专利名称：Il-24和osm双基因共表达重组质粒和重组腺病毒以及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，具体涉及IL-M和OSM双基因共表达重组质粒和重组腺病毒以及应用。
背景技术：
近年来，恶性肿瘤中的皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌发病率呈逐年上升趋势。其中，皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是一种恶性程度很高的皮肤肿瘤，它的发生往往开始于那些色素沉着的部位，通常是由镶嵌在表皮的基底细胞中的生黑素细胞不受细胞增殖机制控制衍生的。最近的一些报道显示我国的发病率有逐渐增高的趋势，由于对其严重性认识不足，一般就诊时往往已是晚期。而鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国高发肿瘤之一，广东、广西、福建、湖南等省为国内高发区。鼻咽癌的发生发展是一个多因素作用、多基因参与、多阶段病变发生的极其复杂的癌变过程，它的发病率和死亡率均随年龄增长而上升，是人类健康的重大威胁。肿瘤是当今社会影响人类健康的主要疾病之一，肿瘤的发生发展受体内多种原因的调控，肿瘤抑制基因正是参与这一调控的重要分子。很多肿瘤中都有某些肿瘤抑制基因的失活，向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常的抑癌基因，则可逆转肿瘤细胞的表型、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞死亡，从而达到治疗目的，这种方法称之为基因治疗。基因治疗作为一种高效性、特异性、靶向性的治疗手段已是医学界广泛关注的热点，基因治疗技术的出现为治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌指明了发展方向。现阶段，已经有多篇文章报道了有关抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的基因，例如白细胞介素-24(IL-24)基因和抑瘤素(OSM)基因。白细胞介素-24(IL-24)又称黑色素瘤分化相关因子-7 (mda-7)，为分泌型细胞因子，是一种膜受体介导的肿瘤生长抑制因子，它是第一个既抑制肿瘤细胞生长和血管形成并诱导其凋亡同时又能刺激免疫细胞表达细胞因子的新型抑癌基因。迄今为止已有许多实验证明IL-M具有显著的抑制肿瘤的作用，能选择性地抑制多种肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，包括黑色素瘤、神经胶质母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌等。这种抑制作用不依赖p53、Rb和pl6 等抑癌基因，且对正常细胞没有影响。抑瘤素(OSM)是IL-6细胞因子家族的成员之一，是一种多功能的细胞因子，具有调节基因活性、调节细胞增殖与分化、调节免疫、参与炎症反应、重塑细胞外基质、造血、神经系统保护等多种功能，此外，OSM还能对多种肿瘤细胞产生抑制作用。将上述抑癌基因通过载体携带转染或感染靶细胞，便可实现基因治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌，达到抑制肿瘤细胞的效果。基因治疗中应用的载体可分为两类非病毒式和病毒式。这两者中病毒介导法转染效率高，目的基因表达稳定，在现有的基因治疗方案中占绝大多数。目前用于基因治疗的常用病毒式载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、 腺病毒相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体和嵌合病毒载体等。而本领域技术人员公知腺病毒载体与其它病毒载体相比较而言，有很多优点，如1、宿主范围广，对人致病性低；2、具有感染率高、对分裂和非分裂细胞都能感染；3、能携带很长的治疗基因和同时表达多个基因； 4、不整合到染色体中，无插入致突变性，安全性好；5、能有效进行增殖，滴度高，易加工制备等。而采用腺病毒载体中的PAdEasy腺病毒表达系统更具许多特殊优点1.腺病毒质粒的同源重组可在大肠杆菌BJ5183中高效进行，且细菌繁殖快，同源重组能力强，因而从根本上克服细胞内同源重组率低的缺陷；2.腺病毒中可插入111Λ的基因片段或同时插入多个基因片段；3.由于在腺病毒骨架中含有的GFP报告基因，非常便于监测病毒包装成功与否、 检测病毒滴度及感染效率等。所有这些都避免了病毒的空斑克隆纯化过程，大大减少了病毒的制备时间。虽然通过基因治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌有诸多优点，但是目前以腺病毒为载体同源重组IL-M基因或OSM基因后对肿瘤细胞的抑制作用不高，限制了基因治疗技术在皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种双基因共表达重组质粒以及利用该重组质粒制备的同源重组腺病毒，使得所述同源重组腺病毒对抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的肿瘤细胞具有增效作用，同时对鼻咽癌肿瘤细胞的放疗增敏具有增效作用。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案一种 IL-24 与 OSM 双基因共表达重组质粒 pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter -0SM，其保藏号为 CCTCC NO :M2011378o所述双基因共表达重组质粒的基因IL-M和基因OSM已被Genebank公开，其中本发明所引入的基因IL-M核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，基因OSM核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明还提供所述双基因共表达重组质粒与腺病毒pAdEasy-Ι同源重组获得的重组腺病毒质粒 pAdEasy-l-pAcTTrack-CMV-IL-M-polyA-promoter-OSM。本发明还提供所述双基因共表达重组质粒与腺病毒pAdEasy-1同源重组，并在包装细胞中包装产生的重组腺病毒Ad-IL-M-polyA-promoter-OSM (以下简写为 Ad-IL-24-OSM)。其中，所述包装细胞优选为QBH93A。针对利用IL-M或OSM的单基因表达重组质粒获得的同源重组腺病毒对黑色素瘤以及鼻咽癌的肿瘤细胞抑制作用不高的问题，本发明基于在IL-M和OSM双基因之间插入 polyA-promotoHCMV)双启动子表达盒构建双基因共表达载体的构想，在申请人已成功构建的pAdTrack-CMV-polyA-promoter转移质粒(质粒图谱见图1)的基础上，在Bgl IKSal I酶切位点间插入IL-M片段，在Not I、Xho I酶切位点间插入OSM片段(见图2)，构建出本发明所述双基因共表达重组质粒pAcTrrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM。本发明所述双基因共表达重组质粒经PCR和双酶切鉴定表明，由polyA-promoter 介导的IL-M和OSM双基因共表达重组质粒构建成功。此外，RT-PCR以及Wfestern blot鉴定结果表明，本发明所述重组腺病毒Ad-IL-M-OSM能够介导外源性IL-M和OSM基因的转录和表达，表明利用本发明所述双基因共表达重组质粒成功获得了 IL-M和OSM双基因共表达重组腺病毒。
本发明所述双基因共表达重组质粒将带有polyA-promotoHCMV)各自独立启动子的两个表达盒构建于一个质粒上，IL-M和OSM双基因各自独立转录出两种不同的mRNA， 在重组腺病毒中各自独立翻译出不同的蛋白，这两种蛋白协同作用增加彼此抑制黑色素瘤以及鼻咽癌肿瘤细胞的作用，并增加相关促凋亡因子的表达量，具有显著的增效作用。本发明还提供所述双基因共表达重组质粒和重组腺病毒在制备治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌药物中的应用。在体外抑制黑色素瘤以及鼻咽癌肿瘤细胞的各项试验中，本发明所述重组腺病毒 Ad-IL-24-OSM与利用IL-M或OSM的单基因表达重组质粒获得的同源重组腺病毒(以下简称Ad-IL-M和Ad-OSM)在相同感染复数的前提下对两种肿瘤细胞进行试验，结果表明 Ad-IL-M-OSM抑制肿瘤细胞生长的活性明显高于Ad-IL-M和Ad-OSM的抑制肿瘤细胞的活性。在体内抑制黑色素瘤以及鼻咽癌肿瘤细胞的动物模型试验中，本发明通过对裸鼠进行注射肿瘤细胞悬液建立肿瘤小鼠的试验模型，然后在保证相同的感染复数前提下对肿瘤小鼠模型分别注射Ad-IL-M-OSM、Ad-IL-24和Ad_0SM，通过肿瘤重量来计算抑瘤率，结果表明Ad-IL-M-OSM抑瘤率明显高于Ad-IL-M和Ad-OSM的抑瘤率，具有抑瘤增效作用。同时，将鼻咽癌CNE-2Z细胞以及体外黑色素瘤A375细胞通过RT-PCR方法检测其中相关促凋亡基因以及抑制凋亡基因的表达情况，结果显示，注射Ad-IL-M-OSM的肿瘤细胞中的相关促凋亡基因的表达量明显高于注射Ad-IL-M和Ad-OSM的表达量，而抗凋亡基因的表达量明显降低，这与上述体外、体内抑制肿瘤细胞的试验结果相吻合，充分表明了本发明所述重组腺病毒Ad-IL-24-OSM对抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的肿瘤细胞具有增效作用，能够将其应用到制备治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌药物中去。除此之外，本发明还提供所述双基因共表达重组质粒和重组腺病毒在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用。其中，所述放疗的射线优选为钴60 γ射线。鼻咽癌生长在鼻腔后方的鼻咽部、其位置较隐蔽，早期常无明显症状，容易被忽视。而单独的放疗只对辐射敏感的部分肿瘤有比较好的疗效，但是鼻咽癌的原发病灶以及淋巴结转移灶或潜隐性远地转移灶的肿瘤细胞的辐射抗性较高。因此，在放疗中需要利用放疗增敏剂降低这些肿瘤的辐射抗性，以便较为彻底的清除肿瘤细胞，提高放疗效果。处于分裂周期不同时相的肿瘤细胞，其放射敏感性有很大的差异，以M期和G2后期的细胞最敏感。而本发明所述重组腺病毒Ad-IL-M-OSM在上述体外抑制黑色素瘤以及鼻咽癌肿瘤细胞的各项试验中，通过PI单染检测其对鼻咽癌肿瘤细胞周期的影响，结果显示，添加本发明所述重组腺病毒Ad-IL-M-OSM的鼻咽癌肿瘤细胞周期在G2/M期出现明显阻滞，且处于这一时期的肿瘤细胞数明显高于注射Ad-IL-M和Ad-OSM的肿瘤细胞数，表明其能够作为鼻咽癌放疗增敏剂同时，利用鼻咽癌肿瘤细胞裸鼠模型进行注射Ad-IL-M-OSM/Ad-IL-M/Ad-OSM+ 放疗的各项体内、体外试验，结果显示，注射过Ad-IL-M-OSM并放疗的试验组，其抑制肿瘤细胞的的活性、相关促凋亡基因和蛋白的表达量、放疗敏感性等均高于Ad-IL-24+放疗试验组、Ad-OSM+放疗试验组，试验结果进一步表明本发明所述重组腺病毒Ad-IL-M-OSM能够应用于制备鼻咽癌放疗增敏剂中。由以上技术方案可知，本发明通过在Ad-polyA-promoter空载体间亚克隆入IL-24基因和OSM基因构建IL-M和OSM双基因共表达重组质粒，并与腺病毒pAdEasy-Ι同源重组在QBH93A细胞中包装产生Ad-IL-M-OSM重组腺病毒。所述Ad-IL-M-OSM重组腺病毒对抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的肿瘤细胞和移植瘤的生长具有抑瘤增效作用，同时在放疗中对抑制鼻咽癌肿瘤细胞和移植瘤生长具有放疗增敏和增效作用，能够提高放疗效果。生物材料保藏信息说明pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM质粒，已于 2011 年 11 月 7 日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011378，分类命名 ^lXMl^fM DH5 α /pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-0SM,Escherichia coli DH5 α / pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM。
图 1 示本发明所述 AdTrack-CMV-polyA-promoter 质粒图谱；图2示IL-M和OSM双基因共表达重组质粒构建示意图；图 3 示 pAcTrrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM 中 IL-24 基因的电泳鉴定图；A为IL-24基因的PCR鉴定图，M为2000bp Marker, 1为IL-24条带泳道；B为IL-M基因的双酶切鉴定图，M为2000bp Marker, 1为IL-M条带泳道；图 4 示 pAcTrrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM 中 OSM 基因的电泳鉴定图；A为OSM基因的PCR鉴定图，M为2000bp Marker, 1为OSM条带泳道；B为OSM基因的双酶切鉴定图，M为2000bp Marker, 1为OSM条带泳道；图5-A示IL-M和OSM单/双基因重组腺病毒在黑色素瘤A375细胞中的RT-PCR 转录鉴定图；1 为 PBS 组；2 为 Ad-GFP 组；3 为 Ad-IL-24 组；4 为 Ad-OSM 组；5 为 Ad-IL-24-OSM 组；6 为 2000bp Marker，从上至下依次为 2000、1000、750、500、250bp ；图5-B示IL-M和OSM单/双基因重组腺病毒在黑色素瘤A375细胞中的^festern blot鉴定图；A为OSM蛋白条带；B为IL-M蛋白条带；C为内参β-actin ；1 为 Ad-IL-24 组；2 为 Ad-IL-24-OSM 组；3 为 Ad-OSM 组；4 为 Ad-GFP 组；5 为 PBS 组；图6-A示IL-M和OSM单/双基因重组腺病毒在鼻咽癌CNE-2Z细胞中的RT-PCR 转录鉴定图；1 为 PBS 组；2 为 Ad-GFP 组；3 为 Ad-IL-24 组；4 为 Ad-OSM 组；5 为 Ad-IL-24-OSM 组；6 为 2000bp Marker，从上至下依次为 2000、1000、750、500、250bp ；图6-B示IL-M和OSM单/双基因重组腺病毒在鼻咽癌CNE-2Z细胞中的Western blot鉴定图；1 为 PBS 组；2 为 Ad-GFP 组；3 为 Ad-IL-24 组；4 为 Ad-OSM 组；5 为 Ad-IL-24-OSM 组；图7示MTT法检测Ad-IL-M-OSM体外抑制黑色素瘤A375细胞生长率的柱形图；纵坐标为百分率，横坐标为天数，4组柱形图从左至右分别为Ad-GFP组、Ad-OSM 组、Ad-IL-24 组、Ad-IL-24-OSM 组；图8示MTT法检测Ad-IL-M-OSM体外抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞生长的折线a折线为PBS组；b折线为Ad-GFP组；c折线为Ad-OSM组；d折线为Ad-IL-M组； e 折线为 Ad-IL-24-OSM 组；纵坐标为OD值，横坐标为天数(即对应折线上Mh、48h、72h、96h四个时间点)， Δ 表示 P < 0. 05，* 表示 P < 0. 01 ；图9示流式细胞仪检测黑色素瘤Α375细胞周期变化的柱形图；纵坐标细胞数量百分比，横坐标为细胞周期，5种柱形图从左至右依次为PBS组、 Ad-GFP 组、Ad-IL-24 组、Ad-OSM 组、Ad-IL-24-OSM 组；图10示PI单染检测鼻咽癌CNE-2Z细胞周期变化的流式细胞仪结果图；纵坐标为细胞数量，横坐标为小时；图11示流式细胞仪检测黑色素瘤A375细胞凋亡率的柱形图；图12示流式细胞仪检测鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡率的柱形图，Δ表示P < 0. 05， * 表示 P < 0. 01 ；图13示RT-PCR检测Ad-IL-M-OSM感染黑色素瘤Α375细胞后相关基因的转录变化电泳图；1 为 PBS 组；2 为 Ad-GFP 组；3 为 Ad-IL-24 组；4 为 Ad-OSM 组；5 为 Ad-IL-24-OSM 组；图14示RT-PCR检测Ad-IL-M-OSM感染鼻咽癌CNE-2Z细胞后相关基因的转录变化电泳图；1 为 PBS 组；2 为 Ad-GFP 组；3 为 Ad-IL-24 组；4 为 Ad-OSM 组；5 为 Ad-IL-24-OSM 组；图15示Ad-IL-M-OSM抑制裸鼠黑色素瘤A375细胞移植瘤的瘤体重量柱形图；图16示Ad-IL-M-OSM对裸鼠黑色素瘤A375细胞移植瘤的抑瘤率柱形图；图17示Ad-IL-M-OSM抑制裸鼠鼻咽癌CNE-2Z细胞移植瘤的瘤体重量柱形图；Δ 表示 P < 0. 05，* 表示 P < 0. 01 ；图18示Ad-IL-M-OSM对裸鼠鼻咽癌CNE-2Z细胞移植瘤的抑瘤率柱形图；*表示 P < 0. 05 ；图19示MTT法检测Ad-IL-24-OSM联合放疗体外抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞生长的折线图；a折线为PBS组；b折线为Ad-GFP组；c折线为放疗组；d折线为Ad-IL-24+放疗组；e折线为Ad-OSM+放疗组；f折线为Ad-IL-M-OSM+放疗组；折线上4时间点依次为Mh、48h、72h、96h，对应横坐标天数，Δ表示P < 0. 05，* 表示 P < 0. 01 ；图20-Α与图20-Β示PI单染检测鼻咽癌CNE-2Z细胞周期变化的流式细胞仪结果图(联合放疗)；图21示流式细胞仪检测Ad-IL-M-OSM联合放疗对鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡率的柱形图，Δ表示P < 0. 05，*表示P < 0. 01 ；图22示RT-PCR检测Ad-IL-M-OSM联合放疗感染鼻咽癌CNE-2Z细胞后相关基因的转录变化电泳图；1为PBS组；2为Ad-GFP组；3为放疗组；4为Ad-IL-24+放疗组；5为Ad-OSM+放疗组；6为Ad-IL-M-OSM+放疗组；图23示Ad-IL-M-OSM联合放疗抑制裸鼠鼻咽癌CNE-2Z细胞移植瘤的瘤体重量柱形图；Δ表示P < 0. 05，*表示P < 0. 01 ；图M示Ad-IL-M-OSM联合放疗对裸鼠鼻咽癌CNE-2Z细胞移植瘤的抑瘤率柱形图；*表示P < 0. 05。
具体实施例方式本发明公开了一种IL-M和OSM双基因共表达重组质粒和重组腺病毒以及应用， 本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的质粒、重组腺病毒及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明，实施例中所涉及试验数据采用SPSS16. 0统计学软件进行单因素方差分析，P < ο. 05、Ρ < 0. 01视为统计学有显著差异。此外，所有试验加入的重组腺病毒如未说明均为采用最佳感染复数(即对黑色素瘤Α375细胞的最佳感染复数为100Μ0Ι，对鼻咽癌CNE-2Z细胞的最佳感染复数为50Μ0Ι)，同时各试验组加入量保
持一致。实施例1 :pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-0SM 双基因共表达重组质粒的图谱在申请号为200810244301. 3中国发明专利申请说明书公开polyA Δ296 ■-promoter (简称polyA-promoter)序列。本发明所述双基因共表达重组质粒是在 pAdTrack-CMV-polyA-promoter转移质粒的基础上，在Bgl II、Sal I酶切位点间插入 IL-24片段，在Not I,Xho I 酶切位点间插入OSM片段，所述pAdTrack-CMV-polyA-promoter 质粒图谱见图1。实施例2 JL-24和OSM目的基因的克隆比对IL-24的保守序列，设计上游引物IL-M-F、下游引物IL_24_R(见表1)，两端分别引入Bgl II, Sal I酶切位点；以申请人已构建的含有IL-24片段的 PAdTrack-CMV-IL-M-IRES质粒为模板，PCR扩增获得的IL-24目的片段，经琼脂糖电泳鉴
定与预期大小相一致。比对OSM的保守序列，设计上游弓丨物0SM-F、下游引物OSM-R (见表1)， 两端分别引入Not I、Xho I酶切位点，以申请人已构建的含有OSM片段的 pAdTrack-CMV-polyA-promoter-OSM质粒为模板，PCR扩增获得的OSM目的片段，经琼脂糖电泳鉴定与预期大小相一致。表IPCR扩增引物酶切位点上游引物F下游引物RIL-24 (Bgl II、 Sal I )5' -GCACTCGAGCCATGAAT TTTC AAC AGAGGCTGCA-3 ‘5' -GCTTCTAGATCAGA GCTTGTAGAATTTCTG-3 ‘OSM (Not I、 Xho I )5' -ATTTGCGGCCGCATGGG GGTACTGCTC AC AC AGA-3 ‘5' -CCGCTCGAGCTACC GGGGC AGCTGTCCCCT-3 ‘实施例3 :pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-0SM 双基因共表达重组质粒的构建1, pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter 单基因重组质粒的构建将由DNA清洁试剂盒纯化的IL-M基因的PCR产物和小量质粒抽提试剂盒提取的转移质粒 pAcTTrack-CMV-polyA-promoter 分别用 Bgl II,Sal I 37°C双酶切 ^!后，割胶回收目的片段，按试剂盒胶回收方法和步骤操作，然后用T4DNA连接酶将其在4°C连接过夜， 继而再将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，并在含Kana (50 μ g/ml)抗性平板中挑选阳性单克隆，经PCR、双酶切鉴定和DNA序列测定鉴定后，阳性克隆菌_20°C冰箱保种备用。CaCl2法制备DH5 α大肠杆菌感受态细胞和转化技术路线如下转化前一天，DH5a按接种5ml LB培养基37°C培养过夜，按1 %转种5ml LB培养基37°C培养，至0D600nm约为0. 2 (约培养1. 3h)，将菌液倒入5ml离心管中5000r/min， 离心5min收集菌体，加入5ml预冷的IOOmM CaCl2，悬浮菌体后0°C，20_30min后，5000r/ min,离心5min收集菌体用约600 μ 1 IOOmM预冷CaCl2悬浮菌体，并按下表进行转化，并置隔水式恒温培养箱37°C培养IMi挑阳性克隆鉴定，即得到pAdTrack-CMV-IL-M-polyA-pro moter单基因重组质粒，质粒抽提、PCR和双酶切鉴定方法同上。
转化组受体菌DNA培养板阳性组60 μ 11 μ 1质粒Kana阴性组60 μ 1—Kana实验组60 μ 120 μ 1连接液Kana2、pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM 双基因共表达重组质粒的构建在实施例2中克隆的OSM基因和实施例2构建的pAcTTrack-CMV-IL-M-polyA-pr omoter单基因重组质粒的基础上，将经Not I,Xho I双酶切并经胶回收的OSM基因片段和 pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter 质粒片段，用 T4DNA 连接酶连接，构建 pAcTTrack-CMV -IL-M-polyA-promoter-OSM双基因共表达重组质粒。转化、质粒抽提、PCR和双酶切鉴定方法同上。上述构建的双基因重组转移质粒pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM已于2011年11月7日转化到大肠杆菌DH5ci中保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO :M 2011378。实施例4 :pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-0SM 双基因共表达重组质粒的的鉴定以上述保藏的重组质粒 pAcTrrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM 为模板， IL-24-F、IL-M-R为引物PCR能扩增出IL-24目的基因片段，其大小与预期扩增的IL-24理论值大小(621bp)相一致(见图3-A)，以OSM-F、OSM-R为引物PCR能扩增出OSM目的基因片段(见图4-A)，其大小与预期扩增的OSM理论值大小(750bp)相一致。经Bgl II、 Sal I酶切释放出621bp大小的IL-M片段(见图3-B)，Not I、Xho I酶切释放出750bp 大小的OSM片段(见图4-B)，上述结果均表明IL-M及OSM目的基因片段已成功亚克隆于 pAdTrack-CMV-polyA-promoter 改造空转移质粒中，成功构建了 pAdTrack-CMV-IL-24-pol yA-promoter-OSM双基因共表达重组质粒。实施例5 本发明所述同源重组腺病毒质粒的构建以及同源重组腺病毒的包装、 扩增1、同源重组腺病毒质粒 pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM 的构建将pAdTrack-CMV-IL-24-ployA-promoter-OSM 重组质粒用 Pme I 单酶切 2h 线性化后，胶回收与PAdEasy-I腺病毒载体(由复旦大学钟江教授惠赠，已在申请号为 200810244301. 3中国发明中记载)用氯化钙法共转化BJ5183感受态，LB卡纳抗性平板挑选单克隆、抽质粒，酶切鉴定阳性克隆，获得pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-IL-M-polyA-promo ter-OSM同源重组腺病毒质粒，转化DH5 α感受态细菌，挑取并大量扩增阳性克隆，抽提质粒。2、同源重组腺病毒的包装、扩增将构建 pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM 同源重组腺病毒质粒经I^c I酶线性化酶切后，割胶回收大片段，按Lipofecta-mine^OOO操作说明经Lipofecta-min脂质体转染QBH93A细胞进行包装，荧光显微镜下可见GFP的表达， 且荧光强度随培养时间延长逐渐增强。转染IOd后收获第一代腺病毒后再感染QBH93A 细胞，经过多轮感染和扩增，收获的重组腺病毒Ad-IL-M-polyA-promoter-OSM(简称 Ad-IL-24-OSM)于 _80°C保存待用。3、同源重组腺病毒效价检测将Ad-IL-M-OSM同源重组腺病毒感染QBH93A细胞，0. 25%胰酶消化后，PBS调整细胞浓度至IX 105/ml，将细胞按100 μ 1/孔接种于96孔板上，于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养24h后，将同源重组腺病毒分别以10_4、10_5、10_6、10_7、ΙΟ"8稀释，100 μ 1/孔，各设三个复孔，继续培养。1 后于荧光显微镜下进行荧光计数，按公式病毒效价(pfu/ml)= (荧光数X 10)/稀释度计算病毒效价。经多轮感染、扩增后，最终获得可达5X109pfu/ml 效价病毒子于_80°C保存备用。实施例6 制备IL-M和OSM两种单基因同源重组腺病毒为了后续各项体内、体外试验的对比，按照实施例3的方法，采用IL-M和OSM两种基因对应的双酶切，分别连接于pAcTTrack-CMV-polyA-promoter上Bgl II,Sal I酶切位点和Not I、XhoI酶切位点之间，构建出单基因重组质粒pAdTrack-CMV-IL-M-polyA-pro moter和pAcTTrack-CMV-polyA-promoter-OSM，转化、质粒抽提、PCR和双酶切鉴定方法同实施例3。将上述构建的 pAdTrack"CMV-IL-24TX)lyA"i3raiDter 和 pAdTrack"CMV-polyA-promoter_OSM 按照实施例5的方法制备各自的单基因同源重组腺病毒Ad-IL-M-polyA-promoteH以下简称为 Ad-IL-24)、Ad-polyA-promoter-0SM(以下简称为 Ad-OSM)。
实施例7 重组腺病毒对黑色素瘤A375细胞和鼻咽癌CNE-2Z细胞的最佳感染复数1、重组腺病毒对黑色素瘤A375细胞的最佳感染复数将处于对数生长期的A375细胞制备成浓度为105/ml的细胞悬液，按100 μ 1/孔接种于96孔板上，继续培养。24h后将Ad-GFP (空质粒腺病毒)以1、10、25、50、100、150、 200M0I的剂量感染A375细胞。每组各设5个复孔，继续培养。4 后观察A375细胞的形态学变化和荧光显微镜下绿色荧光(GFP)的表达，以毒性最低、感染效率最高的感染剂量来判断重组腺病毒对A375细胞的最佳感染复数MOI，经检测，重组腺病毒对A375细胞的最佳感染复数为100M0I。2、重组腺病毒对鼻咽癌CNE-2Z细胞的最佳感染复数将处于对数生长期的CNE-2Z细胞制备成浓度为105/ml的细胞悬液，按 104/100 μ 1/孔接种于96孔板上，继续培养。24h后将Ad-GFP (空质粒腺病毒)以1、10、 25、50、100、150、200M0I的剂量感染CNE-2Z细胞。每组各设5个复孔，继续培养。7 后观察CNE-2Z细胞的形态学变化和荧光显微镜下绿色荧光(GFP)的表达，以毒性最低、感染效率最高的感染剂量来判断重组腺病毒对CNE-2Z细胞的最佳感染复数Μ0Ι，经检测，重组腺病毒对CNE-2Z细胞的最佳感染复数为50M0I。实施例8 各重组腺病毒的RT-PCR和^festern blot鉴定1、黑色素瘤A375细胞中IL44和OSM基因以及蛋白的表达按实施例7中测定的最佳感染复数感染A375细胞，分别收集经Ad-IL-M-OSM、 Ad-IL-24、Ad-OSM、Ad-GFP (空质粒腺病毒)、PBS (阴性对照)感染的A375细胞，提取各自的总 RNA 进行 RT-PCR，以 IL-24-F、IL-24-R、0SM-F、OSM-R 为引物分别鉴定 IL_24、0SM 基因在A375细胞中的转录，结果可见Ad-IL-M-OSM、Ad-IL-24、Ad-OSM各组均可产生预期大小的62Ibp IL-245片段和750bp OSM片段(见图5-A) ；Ad-GFP以及PBS两组在相应位置均未产生上述条带。RT-PCR鉴定结果初步表明成功构建了由polyA-promoter介导的IL-M 和OSM双基因共表达重组腺病毒以及各单基因重组腺病毒，IL-24、OSM单基因和双基因均可在A375细胞中成功转录。以实施例7中测定的最佳感染复数感染将各重组腺病毒分别感染A375细胞。培养 7 后收集各组细胞，加入细胞裂解液(按IO7细胞Iml细胞裂解液的比例)，取总蛋白上清；蛋白上清以4 1的比例与5XSDS蛋白上样缓冲液混勻，进行SDS-PAGE电泳(分离胶、 浓缩胶浓度分别为12%、5% )，转膜将蛋白由凝胶转移至PVDF膜上；PVDF膜以5%脱脂奶粉封闭后，分别用鼠抗人IL-24、鼠抗人OSM和鼠抗人β-actin抗体稀释液作用后，PBS洗膜3次，再分别加入相应二抗稀释液使其作用；最后将PVDF膜与发光工作液充分接触，室温孵育，暗室中压片曝光、显影和定影(见图5-B)。结果可见，Ad-IL-24、Ad-0SM组感染A375 细胞可分别产生与鼠抗人IL-M抗体和鼠抗人OSM抗体特异性结合的条带；Ad-IL-M-OSM 感染A375细胞则同时可产生与鼠抗人IL-M抗体和鼠抗人OSM抗体特异性结合的条带； Ad-GFP空病毒感染组和PBS对照组在相应位置均未出现上述条带。Wfestern blot鉴定结果进一步表明成功构建了由polyA-promoter介导的IL-M和OSM双基因共表达重组腺病毒以及各单基因重组腺病毒，IL-M、0SM单基因和双基因均可在A375细胞中成功表达蛋白。2、鼻咽癌CNE-2Z细胞中IL44和OSM基因以及蛋白的表达
按照1中的RT-PCR方法检测，结果可见Ad-IL-M-0SM、Ad-IL-24、Ad-OSM各组均可产生预期大小的621bp IL-245片段和750bp OSM片段(见图6-A) ；Ad-GFP以及PBS两组在相应位置均未产生上述条带。RT-PCR鉴定结果初步表明成功构建了由polyA-promoter 介导的IL-M和OSM双基因共表达重组腺病毒以及各单基因重组腺病毒，IL-24、OSM单基因和双基因均可在CNE-2Z细胞中成功转录。按照1中的Astern blot方法检测，结果可见(见图6-B)，Ad-IL-24、Ad-OSM 组感染A375细胞可分别产生与鼠抗人IL-M抗体和鼠抗人OSM抗体特异性结合的条带； Ad-IL-24-OSM感染A375细胞则同时可产生与鼠抗人IL-M抗体和鼠抗人OSM抗体特异性结合的条带；Ad-GFP空病毒感染组和PBS对照组在相应位置均未出现上述条带。Western blot鉴定结果进一步表明成功构建了由polyA-promoter介导的IL-M和OSM双基因共表达重组腺病毒以及各单基因重组腺病毒，IL-24.0SM单基因和双基因均可在CNE-2Z细胞中成功表达蛋白。实施例9 =MTT法检测Ad-IL-M-OSM的体外抑瘤活性1、MTT法检测Ad-IL-M-OSM的体外抑制黑色素瘤A375细胞的活性将处于对数生长期的A375细胞，按5X IO3个/孔接种于96孔板，37°C,5% CO2培养24h后试验组分别加100M0IAd-IL-24、Ad-0SM、Ad-IL-24-0SM病毒液，空病毒阴性对照组加100M0I Ad-GFP,PBS对照组加RPMI-1640培养基，每组设5个复孔，37°C、5% CO2条件下孵育。随后分别于0d、ld、2d、3d、4d加MTT(5mg/ml) 10 μ 1/孔，继续孵育4_6h后加入溶解剂[10% SDS+1% HCl(lmOl/L)]100l·! 1/孔，至次日待甲臢结晶完全溶解后，在酶联免疫检测仪上测OD57tl值，绘制生长曲线，并按细胞生长抑制率=[(对照组OD57tl值-试验组OD57tl 值)/对照组OD57tl值]X 100%计算细胞生长抑制率，结果见图7。由结果可知，Ad-IL-24、Ad-OSM, Ad-IL-24-0SM 各试验组与 Ad-GFP 组和 PBS 对照组比较，对A375细胞有明显的抑制作用，其中Ad-IL-M-OSM对A375细胞的生长抑制率 (57% )明显优于 Ad-OSM (34.3% )、Ad-IL-24 (31.6% )单基因重组腺病毒(P <0.05)，对抑制A375黑色素瘤细胞生长具有抑癌增效作用。2、MTT法检测Ad-IL-M-OSM的体外抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的活性将对数生长期的CNE-2Z细胞制备成浓度为105/ml的细胞悬液，按细胞 104/100 μ 1/ 孔接种于 96 孔板上，Ad-IL-24、Ad-OSM, Ad-IL-24-0SM 各试验组与 Ad-GFP 组和PBS对照组每组各设3个复孔。培养24h后弃上清，将各组细胞按照上述方法处理，随后分别继续培养，于Mh、48h、72h、％h加MTT(5mg/ml) 10 μ 1/孔，继续培养证后加入溶解剂 [10 % SDS+1 % HCl (lmol/L) ] 100 μ 1/孔，次日测OD57tl值，并按公式计算细胞生长抑制率，生长抑制率=[(对照组OD57tl值-试验组OD57tl值)/对照组OD57tl值]X 100%，结果见图8。分别于24h、幼h、7 、邪h测定各组细胞的OD57tl值，并绘制生长曲线(图8)。 结果表明，Ad-IL-24、Ad-0SM、Ad-IL-24-0SM对CNE-2Z细胞均有不同程度的生长抑制作用，且呈时间依赖性(于邪h最为明显)，抑制率通过计算分别为96 士 1.35)
01 士 1.92) (32. 57士3. 36) %,与PBS组和Ad-GFP组比较均有显著性差异(P < 0. 01)，其中 Ad-IL-24-OSM 组较 Ad-IL-24 组、Ad-OSM 组有显著性差异(P < 0.01),具有抑癌增效作用。实施例10 =PI单染流式细胞仪检测Ad-IL-M-OSM对黑色素瘤A375细胞和鼻咽癌CNE-2Z细胞的细胞周期影响1、PI单染流式细胞仪检测Ad-IL-M-OSM对黑色素瘤A375细胞周期的影响向呈对数生长的 A375 细胞中分别加入 Ad-IL-24-0SM、Ad-IL-24、Ad-0SM、Ad_GFP、 PBS，37°C、5% CO2条件下培养细胞4 后收集细胞悬液，PBS洗涤2_3次，70%冷乙醇固定后，加入PI染色试剂，流式细胞仪检测细胞周期变化，结果见图9。由结果可知，经Ad-IL-24、Ad-OSM, Ad-IL-M-OSM感染的A375细胞均出现明显的亚Gl峰和产生不同程度的Gl期细胞周期阻滞，其中Ad-IL-M-OSM双基因的Gl期 (49. 2% )，显著高于 Ad-IL-24 (31. 1 %) ,Ad-OSM(30. 2% )、Ad_GFP 组(6% )和 PBS 对照组 (5. 2% ) (ρ < 0. 05)。2、PI单染流式细胞仪检测Ad-IL-M-OSM对鼻咽癌CNE-2Z细胞周期的影响向呈对数生长的CNE-2Z细胞中分别加入Ad-IL-M-OSM、Ad-IL-24, Ad-OSM、 Ad-GFP, PBS,37°C>5% CO2条件下培养细胞72h后收集细胞悬液，PBS洗涤2_3次，70%冷乙醇固定后，加入PI染色试剂，流式细胞仪检测细胞周期变化，结果见图10。由结果可知，Ad-IL-24-OSM在G2/M期出现明显阻滞，可达52士3. 28) %，不仅显著高于 Ad-GFP 组的 G2/M 期(13. 52 士 1. 35) % 和 PBS 组的 G2/M 期(11. 61 士 1. 26) % (P < 0. 01)，而且高于 Ad-IL-24 (30. 22 士 2. 29) Ad-OSM (32. 12 士 2. 29) % ^ G2/M 期百分比 (P < 0. 01)，单基因组间比较无显著性差异(P > 0. 05)。实施例11 :Annexin-V-PE/7-AAD双染色法流式检测Ad-IL-M-OSM对黑色素瘤 A375细胞和鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡的影响1、Annexin-V-PE/7-AAD双染色法检测Ad-IL-24-OSM对黑色素瘤A375细胞凋亡的影响向呈对数生长的 A375 细胞中分别加入 Ad-IL-24-0SM、Ad-IL-24、Ad-0SM、Ad-GFP、 PBS, 375% CO2条件下培养细胞4 后收集细胞悬液，PBS洗涤2_3次，收集1-5X105 细胞，加入100μ 1的Binding Buffer悬浮细胞后加入1 μ IAnnexin V-PE混勻，37°C水浴15min，然后加入5μ 1 7-AAD染液混勻，37 °C水浴15min然后加入400μ 1的Binding Buffer，在Ih内流式细胞仪检测，结果见图11。结果可见，Ad-IL-24、Ad-0SM、Ad-IL-24-0SM均能不同程度诱导A375细胞凋亡，凋亡率分别为30. 7%、28. 3%、56. 2%与Ad-GFP组和PBS细胞对照组比较差异有统计学意义 (P < 0. 05)；其中双基因腺病毒Ad-IL-M-OSM对诱导A375细胞凋亡的作用明显强于单基因腺病毒Ad-OSM和Ad-IL-M (P < 0. 05)，并对诱导A375黑色素瘤细胞凋亡具有抑瘤增效作用。2、Annexin-V-PE/7-AAD 双染色法流式检测 Ad-IL-24_0SM 对鼻咽癌 CNE-2Z 细胞凋亡的影响向呈对数生长的CNE-2Z细胞中分别加入Ad-IL-M-OSM、Ad-IL-24, Ad-OSM, Ad-GFP、PBS，37°C、5% CO2条件下培养细胞72h后收集细胞悬液，PBS洗涤2_3次，buffer 缓冲液重悬细胞，调节细胞浓度至106/ml，取105/100ul细胞悬液至流式管中，分别加入 Annexin-V-PE IOul,冰上混勻，避光15分钟后再加buffer缓冲液380ul，最后加7-AAD IOul，流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果见图12。结果可见，Ad-IL-24-OSM作用于CNE-2Z细胞72h的诱导细胞凋亡率是(30. 66士2. 55) %，明显高于 PBS 组(1. 94士0. 65) Ad-GFP 组(3. 93士 1. 17) %，有显著性差异(P < 0. 01)，Ad-IL-24-OSM 组与 Ad-IL-24 03. 64士 2. 55) % ,Ad-OSM (20. 68 士 2. 66) % 相比较也有显著性差异(P < 0. 01)，具有抑癌增效作用。实施例12 =RT-PCR检测Ad-IL-M-OSM感染黑色素瘤A375细胞和鼻咽癌CNE-2Z 细胞后相关基因转录的变化1、RT-PCR检测Ad-IL-M-OSM感染黑色素瘤A375细胞后相关基因转录的变化向呈对数生长的 A375 细胞中分别加入 Ad-IL-24-0SM、Ad-IL-24、Ad-0SM、Ad_GFP、 PBS，病毒感染48h，离心收集细胞提取总RNA，应用引物分别进行RT-PCR检测bcl_2、bax, p53和p21基因在A375细胞中的转录表达水平，结果见图13。结果可见，Ad-IL-24、Ad-0SM、Ad-IL-24-0SM作用的 A375 细胞中的 bax、p21 和 p53 促凋亡基因转录明显上调，而bcl-2抑制凋亡基因则明显下调，与PBS组和Ad-GFP组比较有显著性差异(P < 0. 05)，且双基因Ad-IL-M-OSM组的作用明显强于单基因Ad-IL-M和 Ad-OSM 组(ρ < 0. 05)。2、RT-PCR检测Ad-IL-M-OSM感染鼻咽癌CNE-2Z细胞后相关基因的转录变化向呈对数生长的CNE-2Z细胞中分别加入Ad-IL-M-OSM、Ad-IL-24、Ad-OSM、 Ad-GFP, PBS,病毒感染72h，离心收集细胞提取总RNA，应用引物分别进行RT-PCR检测 bcl-2、survivin、p27和p21基因在A375细胞中的转录表达水平，结果见图14。结果可见，与PBS 组、Ad-GFP 组比较，Ad-IL-24 组、Ad-OSM 组、Ad-IL-24-OSM 组均能明显上调p21、p27等促凋亡因子的表达，而明显下调bcl-2、survivin等凋亡抑制因子的表达，且Ad-IL-M-OSM组对上述表达因子的调节作用优于PBS组及Ad-GFP组(P < 0.01),并优于Ad-IL-24组、Ad-OSM组，有显著性差异(P < 0. 01)。单基因组间比较无显著性差异(P > 0. 05)。实施例13 =Ad-IL-M-OSM对黑色素瘤以及鼻咽癌动物模型的体内抑瘤试验1、动物模型的建立A375细胞/CNE-2Z细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培养基于5% CO2, 37°C常规培养。将处于对数生长期的A375细胞/CNE-2Z细胞先用PBS洗涤，经0. 25% 胰酶消化，并用无血清培养液中止后以1000-1500r/min的转速离心2-5min，收获细胞， PBS调整细胞浓度制备细胞悬液(A375细胞悬液浓度5. OX 105/ml ；CNE-2Z细胞悬液浓度 3.0XlOVml)。取4周龄SPF级BALB/c雄性裸鼠50只，安尔碘于裸鼠右前腋下常规消毒后，每只裸鼠皮下注射细胞悬液(A375细胞悬液1.0Χ 105/100 μ 1 ；CNE-2Z细胞悬液 3. 0 X 106/100 μ 1)，待瘤体直径达到一定程度，计为第0天，随机分为5组，每组5只，开始试验。2、试验分组及处理按照表2的分组和处理进行小鼠模型的治疗过程，具体分组情况以及处理标准见下表。表2试验分组及处理
权利要求
1.一种双基因共表达重组质粒pAcTrrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM，其保藏号为 CCTCC NO :M 2011378。
2.保藏号为CCTCCNO =M 2011378的双基因共表达重组质粒与腺病毒pAdEasy-1同源重组获得的重组腺病毒质粒 pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM。
3.源重组，获得的重组腺病毒质粒 pAdEasy-1 -pAdTrack-CMV-IL-24-po 1 yA-promoter-OSM 在包装细胞中包装产生。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述包装细胞为QBH93A细胞。
5.权利要求3或4所述制备方法制备的重组腺病毒Ad-IL-M-polyA-promoter-OSM。
6.权利要求1所述双基因共表达重组质粒在制备治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌药物中的应用。
7.权利要求1所述双基因共表达重组质粒在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用。
8.权利要求5所述重组腺病毒在制备治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌药物中的应用。
9.权利要求5所述重组腺病毒在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用。
10.根据权利要求7或9所述应用，其特征在于，所述放疗的射线为钴60γ射线。
全文摘要
本发明涉及生物领域，公开了保藏编号为CCTCC NOM 2011378的双基因共表达重组质粒pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM，以及由该质粒制备的重组腺病毒Ad-IL-24-polyA-promoter-OSM。本发明通过在Ad-polyA-promoter空载体间亚克隆入IL-24基因和OSM基因构建IL-24和OSM双基因共表达重组质粒，并与腺病毒pAdEasy-1同源重组在QBI-293A细胞中包装产生重组腺病毒。所述重组腺病毒对抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的肿瘤细胞具有增效作用，同时对鼻咽癌肿瘤细胞的放疗增敏具有增效作用。
文档编号A61K48/00GK102559753SQ20111043310
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者刘济生, 杨吉成, 盛伟华, 缪竞诚 申请人:苏州大学