制肿瘤生长的用途。
10.根据权利要求9或10的用途，其中的肿瘤包括肝癌、胰腺癌、胆管癌、肺癌、肾癌。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及本发明涉及重组腺相关病毒载体及其制备和应用。进一步地，本发明涉及含有Endostatin-TRAIL-ShPlk1的重组腺相关病毒载体及其构建方法和抗肿瘤效应。本发明的重组腺相关病毒载体具有明显的抗肿瘤作用，且毒副作用小，具有良好的应用前景。
文档编号A61K48/00GK102839194SQ20111016911
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者唐升斌, 程笠人, 肖艳桃, 田晶, 谭孟群 申请人:深圳市湘雅生物医药研究院