专利名称：Apoe肽及其用途的制作方法
APOE肽及其用途相关申请的交叉引用本申请要求享受2010年I月6日提交的美国临时专利申请第61/292，668号的权益，本文通过提述并入该申请的全部内容。关于电子提交的文本文件的描述通过提述并入下列电子提交的文本文件的全部内容序列表的计算机可读形式拷贝(文件名C0G0_022_01 W0_SeqList_ST25. txt，数据录入:2011年I月6日，文件大小40千字节)。 发明领域本发明涉及包含源自载脂蛋白E(ApoE)的肽二聚体的药物组合物。本发明还涉及用所述新组合物来治疗多种疾病状态，如癌症和神经变性疾病的方法。
背景技术：
癌症是一类疾病，其中某一群细胞呈现不受控制的生长、侵入和破坏邻近组织，以及转移(异常细胞向体内其他位置的播散)，或者其中细胞在合适的时间未能发生程序性细胞死亡(例如凋亡)。癌症造成的死亡占全世界死亡人数的大约13%，并且据美国癌症学会称，2007年全世界死于癌症的人数达7600万。现有的癌症治疗依赖于癌症的具体类型和涉及的组织，但是包括手术、化疗、放疗、免疫治疗、单克隆抗体治疗、以及其他方法。虽然这些方法在某些病例中获得了成功，它们受到了不良反应或功效有限的阻碍。例如，通过手术去除肿瘤来消除癌性组织的功效往往受到癌症易于侵犯邻近组织以及转移到身体内其他部位的倾向的限制。化疗和放疗往往受到毒性或对身体内其他组织的损伤的限制。由此，癌症仍然是严重的健康问题，对于更好的癌症治疗方法存在需求。炎症与癌症的启动、进展和转移有强烈的关联(Mantovani et al. (2008)Nature, Vol. 454:436-444)。促炎症介导物如前列腺素、细胞因子、活性氧/氮种类、以及生长因子等等可活化PI3K/Akt信号传导，后者可增加促生存、增殖和转移过程(Dillon et al. (2007) Oncogene, Vol. 26:1338-1345;Qiao et al. (2008)CellCycle, Vol. 7:2991-2996;Prueitt et al. (2007)International Journal of Cancer,Vol. 120:796-805; Wang and DuBois (2006) Gut, Vol. 55:1 15-122)。在人类癌症中 PI3K/Akt途径中的突变是常见的，该突变导致PI3K/Akt信号传导失调(Carnero et al. (2008)Curr Cancer Drug Targets, Vol. 8:187-98;Dillon et al, 2007;Yuan and Cantley(2008)Oncogene, Vol. 27:5497-5510)。因此对PI3K/Akt信号传导轴的药理学控制是癌症治疗的一个目标。Akt激酶活性受肿瘤阻遏蛋白磷酸酶2A (PP2A)的直接调控。PP2A起对Akt的苏氨酸 308 和丝氨酸 473 去憐酸化的功能(Andjelkovic et al. (1996) Proc. Natl. Acad.Sci. , Vol. 93:5699-5704;Resj5 et al. (2002)Cellular Signalling, Vol. 14:231-238)。但是，PP2A活性在人类癌症中普遍被降低(Chen et al. (2004) CancerCell, Vol. 5:127-136)。癌症中PP2A活性被遏制的机制之一是与内源蛋白抑制物如CIP2A 和 I2PP2A 等形成复合物(Junttila et al. (2007) Cell, Vol. 130:51-62; Li etal. (1996) J. Biol. Chem. , Vol. 271:1 1059-11062)。I2PP2A,又称 SET，是 PP2A 的强抑制物，已被发现与AML和急变期CML有牵连(Li et al, 1996;Neviani et al. (2005)Cancer Cell，Vol. 8:355-368)。虽然PP2A活性在多种人类癌症中被内源抑制，但其可以被药理学地提高，并且是癌症治疗的潜在分子祀(Guichard et al. (2006)Carcinogenesis, Vol. 27:1812-1827;Perrotti and Neviani(2008)Cancer and MetastasisReviews, Vol. 27:159-168;Switzer et al. (2009)Oncogene, Vol. 28:3837-3846)。源自ApoE的肽在炎症相关的神经病，如阿尔兹海默病、多发性硬化和创伤性脑损伤中已经显示出富有前景的减轻损伤的效果(Hoane et al. (2009)Journal of Neurotrauma, Vol. 26: 121-129;Li et al. (2006)J Pharmacol ExpTher, Vol. 318:956-965;Wang et al. (2007)Neuroscience,Vol. 144:1324-33;W02006/029028; WO 2003/026479)。炎症是神经疾病和癌症二者的常见特征，而且PI3K/Akt信号传导在神经变性疾病如阿尔兹海默病中也失调(Griffin et al. (2005) JNeurochem, Vol. 93:105-17 ;Pei et al. (2003) Acta Neuropathol, Vol. 105:381-92)。此外，PP2A亚单位的表达在阿尔兹海默病患者中降低，这与该病中观察到的增加的tau高磷酸化 (tau hyperphosphorylation)相一致(Vogelsberg-Ragaglia et al. (2001)ExperimentalNeurology, Vol. 168:402-412)。ApoE肽据报道还可通过解除SET所致的抑制来增加PP2A活性(见例如W02008/080082)。因此，ApoE肽是治疗多种状况，包括癌症、炎症状况和神经变性疾病的一种可行的治疗手段。虽然已经证明了数种ApoE肽治疗特定状况的有效性，本领域中仍存在开发新的具有更高的强度和更宽的安全窗口的源自ApoE的肽的需求。尤其是，最好能开发出能够有效治疗多种状况的新的基于ApoE的肽治疗剂。发明概述本发明至少部分地基于如下发现，即ApoE肽的二聚化增加它们的生物学活性。因此，本发明提供与单体ApoE肽相比具有更高的功效的新型ApoE肽治疗剂。例如，在一个实施方案中，本发明的肽二聚体包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽。其中所述第一和第二 ApoE肽通过连接模块共价连接。在某些实施方案中，所述第一和第二 ApoE肽含有源自天然ApoE全蛋白质的LDL受体结合域的序列。所述第一和第二 ApoE肽可以是相同的或者可以是不同的。在一些实施方案中，所述二聚体的ApoE肽中的至少一个与蛋白转导域缀合，任选地藉由一个或多个连接残基与蛋白转导域缀合。在其他实施方案中，所述二聚体的第一和第二 ApoE肽各自与蛋白转导域缀合，任选地藉由一个或多个连接残基与蛋白转导域缀合。所述一个或多个连接残基可包括半胱氨酸残基、或者修饰的氨基酸如叠氮高丙氨酸(azidohomoalanine)或炔丙基甘氨酸。所述蛋白转导域可以是源自触角足(antennapedia)、TAT> SynBl、SynB3、SynB5、和聚精氨酸的妝。本发明的二聚体中的第一和第二 ApoE肽可以通过连接模块共价连接。所述连接模块可包括二硫桥、双马来酰亚胺(例如双马来酰亚胺-乙烧(bismaleimido-ethane)或双马来酰亚胺-己烧(bismaleimido-hexane))、1，4_ 二取代的三唑、以及N, N- 二炔丙胺。本发明还包括本发明的ApoE肽二聚体的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含有效量的如本文中所述的ApoE肽二聚体，和可药用的担载体。在一些实施方案中，根据要治疗的具体状况，所述药物组合物还可以包含其他的治疗化合物。本发明还提供通过施用有效量的至少一种如本文所述的ApoE肽二聚体用于治疗、预防或缓解多种状况或疾病的方法，所述状况或疾病包括癌症、神经变性疾病(例如ALS、阿尔茨海默病、帕金森氏病、和亨廷顿氏病)，和炎症状况(例如多发性硬化、炎性肠病、克罗恩氏病、和类风湿性关节炎)。本发明还提供预测或评估用于在患者中治疗癌症的治疗性介入的功效的方法。在一个实施方案中，所述方法包括测量来自患者的生物样品中的SET蛋白的表达水平，并将测得的水平与对照样品中的SET蛋白表达水平比较，其中测得的SET蛋白表达水平指示所述治疗性介入的治疗功效。在某些实施方案中，所述治疗性介入是如本文所述的ApoE肽或肽二聚体。所述生物样品可以是，例如，来自实体瘤的肿瘤活检或从血液样品分离的单核细胞。在一个实施方案中，所述生物样品是⑶19+/⑶5+白血病细胞。本发明还涵盖用于预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗癌症的治疗功效的试剂 盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于测量生物样品中SET蛋白表达的试剂，以及关于测量SET蛋白表达以预测或评估ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗癌症的功效的说明。附图简要说明图I. COGl 12抑制BV2小胶质细胞中LPS诱导的炎症细胞因子的产生。C0G112针对BV2小胶质细胞的NO (绿色方块)、TNF α (红色菱形)、和IL-6 (蓝色三角)的产生的抑制曲线。与lOOng/mL LPS—道添加化合物至图上标示的终浓度。24小时后移出培养基并用双位点ELlSA(BioSource)进行分析，并相对于同一平板上的标准曲线进行定量。图2.原始批次#313的、经还原的、和经化学氧化的C0G112的质谱。通过用于检测质量的正模式下带电喷雾离子化的LC/MS获取了质谱。A.原始批次#313的C0G112的质谱。B.用二硫苏糖醇还原后的原始批次#313的C0G112的质谱。C.暴露于氧化环境以形成二聚体的COGl 12的质谱。红色箭头标示出COGl 12 二硫桥连二聚体的特征峰。图3. C0G449的NO抑制曲线用图上标示的终浓度的C0G449与100ng/mL的LPS —道处理BV2小胶质细胞。24小时后移出培养基并用双位点ELISA(Bi0Source)进行分析，并相对于同一平板上的标准曲线进行定量。图4. BMOE连接的二聚体肽C0G449在CML细胞中活化PP2A。A. 32D_BCR/Abl慢性髓性白血病细胞用C0G449 (I μ M)，C0G445 (I μ Μ) ( 二硫化物连接的COGl 12 二聚体)处理或无处理，并测量ΡΡ2Α活性。B. 32D:BCR/Abl细胞培养物不用化合物处理，或用I μ M C0G449、或5 μ MFTY720处理30分钟，然后在ΝΡ40裂解缓冲液中裂解。用ΡΡ2Α免疫沉淀试剂盒(Upstate)根据制造商的说明对PP2A进行免疫沉淀和测定。图5. A.C0G449对来自4名白血病患者的CLL细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。从血液样品分离人CLL细胞并分析C0G449细胞毒性。将C0G449施加到B-CLL细胞(在96孔板中O. 25xl06个细胞/孔)，72小时后，使用MTS测定(Pharmacia)分析活细胞，以确定有效杀死50%的输入CLL细胞的C0G449浓度(EC50)。B. C0G445对来自7名患者的CLL细胞或来自5名患者的正常B细胞的剂量效应曲线。分离了人CLL细胞和PBMC并用其测定C0G45的细胞毒性。图6. A.标示的COG肽对BV2小胶质细胞中LPS诱导的一氧化氮产生的剂量响应曲线。B.标示的COG肽抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞生长的剂量响应曲线。C.标示的COG肽抑制U87MG成胶质细胞瘤细胞生长的剂量响应曲线。图7.构建ApoE肽二聚体文库的方法的图解。PTD=蛋白转导域；ApoE=apoE_模拟域；“X”和“Y”代表不同的连接模块。图8.双马来酰亚胺偶联。A。双马来酰亚胺偶联反应中涉及的化学转化。在化学合成中掺入的半胱氨酸残基通过双马来酰亚胺化合物如双马来酰亚胺乙烷(BMOE)或双马来酰亚胺己烷(BMH)被偶联在一起。B。BMOE和BMH的化学结构。图9. “点击化学”(Click Chemistry)反应中涉及的化学转化。铜催化的3+2缩
合通过形成稳定的1，4-二取代三唑而造成偶联。A.炔丙基甘氨酸肽与叠氮高丙氨酸肽的异源偶联产生异二聚肽。B.同二聚肽可通过用N，N-二炔丙胺偶联两个含叠氮高丙氨酸的单体肽来合成。
图10. C0G445在乳腺癌细胞系和成胶质细胞瘤细胞系中抑制EGF诱导的Akt活化。A.在EGF存在下暴露于标示浓度的C0G445肽U87的成胶质细胞瘤细胞的Western印迹分析。用针对活化的EGF受体(P-EGFR)、总EGF受体、活化的I3DKl (P-PDKl)、以及总TOKl的抗体探查印迹。B.对U87细胞中在递增浓度的C0G445存在下的由EGF诱导的Akt活化的Western印迹和密度测定分析。图11. C0G45对Akt活化的影响是藉由PP2A来介导的。A.对在有或无冈田酸存在下用标示浓度的C0G45和EGF处理的MDA-MB-231细胞的Western印迹分析。用针对活化Akt (P-Akt)和总Akt的抗体探查印迹。B.对MDA-MB-231细胞中在有和无冈田酸处理的情况下，在递增浓度的C0G45的存在下EGF诱导的Akt活化的密度测定分析。磷酸化Akt对总Akt的比例相对单独EGF的对照的比例进行标准化。C.小图B中所示数据的非线性回归分析。图12. A. MDA-MB-231细胞用EGF和递增浓度的C0G445处理后，从该细胞免疫沉淀的总PP2A活性。B. U87细胞在有或无R田酸的条件下用标示浓度的C0G445处理后，对U87细胞中的总c-myc蛋白水平的Western印迹和密度测定分析。C. MDA-MB-231细胞暴露于EGF和两种不同浓度的C0G445后，从该细胞免疫沉淀PP2A的催化亚单位。探查印迹中的I2PP2A(SET)和PP2A催化亚单位。图13. A. MDA-MB-231细胞在有或无冈田酸的条件下用EGF和标示浓度的C0G445处理后，对该细胞中磷酸化m-TOR水平的Western印迹和密度测定分析。B. MDA-MB-231细胞在有或无R田酸的条件下用EGF和标示浓度的C0G445处理后，对该细胞中磷酸化GSK-3 β水平的Western印迹和密度测定分析。图14. A.用MTT还原来度量的C0G445对U87 (空心圆)和MDA-MB-231 (实心圆)细胞的增殖的剂量响应曲线。B.用细胞计数度量的C0G445对MDA-MB-231细胞的增殖的剂量响应曲线。图15. SET拮抗作用抑制c-Myc在S62的磷酸化。将Raji细胞用C0G449或溶媒对照处理20小时后裂解。裂解物用Western印迹法使用抗-磷酸-S62抗体和总c_Myc抗体进行分析。*表示p〈0. 05。图16. SET在CLL中过表达。A.测得的16名CLL患者和6份正常B细胞样品的SET/ β -肌动蛋白比，显示B-CLL细胞中SET表达相对正常B细胞显著增加。显示了代表性的Western印迹。B.从相同的患者和志愿者样品分离了 mRNA，并通过qPCR定量SET mRNA。图17. SET在B细胞淋巴瘤系中过表达。A.从Raji和Ramos细胞以及正常B细胞分离mRNA，并通过qPCR定量SET mRNA。B.显示来自于小图A相同的细胞的SET和GAPDH的Western印迹，表明在B细胞淋巴瘤系中相对于正常B细胞SET的表达显著增加(N004和 N007)。图18.对SET的沉默可抑制 Raji细胞的生长。利用慢病毒转导导入了针对对照或SET的shRNA，72小时后通过MTT监控Raji细胞的生长。Western印迹显示相对于加载β -肌动蛋白的对照SET被减少了大约一半。图19. SET可能可预测CLL疾病的进展。相对于通过免疫印迹测定的CLL细胞SET水平评估了从诊断到首先需要治疗的时间(“治疗前时间”)。将具有高水平的患者与具有较低水平的患者(通过接受者操作特征来确定)进行比较，前者具有统计学上显著更短的治疗前时间(η=226;ρ〈0· 002)。图20.提议的Mcl-I稳定性调控机制。A. c-myc调控位点与159-164位的Mcl-I序列的序列同源性，显示S/T-X-S-S-S/T-P(SEQ ID NO:89)基序的保守。B.提议的Mcl-I调控复合物的图示(转引自R. Sears提供的附图)。图21.可能调控Mcl-I稳定性的Mcl-I相关蛋白的免疫共沉淀。与Mcl-I免疫共沉淀的蛋白(SET(A)，PP2A(B)，Pin-l(C)，和轴蛋白1(D))的免疫印迹。I指示输入上样对照的泳道，IP指示免疫沉淀泳道。图22SET拮抗作用降低细胞Mcl-I浓度。将原代人CLL细胞铺入平板并与标示浓度的C0G449 —起温育24小时。裂解细胞，进行PAGE并免疫印迹以定量Mcl-I与β -肌动蛋白比O标示ρ〈0· 01) ο图23. C0G449处理抑制体内c_myc依赖性伯基特淋巴瘤Ramos细胞系生长。用溶媒或C0G449肽处理的SCID小鼠中注射IO7个来自伯基特淋巴瘤Ramos细胞系的细胞19天后的肿瘤生长。图24. A.接受C0G449 (空心方块)或乳酸林格氏溶液对照(实心方块)处理的SCID小鼠中Ramos细胞肿瘤异种移植物的肿瘤体积的作图，处理在第11天当肿瘤达到150-200mm3的可触及大小时启动。B.植入后第19天收集的经处理和未经处理的Ramos肿瘤的最终肿瘤质量。林*=ρ〈0· 001，T检验。图25. SET和CIP2A在人原代三阴性乳腺癌(TNBC)中过表达。通过qRT_PCR确定的13份TNBC患者样品中SET(小图A)和CIP2A(小图B)对于正常组织(N)的相对表达。图26. SET在人乳腺癌细胞系中过表达。通过Western印迹显示的TNBC细胞系中SET蛋白与肌动蛋白的表达。图27. C0G449降低eIF4E的磷酸化。U87MG成胶质细胞瘤细胞用C0G449 (I μ Μ)或溶媒对照处理20小时，然后用磷酸-特异性抗体和总eIF4E抗体通过Western印迹测定eIF4E的磷酸化。C0G449处理降低了磷酸_eIF4E蛋白对总eIF4E蛋白的比例(n=3)。*表示与溶媒对照相比p〈0.01。图28. C0G449在乳腺癌细胞中的细胞毒效应。如标示地使细胞系在无血清培养基和C0G449中生长24小时。通过细胞计数来测量细胞增殖。细胞数以相对于对照的、未处理的细胞的相对数表示。
图29. C0G449与索拉非尼或吉非替尼对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系生长的组合处理。如标示，使MDA-231细胞在亚致死剂量的C0G449、索拉非尼或吉非替尼存在下生长。48小时后，使用MTT测定法定量活细胞。***表示p〈0. 001。图30. C0G449处理在异种移植物中抑制三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤生长。将4xl06个MDA-MB-231细胞与基质胶一起注射到免疫缺损小鼠的第4乳腺中，并从第10天开始每天用10mg/kg C0G449皮下注射处理(小图A),或者从注射后的第27天起(小图B)通过尾静脉静脉注射lmg/kg来处理小鼠3周。通过游标卡尺测量来测定肿瘤体积。发明详述本发明人先前发现ApoE合成肽可用于治疗多种癌症。见2009年7月I日提交的WO 2010/002982，将其全部内容通过提述并入本文。这里，本发明人在其先前的工作的基础上进行了扩展，令人惊奇地发现合成ApoE肽的二聚体与其单体的对应物相比展现出增加的生物学活性。本发明人发现有特定的一批ApoE肽，它们在活性测定中强度特别高，已经·被氧化而形成肽二聚体。进一步的实验显示，通过不可逆的连接而形成的ApoE肽二聚体比可逆连接的二聚体还要更强。因此，本发明提供源自ApoE的受体结合区的新的肽二聚体。在一个实施方案中，所述肽二聚体包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽，其中所述第一和第二ApoE肽通过连接模块共价连接。ApoE肽，又称COG肽，是来源于天然ApoE全蛋白的肽。本发明的肽二聚体包含至少两个ApoE肽或ApoE模拟域。所述ApoE肽或模拟域可源自ApoE全蛋白的LDL受体结合区，即全长ApoE蛋白的氨基酸130-150。在某些实施方案中，本发明的ApoE肽或模拟域可来源于ApoE的至少氨基酸133-140。在本发明的一个实施方案中，所述ApoE肽源自ApoE的氨基酸130-149。在又一个实施方案中，ApoE肽源自ApoE的氨基酸133-149。在又一个实施方案中，ApoE肽源自ApoE的氨基酸138-149。如本文中使用的，短语“源自”“衍生自”或“来源于”指含有对来自ApoE蛋白的特定氨基酸序列的至少80%的同一性的肽，或者具有来自 ApoE 蛋白的受体结合区的至少 5，6，7,8,9, 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或 20个相邻氨基酸残基(例如氨基酸第130-150)的肽。举例而言，具有对应于氨基酸133-149中发生一个、两个或三个点突变或氨基酸修饰的序列的肽可认为是源自ApoE蛋白的氨基酸133-149的。ApoE肽或模拟域可以是含有来自天然ApoE蛋白的氨基酸133-149的5个或更多、10个或更多残基，或15个或更多残基的肽的衍生物，包括具有非天然氨基酸替代(如氨基异丁酸和乙基赖氨酸)，和其他可提高所述肽的α螺旋含量的修饰的衍生物。在本发明的一个实施方案中，所述肽二聚体的第一和/或第二 ApoE肽具有序列LRVRLASHLRKLRKRLL (SEQ ID NO: 3 (C0G133))。C0G133单体先前被证明对于治疗或减低脑缺血或脑炎症有用。参见美国专利申请公开号2003/0077641A1，该申请于2002年9月23日提交，将其全文并入本文。在另一个实施方案中，所述第一和/或第二 ApoE肽是C0G133的类似物或衍生物。例如，所述第一和/或第二 ApoE肽具有选自下组的序列AS(Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ ID NO:5 (C0G1410))，LRVRLAS(Aib)LKRLRK(硝基-Arg)LL (SEQ IDN0:4(C0G248))，和 LRVRLAS (Aib) LRKLR(K-Ac) RLL(SEQ ID NO: 35 (C0G345))。可以将其他ApoE类似物或衍生物掺入本发明的ApoE肽二聚体。例如，先前有很多种ApoE 130-150肽的类似物已经被制作出来，并且在基于细胞的测定中测试了它们阻遏炎症细胞因子和自由基的释放的活性，还在受体结合测定中测试了它们的活性。Lynch et al. (2003) J. Biol.Chem. , Vol. 278(4) :48529-33和于2002年9月23日提交的美国专利申请公开流水号2003/0077641A1，于2007年4月17日公告的美国专利No. 7，205，280 ;以及于1999年3月I日提交的美国专利申请流水号09/260，430，本文通过提述并入上述各文献的全部内容。特别地，W02006/029028(本文通过提述并入其全部内容)中描述的改进的ApoE模拟物是本发明的肽二聚体的合适的第一和/或第二 ApoE肽或模拟域。例如，ApoE肽或模拟域可以包括，但不限于
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Ac-AS-Aib-L(om)KL-Aib-K(om)L-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 81)
Ac-AS-Aib-L(om)KL-Aib-K(om)-(NLe)-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 82)
ac-ashlrklrkrll-nh2 (apoEiss-i49)(seq id no S3、)
Ac-ASHCRKLCKRLL~NH2(SEQ ID NO: 84)
ac-asclrklckrll-nh2(seq id no； 85)
Ac-CSHLRKLCiCRLL-NH2(SEQ ID NO: 86)
Ac-ASHLRKCRKRCL-NH2(SEQ ID NO: 87)
Ac-ASHCRKLRKRCL-NH2(SEQ ID NO: 88)其中(NMe)-L为N-甲基化的亮氨酸，Aib为氨基异丁酸，(orn)为鸟氨酸，(narg)为硝基精氨酸，(NLe)为正亮氨酸，(harg)为高精氨酸，(dmarg)为二甲基精氨酸，(aclys)为乙酰赖氨酸，(azlys)为氮赖氨酸，Ac为乙酰化氨基末端。还考虑到其他源自ApoE蛋白的受体结合区的ApoE肽或模拟域。例如，如下的ApoE肽或模拟域是本发明的肽二聚体的合适的第一和/或第二 ApoE肽或模拟域所述ApoE肽或模拟域包含与ApoE蛋白的氨基酸133-149对应的序列，并保留(即不替代)选自下组中的一个或多个关键残基S139, R142, K143, L144, K146, R147和L149，但在其他位置上有一个或多个氨基酸替代。在本发明的特定实施方案中，所述肽二聚体的第一和第二 ApoE肽是相同的。例如，在一个实施方案中，肽二聚体包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID N0:3(C0G133)。在其他实施方案中，肽二聚体的第一和第二 ApoE肽是不同的。举例而言，肽二聚体可包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽,其中所述第一 ApoE肽具有序列 SEQ ID N0:3(C0G133)，第二 ApoE 肽具有序列 SEQ ID NO: 5 (C0G1410)。本发明涵盖了包含本文所描述的不同ApoE肽的所有排列的肽二聚体。在本发明的另一个实施方案中，肽二聚体的第一和/或第二 ApoE肽与蛋白转导域(PTD)缀合。PTD是可增强运载物的胞 内输送的小型碱性肽。可以与ApoE肽缀合的PTD的一些非限制性实例包括源自触角足，SynBl, SynB3, SynB5, TAT,和聚精氨酸的肽。例如，可以与第一和/或第二 ApoE肽缀合的示例性PTD序列包括RQIKIffFQNRRMKffKK(SEQ ID NO 8)YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 9)GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO 36)RRMKffKK (SEQ ID NO 37)RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID NO 38)RRLSYSRRRF(SEQ ID NO 39)RGGRLAYLRRRffAVLGR(SEQ ID NO 40)RRRRRRRR(SEQ ID NO :41)WKK在特定的实施方案中，所述第一和/或第二 ApoE肽与具有序列RQIKIffFQNRRMKffKK (SEQ ID NO: 8) ; YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 9),或 WKK 的 PTD 缀合。在一个实施方案中，所述第一 ApoE肽通过一个或多个第一连接残基与第一 PTD缀合。这样，本发明的肽二聚体可包含与第一 PTD缀合的第一 ApoE肽和不与PTD缀合的第二 ApoE肽。在这样的实施方案中，肽二聚体包含两个ApoE肽或模拟域，和一个PTD。在另一个实施方案中，所述第一 ApoE肽通过一个或多个第一连接残基与第一 PTD缀合，而所述第二 ApoE肽通过一个或多个第二连接残基与第二 PTD缀合。在这样的实施方案中，肽二聚体包含包含两个ApoE肽或模拟域，和两个PTD。因此,本发明的肽二聚体可包含两个ApoE肽域以及O个、一个或两个PTD。见实施例3和图7。二聚体的ApoE肽和PTD可以是本发明中描述的ApoE肽和PTD的任何组合。在特定的实施方案中，PTD选自源自触角足或TAT的肽(例如SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9,或WKK序列)，而 ApoE肽选自 COG 133 (SEQ ID NO: 3)，C0G248 (SEQ ID NO: 4)，C0G1410 (SEQ IDNO:5),或C0G345(SEQ ID NO:35)，如实施例3的表II和IV所述。在一个特定的实施方案中，ApoE肽是C0G133(SEQ ID NO: 3)，且PTD具有序列SEQ ID N0:8。在另一个实施方案中，ApoE肽是C0G133(SEQ ID NO: 3)且PTD具有序列WKK。在另一个实施方案中，肽二聚体包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和所述第二肽通过双马来酰亚胺-乙烷共价连接，且所述第一和第二肽具有序列SEQ ID NO: I、SEQ ID NO: 15或SEQ ID N0:90。例如，在一个具体的实施方案中，肽二聚体包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQID NO: I，且其中所述第一肽和所述第二肽通过SEQ ID NO: I的第17位处的半胱氨酸残基之间的双马来酰亚胺-乙烷接头共价连接(例如，所述肽二聚体是C0G449，见表I)。在另一个具体的实施方案中，肽二聚体包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQID NO: 15，且所述第一肽和所述第二肽通过每个肽的氨基末端处(例如，SEQ ID NO: 15的第I位)的半胱氨酸残基之间的双马来酰亚胺-乙烷接头共价连接(例如，所述肽二聚体是C0G492，见表I)。在另一个具体的实施方案中，肽二聚体包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID N0:90，且其中所述第一肽和所述第二肽通过SEQ ID NO:90的第4位处的半胱氨酸残基之间的双马来酰亚胺-乙烷接头共价连接(例如，所述肽二聚体是COG493，见表I)。所述第一和/或第二 ApoE肽可任选地通过一个或多个连接残基与PTD缀合。如本文中使用的，所谓连接残基是指至少一个氨基酸或修饰的氨基酸，其能够发生反应而交联ApoE肽单体形成稳定的二聚体。在一些实施方案中，连接残基适于使用马来酰亚胺基团(如图8中描述的那些)来交联，或者通过形成稳定的1，4- 二取代的三唑(如图9描述的)来交联。示例性的连接残基包括半胱氨酸、叠氮高丙氨酸和炔丙基甘氨酸。其他合适的连接基团可以由本领域技术人员来确定。·
本发明的肽二聚体包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽，其中所述第一和第二 ApoE肽通过连接模块共价连接。如本文中使用的，所谓“连接模块”可以是这样的化合物或分子，其交联肽二聚体，使得各肽链被至少四个原子分隔开。可以选择连接基团来形成肽单体之间的接头的不同长度。例如，可以选择连接模块使得各肽链相隔至少6个原子，至少8个原子，至少10个原子，或者至少12个原子。连接模块可以是天然ApoE序列中找不到的异源氨基酸，如多余的半胱氨酸残基或修饰的氨基酸，如叠氮高丙氨酸或炔丙基甘氨酸。在一些实施方案中，连接模块可以包括通过与肽链中的氨基酸所起的交联反应而产生的分子或化合物。例如，在特定的实施方案中，连接模块选自二硫桥、双马来酰亚胺、1，4- 二取代三唑、和N，N- 二炔丙胺。所述双马来酰亚胺可包括但不限于双马来酰亚胺-乙烷或双马来酰亚胺-己烷。在一些实施方案中，所述连接模块不是肽键。在肽二聚体包含不与PTD缀合的ApoE肽的实施方案中，两个ApoE肽可以这样连接，使得第一 ApoE肽的羧基末端与第二 ApoE肽的氨基末端连接(例如直接连接)。或者，两个ApoE肽可以这样连接,使得两个ApoE肽彼此处于相反方向。例如,第一 ApoE肽的羧基末端可以与第二 ApoE肽的羧基末端连接，或者第一 ApoE肽的氨基末端可以与第二 ApoE肽的氨基末端连接。这样的连接可以通过在第一和第二 ApoE肽的合适的末端添加一个或多个能够进行交联反应的氨基酸残基(例如半胱氨酸、叠氮高丙氨酸、或炔丙基甘氨酸残基)来实现。举例而言，添加到第一和第二 ApoE肽二者的氨基末端的半胱氨酸残基将产生这样的二聚体，其中第一和第二 ApoE肽的氨基末端相互连接(见例如实施例2中的C0G492)。在肽二聚体包含至少一个与PTD缀合的ApoE肽的实施方案中，可以通过将ApoE-PTD缀合物中的至少一个连接残基与另一个未缀合的ApoE肽的羧基或氨基末端处的氨基酸交联来形成二聚体。如果两个ApoE肽都与PTD缀合，则优选地通过将每个ApoE-PTD缀合物中的至少一个连接残基交联，使得两条肽链通过内部氨基酸残基连接在一起来形成二聚体。可以将ApoE肽或模拟域掺入多聚体中，使得一个ApoE多聚体包含三个或更多个ApoE肽或模拟域。所述多聚体中的一个或多个ApoE肽可以如本文中所述的那样与PTD缀合。在一个实施方案中，本发明提供一种ApoE三聚体，包含第一 ApoE肽、第二 ApoE肽，和第三ApoE肽，其中所述第一、第二和第三ApoE肽通过连接模块共价连接。考虑到本发明范围内的其他ApoE多聚体。本发明的肽可以通过如本领域已知的标准技术来产生。本发明的肽可以附接于多种标记模块，如放射性标记物、重原子标记物和荧光标记物,用于检测和示踪。突光标记物包括但不限于萤光素(Iuciferin)、突光素(fluorescein)、曙红、Alexa Fluor、Oregon Green>Rhodamine Green、四甲基罗丹明、Rhodamine RecUTexas Red、香豆素和NBD荧光团，QSY 7、dabcyl和dabsyl生色团，BODIPY、Cy5等等。本领域技术人员能够容易地对本文中公开的肽进行修饰以提高与这些肽相关的功能活性。例如，可以将本发明的肽二聚体化学修饰或缀合到其他分子，以提高溶解性、血清稳定性等参数，同时保持功能活性。尤其是，可将二聚体的第一和/或第二 ApoE肽的N末端乙酰化和/或将其C末端酰胺化，或者可以将二聚体进一步与增加血清稳定性的分子 缀合、复合(complex)或融合(fuse)，这样的分子包括但不限于白蛋白、免疫球蛋白及其片段、转铁蛋白、脂蛋白、脂质体、α-2-巨球蛋白和α-I-糖蛋白，PEG和右旋糖酐。这样的分子在美国专利6，762，169中有详细描述，通过提述并入其全部内容。本发明的肽二聚体的ApoE肽还可以包括本文中所述的肽的保守变体。如本文中使用的，所谓保守变体是指氨基酸序列中不会对肽的生物学功能产生不利影响的改变。对于替代、插入或缺失来说，如果被改变的序列阻止或阻断与该肽相关的生物学功能，则称替代、插入或缺失对肽产生不利影响。例如，可以改变肽的总电荷、结构或输水/亲水性质而不对生物学活性产生不利影响。因此，可以改变氨基酸序列，例如改变使得肽更加疏水或者亲水，而不对该肽的生物学活性产生不利影响。一般而言，所述肽的保守替代变体、类似物和衍生物与公开的序列，SEQ ID NO:3,4, 5,和35，将具有至少约55%，至少约65%，至少约75%,至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%至99%的氨基酸序列同一性。相对于这些序列的同一性或同源性在此定义为将序列比对好，并且视需要引入缺口(gap)，以实现最大百分比的同一性，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与已知肽相同的氨基酸残基的百分比。N端、C端或内部的延伸，缺失，或者对序列的插入不应视为影响同源性。因此，本发明的肽二聚体的第一和/或第二 ApoE肽包括具有SEQ ID N0:3，4，5和35中公开的氨基酸序列的分子，其具有治疗肽的至少约3，4，5,6, 10，15或更多个氨基酸残基的连续序列的片段；此类肽的氨基酸序列变体，其中氨基酸残基已经插入到公开的序列的N端或C端或序列之内；以及公开的序列或它们的如上定义的片段的氨基酸序列变体，它们已经被另一个残基替代。考虑的变体还包括通过例如同源同组、定点诱变或者PCR诱变等而含有预定的突变的变体，以及其他动物物种的相应肽，包括但不限于家兔、大鼠、猪、牛、绵羊、马和非人灵长类物种，以及其中所述肽已经通过取代、化学、酶学或其他合适的方式用天然氨基酸之外的模块(例如可检测的模块，如酶或放射性同位素)共价修饰。交联肽以形成肽二聚体的方法是本领域技术人员已知的，可包括但不限于通过马来酰亚胺基团偶联，和使用“点击化学”偶联(参见实施例3和附图8-9)。本领域技术人员无需过多劳动即可确定其他用于共价连接本文公开的ApoE肽以形成肽二聚体的方法本发明的二聚体的ApoE肽可以是游离形式或者盐的形式，当盐可药用时。这些包括钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰等的无机盐。也可以制成所述肽的各种有机盐，包括但不限于与乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等成的盐。在一个实施方案中，本发明的肽二聚体与可药用的担载体组合使用。由此，本发明还提供适合施用于受试者的药物组合物。这样的组合物包含与可药用的担载体组合的有效量的本发明的ApoE肽二聚体。所述担载体可以是液体，使得组合物适合于胃肠外施用，或者可以是固体，即配制用于口服施用的片剂或药丸。此外，担载体可以是可雾化的液体或固体的形式，使得组合物适于吸入。当胃肠外施用时，组合物应当是无热原的，并且处于合适的胃肠外担载体中。作为替代，活性剂可以使用已知方法包埋在脂质体中来配制。可以使用本领域中已知的技术来进行用于鼻内施用的本发明的肽二聚体的制备。本发明的肽二聚体还可以配制为用于表面施用，例如以乳膏或凝胶的形式。表面施用对于治疗皮肤癌或炎症性皮肤状况特别有用。在其他实施方案中，ApoE肽二聚体可以配制为用于直肠施用，例如以栓剂的形式。在一些实施方案中，ApoE肽二聚体的直肠施用对于结直肠癌、炎性肠病或克罗恩氏病的治疗可能是优选的。·
本发明的肽二聚体的药物制备物还可任选地包含可药用的稀释剂或赋形剂。本发明的ApoE肽二聚体可以包含进一步的修饰或者加以配制，以便特异性地靶向特定组织，例如发炎的组织或者癌性肿瘤。例如，可以将ApoE肽二聚体与可定位到肿瘤细胞的其他肽缀合，这样的其他肽例如有美国专利6，380，161、美国专利申请公开号2003/0232013、WO 2009/155556和W02009/143023中公开的那些肽。并且/或者，可以将ApoE肽二聚体包埋到脂质体中。脂质体可包含寻靶配体以便将脂质体定位到特定的组织或肿瘤部位。本发明的ApoE肽二聚体的有效量是这样的量，与没有该肽的情况下相比，其可减少与癌症相关的至少一种症状或病态，例如肿瘤大小、肿瘤生长、癌细胞的扩散、癌细胞的数目、以及生存。ApoE肽二聚体的有效量还可以是这样的量，与没有该化合物的情况下相t匕，其可减少小胶质细胞活化(即减少小胶质细胞产生神经毒性和神经调节性化合物的量)。有效量(以及施用方式)，将基于个体来确定，并且将以所使用的肽二聚体的具体组成为基础，同时考虑受试者(身材、年龄、一般健康状况)、所治疗的具体状况(例如癌症、神经变性病症、炎症状况)、要治疗的症状的严重程度、所追求的结果、所使用的具体的担载体或药物配方、施用路径、以及本领域技术人员容易想到的其他因素。本领域普通技术人员可使用本领域已知的技术来确定有效量。本文中描述的肽二聚体的治疗有效量可以使用体外测试、动物模型、或本领域已知的其他剂量-响应研究来加以确定。本发明的ApoE肽二聚体可以急性施用(即在发病时，或者在导致特定状况得到确诊的事件之后不久)，或者可以预防性施用(例如，在计划好的手术之前，或者在出现特定状况的征象或症状之前)，或者可以在特定疾病或状况的过程中施用，以减轻或缓解原本会发生的症状发展。施用的时机和时间间隔根据受试者的症状而改变，施用间隔可以为数小时到数天，时程可以以小时计，以天计，以周计或者更长，可以由本领域技术人员来确定。典型的每日给药方案可以是从0.01 μ g/kg体重每日，从大约lmg/kg体重每日，从大约10mg/kg体重每日，从大约100mg/kg体重每日，从大约1，000mg/kg体重每日。根据要施用的具体ApoE肽二聚体的不同，剂量可以为约lmg/kg到约500mg/kg体重每日之间，优选约25mg/kg到约400mg/kg体重姆日之间，或更优选约50mg/kg到约250mg/kg体
重每日之间。本发明提供通过施用有效量的至少ー种如本文所述的ApoE肽ニ聚体来在有需要的受试者中治疗癌症的方法。在特定的实施方案中，所述至少ー种ApoE肽ニ聚体包含选自下组的序列SEQ ID NO: 1，3，4，5，6，7，10，11，12，13，14，15，35，90，其有效片段和变体。ApoE肽ニ聚体可減少一种或多种与癌症相关的症状，包括但不限于肿瘤形成、肿瘤生长、癌性细胞数目、癌性细胞对健康组织的扩散、以及生存減少。可以用本发明的肽ニ聚体和方法来治疗的癌症包括，但不限于各种形式的白血病(CLL、CML、ALL、AML)，乳腺癌，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、脑癌(例如胶质细胞瘤)、皮肤癌(黑素瘤和非黑素瘤)、头颈癌、膀胱癌、子宮内膜癌、肾细胞癌、甲状腺癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、肝癌、淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)、以及肉瘤。在一个实施方案中，所述ApoE肽ニ聚体能减少在多种癌症中异常活化的信号传导途径(例如Akt途径)的活化(见实施例5)。ApoE肽还可活化PP2A (实施例2、5和10)。PP2A据报道可负调节内皮细胞活动性，而内皮细胞活动性是癌症中的血管新生和肿瘤转移所必需的(Gabel et al, 1999, Otolaryngol Head Neck Surg. 121:463-468; Young, MR. , 1997, Adv Exp Med Biol. 407:3 11-318)。冈田酸对PP2A 的抑制通过破坏细胞骨架网络而增加细胞活动性，从而增强肿瘤细胞的侵袭性质。因此，本发明的肽ニ聚体可通过活化PP2A而降低肿瘤细胞转移和癌症相关的血管新生。在本发明的一个实施方案中，ApoE肽的施用増加受试者体内癌细胞中的PP2A活性。在另ー个实施方案中，ApoE肽的施用降低受试者体内癌细胞中的Akt激酶活性。在又一个实施方案中，ApoE肽的施用诱导受试者体内癌细胞中的细胞毒性。本发明还提供ー种用于治疗白血病的方法，包括以一定的量施用至少ー种ApoE肽ニ聚体，所述量与没有该肽ニ聚体的情况下相比可减少该疾病的症状。在一个实施方案中，所述白血病是慢性髓性白血病(CML)。SET( BP I2PP2A)是ー种内源PP2A负调节物，它在CML中过表达并抑制PP2A，从而保持致癌的BCR/ABL激酶途径的活化(Neviani etal. (2005)Cancer Cell. 8:355-368)。因此，施用本发明的ApoE肽ニ聚体可活化PP2A，然后PP2A可自由地对细胞扩增和生存的调节物进行去磷酸化并遏制BCR/ABL激酶的致癌活性，从而减少白血病生成。在一个实施方案中，所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在优选的实施方案中，ApoE肽ニ聚体的施用减少受试者体内的CD5+B细胞数。在另ー个实施方案中，所述白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)。本发明还涵盖通过对受试者施用有效量的至少ー种ApoE肽ニ聚体来治疗受试者中的乳腺癌的方法。在一个实施方案中，所述乳腺癌以Her2表达为特征。在另ー个实施方案中，所述乳腺癌以雌激素受体的表达为特征。在另ー个实施方案中，所述乳腺癌以孕酮受体的表达为特征。本发明的ApoE肽ニ聚体可以用来治疗乳腺癌的三种主要亚型中的任ー种腔内肿瘤(ER+/HER2-)、Her2扩增肿瘤(HER2+)、或者三阴性乳腺癌(TNBC，ER-/PR-/HER2-)。在特定的实施方案中，要用本发明的ApoE肽ニ聚体治疗的乳腺癌是三阴性乳腺癌，其特征是缺少雌激素受体、孕酮受体、以及HER2受体的表达。ApoE肽ニ聚体的施用优选在它们的施用之后减少肿瘤生长。本发明的ApoE肽ニ聚体可单独用来治疗癌症或者与其他常用于治疗癌症的治疗剂组合使用，这样的治疗剂例如化疗剂(苯丁酸氮芥、环磷酰胺)，皮质类固醇(强的松，强
17的松龙)、氟达拉滨、喷司他丁、克拉屈滨、伊马替尼(Gleevec)、达沙替尼(Sprycel)、激素治疗(他莫昔芬、芳香酶抑制剂)、索拉非尼、吉非替尼、和放射。在一些实施方案中，ApoE肽二聚体与索拉非尼或吉非替尼联用来治疗癌症。如本文中使用的，“与……联用”是指施用ApoE肽二聚体和其他治疗剂使得它们的作用在时间上重叠。因此，ApoE肽二聚体可以与其他治疗剂同时使用或者在施用所述治疗剂之前或之后施用。本发明提供一种用于预测或评价用于在患者中治疗癌症的治疗性介入的功效的方法。在一个实施方案中，所述方法包括测量来自患者的生物样品中SET蛋白的表达水平，并比较测得的水平与对照样品中SET蛋白的表达水平，其中测得的SET蛋白的表达水平指示所述治疗性介入的治疗功效。在特定的实施方案中，所述治疗性介入是本发明的ApoE肽或肽二聚体。本发明人已经发现ApoE模拟肽和肽二聚体结合SET (即I2PP2A)并解除其对内源PP2A的抑制，从而增加细胞中PP2A的活性。不限于任何具体理论，认为这种由ApoE肽或肽二聚体诱导的PP2A活性增加触发凋亡，导致癌细胞的细胞毒性。因此，过表达SET蛋白的癌细胞对ApoE肽诱导的细胞毒性特别敏感。由此，本发明包括一种预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗癌症的治疗功效的方法，该方法是通过测量来自患者的生物样品中SET蛋白的表达水平，并将测得的水平与对照样品中SET蛋白的表达水平比较来进行的，其 中测得的SET蛋白的表达水平指示ApoE肽或肽二聚体的治疗功效。在一个实施方案中，测得的相对于对照样品为至少2倍的SET表达水平指示ApoE肽或肽二聚体在所述患者中治疗癌症的治疗功效。在一些实施方案中，测得的相对于对照样品为至少4倍、至少5倍、至少8倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、或至少20倍的SET表达水平指示ApoE肽或肽二聚体在所述患者中治疗癌症的治疗功效。在一个实施方案中，所述方法可预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗乳腺癌的治疗功效。在另一个实施方案中，所述方法可预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗三阴性乳腺癌(雌激素受体阴性、孕酮受体阴性，以及HER2受体阴性)的治疗功效。在另一个实施方案中，所述方法可预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗B细胞淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)的治疗功效。在又一个实施方案中，所述方法可预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗白血病(例如CML或CLL)的治疗功效。SET表达可以通过评估SET蛋白或SET转录物的水平来测定。SET表达可以通过本领域已知的方法来测量，这样的方法包括但不限于Northern印迹、PCR、RT-PCR、Western印迹、免疫测定(例如ELISA或多重测定(multiplexedassays))、2D凝胶电泳、和杂交。在一个实施方案中，测量SET蛋白表达。在特定实施方案中，所述用于预测ApoE肽疗法在患者中治疗癌症的功效的方法还包括在评估了患者的生物样品中的SET表达后，对该患者施用至少一种ApoE肽或肽二聚体。本文中描述的任何ApoE肽或其二聚体都适用于该方法。例如,在一些实施方案中，对患者施用具有选自SEQ ID N0:l、3、4、5、6、7、10、ll、12、13、14、15、35、90及其有效片段和变体的序列的ApoE肽或其二聚体。在另一个实施方案中，本发明还包括根据所述患者的生物样品中的SET蛋白的表达水平来调整ApoE肽或肽二聚体的具体类型或者ApoE肽或肽二聚体的剂量。可以在一段特定的时间内或者整个治疗期内多次测量患者中的SET表达水平。所述生物样品可以使任何包含癌性细胞的组织样品。例如，所述生物样品可以包括，但不限于来自实体瘤(例如乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤等)的活检，或者从血液分离的外周血单个核细胞(PBMC)。在一个实施方案中，所述生物样品是CD19+/CD5+白血病细胞。对照样品可以使任何含有正常或肺癌细胞的组织样品，例如从正常的年龄匹配的患者分离的PBMC，或者从要治疗的患者或从正常的、年龄匹配的对照患者获得的非癌性组织(例如乳腺、淋巴、皮肤等等)。本发明还涵盖用于预测或评估ApoE肽或肽ニ聚体用于在患者中治疗癌症的治疗功效的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于测量生物样品中SET蛋白表达的试剂，以及关于测量SET蛋白表达以预测或评估ApoE肽或肽ニ聚体用于在患者中治疗癌症的治疗功效的说明。在一些实施方案中，用于测量SET表达的试剂可包括SET特异性抗体、ELISA试剂、以及用于扩增和检测SET mRNA的引物和探针。在其他实施方案中，所述试剂盒还可包括ー个或多个标准化对照。例如，标准化对照可以是外源添加的、天然不存在于样品中的RNA或蛋白，或者其可为已知在特定的生物样品或细胞中组成性表达的蛋白质或RNA，例如β_肌动蛋白。在这样的实施方案中，所述试剂盒可进一歩提供用于检测和定量所述标准化対照的试剂(抗体、引物、探针等)。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括ー套參照值，可用来与测得的SET表达水平比较。本发明提供一种用于在有需要的受试者中降低胶质细胞活化或小胶质细胞活化的方法，该方法是通过对所述受试者施用至少ー种本发明的ApoE肽ニ聚体来实施的。在一个实施方案中，所述小胶质细胞活化与中枢神经(CNS)炎症、创伤性脑损伤、脑缺血或脑水肿相关。因此，本发明和组合物可用于预防、遏制或降低作为急性或慢性CNS疾病的一部分发生的CNS中胶质细胞的活化。本发明方法和肽ニ聚体的效果可以在细胞或组织水平评估(例如通过组织学或形态测量手段)，或者通过评价受试者的神经学状态来评估。胶质细胞活化的遏制或降低可通过多种方法来评估，这对本领域技术人员而言是显而易见的；ー种这样的方法是测量已知由活化的胶质细胞产生的化合物的产生或存在，并将这样的测量值与相同化合物在对照情况下的水平相比较。或者，本发明的方法和肽ニ聚体遏制、降低或防止小胶质细胞活化的效果可以通过比较经过处理的受试者和对照受试者中CNS疾病的体征和/或症状来加以评估，其中这样的体征和/或症状与小胶质细胞的活化相关或者继发于小胶质细胞的活化。本发明的方法和肽ニ聚体可用于预防、治疗或缓解与急性CNS损伤相关的神经学体征和症状。如本文中使用的，所谓急性CNS损伤包括但不限于卒中(由血栓形成、栓塞或血管收缩造成的)、闭合性头部外伤、全脑缺血(例如由于任何原因，包括心肌梗塞、心律不齐、出血性休克、以及冠状动脉旁路搭桥术后的脑损伤，造成的系统性低血压而导致的缺血)、局灶性缺血、以及颅内出血。中枢神经系统的出血性损伤可以是局灶性或全局性状况的結果。全局性缺血在流向全脑的血流停止一段时间(例如在心脏停搏过程中)时发生。局灶性缺血在脑的一部分的正常血流被剥夺(例如在血栓栓塞性脑血管堵塞、创伤性脑损伤、水肿和脑肿瘤中)时发生。由于脑缺血导致的CNS损伤大多发生在缺血状况之后数小时甚至数天内，并继发于受损组织的细胞毒性产物的释放。本发明的方法和肽ニ聚体还可用于预防、治疗或缓解与影响中枢神经系统(包括CNS)的炎症状况相关的神经学体征和症状，包括但不限于多发性硬化、血管炎、急性播散性脑脊髄炎和格-巴ニ氏综合征。在此方面，本发明的ApoE肽ニ聚体可以单独使用或者与其他已知的抗炎药或细胞因子联用以配制成用于治疗CNS炎症状况的药物组合物。
在另ー个实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中减少神经元细胞死亡的方法，包括对受试者使用有效量的至少ー种本文中描述的ApoE肽ニ聚体。在一些实施方案中，神经元细胞死亡与谷氨酸兴奋性中毒(glutamate excitotoxicity)相关。先前发现C0G133単体肽显著抑制与N-甲基-D天冬氨酸暴露相关的神经元细胞死亡和钙内流(见例如美国专利公开号2003/0077641A1，兹通过提述并入其全部内容)。因此，本发明的肽ニ聚体为改良的用于治疗与NMDA受体过刺激介导的谷氨酸兴奋性中毒相关的疾病的治疗组合物提供了基础。例如，人们已经将谷氨酸兴奋性中毒与下述状况关联起来山黧豆中毒(neurolathyrism),肌萎缩侧索硬化(ALS) (Doble (1999) Pharmacol.Ther.，Vol. 81:163-221)，精神分裂症(Nguimfack (2002) Encephale, Vol. 28:147-153)、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏病(Nguimf ack, 2002; Myti lineou et al. (1997) J. Neurochem. , Vol. 68:33-39;Klopman and Sedykh(2002)BMC Pharmacol. , Vol.2:8;Le andLipton(2001)Drugs Aging, Vol. 18:717-724),双相型障碍(Farber et al. (2002)Mol. Psychiatry, Vol. 7:726-733),人和动物中的实验性自身免疫脑炎(EAE)中的多发性硬化(Paul and Bolton(2002)J. Pharmacol. Exp. Ther. , Vol. 302:50-57)> 抑郁症、卒中(Le and Lipton，2001)、癫痫和遗传性神经代谢疾病d_2-羟基戊ニ酸尿病(Kolker et al. (2002) Eur. J. Neurosci. , Vol. 16:21-28),以及阿尔茨海默病(Bi etal. (2002) Neuroscience, Vol. I 12:827-840; Bi et al. (2002) J. Neurol. Sci. , Vol. 200:11-18)和创伤性脑损伤(Rao et al. (2001) Brain Res. ,Vol. 911:96-100; Regneret a I. (2001)J.Neurotrauma, Vol. 18:783-792;Xu and Luo (200 I)Chin.J. TraumatoI. , Vol. 4:135-138)。因此，本发明包括公开的肽ニ聚体在用于治疗任何上述疾病或病症的方法和药物制剂中的应用，以及在含有其他可用于治疗所述各种病症的已知化合物的联合治疗组合物中的应用。例如，在一些实施方案中，本发明的肽ニ聚体可以用于在有需要的受试者中治疗山黧豆中毒、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病、帕金森氏病、或精神分裂症。利鲁唑(Riluzole)(力如太(RILUTEK) ,Rhone-Poulenc)是一种具有谷氨酸
拮抗性质的物质，用于肌萎缩侧索硬化中的神经保护治疗，已经在临床试验中测试用于治疗亨廷顿氏病和帕金森氏病(Schiefer et al. (2002)Mov. Disord. , Vol. 17:748-757;Doble, 1999) Jchiefer及其同事最近证实利鲁唑在亨廷顿氏病的转基因小鼠模型中延长生存时间并改变核包涵体的形成。因此，考虑到本发明的肽ニ聚体可能的NMDA拮抗作用，这些肽ニ聚体可以单独地或者与其他谷氨酸拮抗剂如利鲁唑联合用于治疗ALS、亨廷顿氏病和帕金森氏病的药物制剂中。L-司来吉兰(L-Deprenyl)是单胺氧化酶(MAO)-B的抑制剂,其可延迟帕金森氏病失能的出现和体征和症状的进展，并且被预测可针对谷氨酸受体活化的下游事件发挥保护作用(Mytilineou et al，1997)。MAO-B抑制剂，多巴胺受体拮抗剂，如左旋多巴，以及NMDA受体拮抗剂都已经显示具有抗帕金森作用，而且还已经显示多种药物的组合能够协同地提高这些药物的抗帕金森作用(Klopman and Sedykh，2002)。因此，考虑到本发明的肽ニ聚体的可能的NMDA拮抗作用，这些肽可以单独地或者与其他NMDA拮抗剂、MAO-B抑制剂如L-司来吉兰，多巴胺受体激动剂如左旋多巴联合用于治疗帕金森氏病的药物制剂中。已发现谷氨酸兴奋性中毒导致的自由基产生与精神分裂症的发病机制有牵连(Nguimfack, 2002)。因此，研究者们已经开始考察用ALS、帕金森氏病和亨廷顿氏病等其他神经疾病的治疗中使用的抗氧化物质来治疗精神分裂症。考虑到本发明的肽二聚体很可能具有NMDA受体拮抗性质并且能够用来抑制由谷氨酸兴奋性中毒导致的自由基产生，这些肽可以单独地或者与其他抗氧化物质联合用于治疗精神分裂症的药物制剂中。本发明还包括用于在有需要的受试者中治疗、预防或缓解多发性硬化的症状的方法，所述方法是通过对所述受试者施用有效量的至少一种本发明的ApoE肽二聚体来进行的。从对免疫治疗的应答，以及实验性自身免疫脑炎(EAE)的动物模型的存在可以确定多发性硬化(MS)是一种免疫介导的疾病。参见例如Mix et al. (2004) J. NeuroimmunoL, Vol. 151 (1-2) : 158-70，Anderson, et al. (2004)，Ann. Neurol, Vol. 55 (5) : 654-9，和Ni et al. (2004) Mult. Scler. ,Vol. 10(2) : 158-64。目前用于反复性和弛张性 MS 的治疗药干扰素(IFN) β-lb，IFN-β-Ia和乙酸格拉默(克帕松(COPAXONE) ，Teva)具有应对MS的免疫学病理生理的作用机制(Dhib-Jalbut (2002)Neurology, Vol. 58:S3_S9)。例如，干扰素结合细胞表面特异性受体，引发信号传导途径的级联，最终导致分泌抗病毒、抗增殖、和免疫调节性基因产物的分泌。乙酸格拉默，一种合成分子，抑制髓磷脂碱性蛋白反应性T细胞的活化并诱导产生以抗炎作用为特征的T细胞库。一些目前上市的治疗 药，包括IV免疫球蛋白(GAMAGARD ，Baxter)，甲氨蝶呤((RHEUMATREX ，American Cyanamid),和硫唑嘌呤(IMURAN⑧，GlaxoSmithKline),已经作为与已获批准的治疗联用的复发性-弛张性多发性硬化治疗药接受了评估(Calabresi (2002)Neurology, Vol. 58: S10-S22)。考虑到 NMDA 受体拮抗剂美金刚(NAMENDA_ ，Merz)已经被证明可防止血脑屏障的破坏和恢复血脑屏障以及减少与EAE致病机制相关的体内症状(Paul and Bolton, 2002),本发明的肽二聚体可以单独地或者与其他NMDA受体拮抗剂联合，或者作为干扰素或乙酸格拉默的附加用于治疗人体中的MS。本发明涵盖通过对受试者施用至少一种如本文所述的ApoE肽二聚体来在有需要的受试者中治疗、预防或缓解类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎或多关节型幼年类风湿性关节炎的症状的方法。现有的关节炎治疗手段包括与肿瘤坏死因子结合的肽和蛋白质。依那西普(ENBREL ,Amgen)是一种二聚体融合蛋白，由人75kd肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分及与之连接的人IgGl Fe部分构成。阿达木单抗(HUMIRA ,Abbott)是一种重组人IgGl单克隆抗体。肿瘤坏死因子结合蛋白已经在延缓类风湿性关节炎和其他风湿性疾病的症状的进展和减轻其症状方面显示了优秀的结果。因此，本发明的肽二聚体可以单独地或者与其他药物联合用于治疗类风湿性疾病，包括例如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、多关节幼年型类风湿性关节炎、和银屑病关节炎。本发明的方法和ApoE肽二聚体还可用来治疗、预防或缓解与慢性神经疾病(包括但不限于阿尔茨海默病(AD)和HIV相关脑病)相关的神经体征和症状。本发明人发现ApoE肽二聚体特别强地遏制小胶质细胞活化，为本发明的肽二聚体提供了在任何涉及小胶质细胞活化的神经疾病的治疗中发挥作用的机会。例如，小胶质细胞在AD中表达活化标志物，暗示AD中的关键的炎症事件牵涉小胶质细胞。这样的活化的小胶质细胞在淀粉样斑块附近积聚(Griffin et al. (1995) J. Neuropath. Exp. Neurol.，Vol. 54:276)。小胶质细胞也在療痫中活化(Sheng et al. (1994) J. Neurochem, Vol. 63:1872) 已经证明淀粉样蛋白β肽的摄取和致病作用被NMDA受体拮抗剂所阻断(Bi etCN 102917727 A
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明
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al. , 2002) ο其他研究提示抗炎症药物可延迟AD的发病或进展(Breitner et al. (1995)Neurobiol. Aging, Vol. 16:523;Rogers et al. (1993)Neurology, Vol. 43:1609) 因此，本发明的肽ニ聚体可単独地或者与其他NMDA受体拮抗剂或其他已知的用于治疗AD的药物，尤其是抗炎药物联合在人体AD的治疗组合物或方法中使用。本发明包括通过对受试者施用有效量的本发明的ApoE肽ニ聚体来在有需要的受·试者中治疗、预防或缓解细菌性脓毒病的方法。已经证明，在体内脓毒症动物模型中，单体型ApoE受体结合肽可提供针对外周中(periphery) LPS诱导的细胞因子产生的保护。參见美国专利公开号2003/0077641 Al，兹通过提述并入其全部内容。因此，本发明的肽ニ聚体可以单独地或者与其他已知的抗炎性细胞因子和抗体联合用于治疗脓毒症的组合物和方法中。已知炎症过程介导动脉粥样硬化过程的ー个方面，參见例如Hansson (1994) BasicRes. Cardiol. , Vol. 89:41;Berliner et al. (1995)Circulation, Vol. 91:2488;Watanabeet al. (1997) Int. J. Cardiol.，Vol. 54:551。已知血管壁上的巨噬细胞局部地分泌ApoE (虽然个体中由巨噬细胞分泌的量与由肝脏产生的ApoE的量相比是微不足道的)。在经典的动脉粥样硬化模型中，ApoE发挥从血流中去除胆固醇并将它输送到巨噬细胞或肝脏的功能。但是已经清楚，血管壁处的巨噬细胞分泌的ApoE减少动脉粥样硬化斑块的形成，而不依赖于任何脂质代谢效应。例如，ApoE缺陷小鼠被普遍承认是高胆固醇血症和动脉粥样硬化疾病的模型。对这样的小鼠提供分泌ApoE的巨噬细胞可急剧降低动脉粥样硬化斑块的形成。Linton et al. (1995) Science, Vol. 267:1034。反过来，将野生型小鼠的巨噬细胞替换为ApoE缺陷的巨噬细胞可加速动脉粥样硬化性改变，尽管该动物的肝脏仍然产生ApoE。Fazio et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci.，Vol. 94:4647。在动脉粥样硬化中，有假说称ApoE通过某种受体介导的事件下调血管壁附近的巨噬细胞活化。这样的巨噬细胞活化下调阻断或干扰与动脉粥样硬化斑块形成相关的事件级联，从而减少或减慢动脉粥样硬化病灶的形成。已知与动脉粥样硬化相关的事件级联包括平滑肌细胞和内皮细胞増殖，以及泡沫细胞形成。有证据证明ApoE下调所有这些过程。因此ApoE影响体内的动脉粥样硬化的存在和进展，而不依赖于其对脂质的效果。动脉粥样硬化的进展可以通过测量动脉粥样硬化斑块的量或大小、或者被动脉粥样硬化病灶阻塞的血管的百分比，或这样的斑块的生长速率来加以评估。动脉粥样硬化是指动脉内膜的增厚和动脉粥样硬化斑块中脂质的累积。本发明提供通过施用一种或多种本发明的肽ニ聚体来在有需要的受试者中治疗动脉粥样硬化或减少动脉粥样硬化斑块的形成的方法。可以用本方面来治疗的状况包括冠状动脉、对CNS供血的动脉如颈动脉、外周循环或内脏血液循环动脉的动脉粥样硬化；以及肾动脉疾病。施用，例如胃肠外施用可以是部位特异性的，或者可以施用到全身血流中。在一些实施方案中，肽ニ聚体可以与额外的抗动脉粥样硬化药(包括HMG-CoA还原酶抑制剂，又称他汀类)联用。适用于本发明的方法的他汀类包括，例如，洛伐他汀(MEV ACOR , Merck)、辛伐他汀(ZOCOR , Merck)、普伐他汀(PRAVACHOL , BristolMyers Squibb)、罗苏伐他汀(CRESTOR , AstraZeneca)、氣伐他 」’(LESCOL , Novartis)和阿托伐他汀(LIPITOR , Warner-Lambert)。本发明还提供了通过施用有效量的至少ー种本发明的ApoE肽ニ聚体来在有需要
22的受试者中治疗、预防或缓解炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的症状的方法。在本发明的方法的实施中，治疗肽和/或其衍生物可以单独使用或者与其他活性成分联用。如果期望，可用一种或多种通常用于治疗炎性肠病的药剂来作为本发明的方法和组合物中的治疗肽的替代或者附加。这样的药剂包括生物药(例如inflixamab, adelimumab,和 CDP-870)，小分子免疫调节物(例如 VX 702、SCIO 469、doramapimod、RO 30201 195、SCI0323、DPC 333、pranalcasan、霉酚酸酯、和merim印odib)，非留类亲免疫因子依赖性免疫抑制剂(例如环孢霉素A，他克莫司，吡美莫司，和ISAtx247)，5-氨基水杨酸(例如美沙拉秦、柳氮磺吡啶、巴柳氮二钠、和奥柳氮钠)，DMARD (例如甲氨蝶呤和硫唑嘌呤)以及阿洛司琼。受益于本发明的组合物和方法的合适的受试者包括雄性和雌性哺乳动物受试者，包括人，非人灵长类，和非灵长类哺乳动物。受试者包括兽类(veterinary)(伴侣动物)受试者，以及家畜和外来物种(exotic species)。
下面的实施例用于例示本发明，不应解释为对本发明构成限制。
实施例实施例I. 二硫化物二聚体的形成增强ApoE肽的细胞毒活性我们先前已经显示，通过对apoE模拟性C0G133肽(LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ IDNO:3))添加蛋白转导域(PTD)，如触角足(触角足)肽，可增强其抗炎症活性。通过化学合成制备了一系列C0G133与PTD缀合的融合肽。值得注意的是，我们发现在BV2细胞中，在用 LPS 刺激之后，具有序列 RQIKIWFQNRRMKWKCLRVRLASHLRKLRKRLL (SEQ ID NO: I)的 COGl 12可有效地遏制NO, TNFa和IL-6的产生，IC50分别为2InM, 58nM,和12nM(图I)。这些结果展示了 C0G112的一个显著的安全窗，其中有效的抑制发生在12-58nM的浓度，而LD50高于其超过120倍，为7μΜ。在测试多种化合物针对CLL细胞的细胞毒性的过程中，我们发现C0G112具有220ηΜ的ED50。这些数据是使用批号313的C0G112肽产生的。当批号313C0G112肽的库存耗尽后，我们开始使用新合成的C0G112 (批号411)，发现ED50降低到I. 2 μ Μ。虽然这一批比仍然比缺少触角足PTD的apoE模拟C0G133更强，但比批号313的活性低。为了确定这两批C0G112之间任何可能的结构差异，我们利用正检测模式下的带电喷雾离子化的液相色谱/质谱(LC/MS)技术测定了来自这两个不同批次的C0G112。对于来自批号313的COGl 12，观察到了一个质荷比(M/Z)为1126. 3的主峰，以及M/Z=1800. 9、1286. 6、和1001. 5的峰(图2A中的红色箭头)。据分析，M/Z 1800. 9的峰来自一个带5个正电荷的二聚体化肽的质量+5质子形式(表示为[Μ+5ΗΓ/5)，1286.6的峰来自[Μ+7ΗΓ/7种类。实际上，该二聚体预期有 M/Z=1801. 3,1501. 2,1286. 9,1126. 2、100L 1,901. I 的峰，而单体肽预期有 Μ/Ζ=1501. 6、1126. 4,901. 3,751. 3、和 644. I 的峰。为了确证这一发现，我们用二巯苏糖醇处理来自批次313的COGl 12以将二硫化物还原成游离巯基，制备了还原型的C0G112，并重复了 LC/MS分析(图2Β)。在该还原型的肽中，观察至IJ Μ/Ζ=1501. O、1126. 4. 901. 3,751. 3和644. 2的峰，与单体肽预期的峰很好地吻合。通过在氧化性条件下搅拌单体并纯化二聚体(又称为C0G445，以区分C0G112的二聚体形式和单体形式)来强迫形成二硫化物，确认了二聚体是C0G112的活性形式。通过LC/MS 分析 C0G445 给出了 Μ/Ζ=1800· 5,1501. 3,1286. 6,1126. I、1001. O、和 901. 2 的 MS 峰(图2C)，其中1800. 5、1286. 6和1001. O处的峰是该肽的二聚体形式所独有的，从而确认了该化合物的二硫桥。确认了 C0G445的二聚体结构之后，我们接下来评估了该肽在BV2细胞测定中的NO释放并对其进行了 CLL细胞毒性细胞测定。在BV2测定中，我们确认了 NO释放的IC50为20nM, CLL细胞的细胞毒性的ED50为ΙΙΟηΜ。对于C0G445，重要的是先前的ED50值(例如220nM)是利用单体的分子量4502而不是二聚体的真实分子量9004来报道的。基于C0G445的真实分子量进行校正后，CLL细胞毒性的ED50值被降低到ΙΙΟηΜ。实施例2不可还原的COGl 12 二聚体肽活化PP2A并且对癌细胞具有细胞毒性在发现C0G112作为二硫化物连接的二聚体发挥活性之后，我们探寻了稳定化COGl 12的二聚体状态的方法。我们首先在稀溶液中用5倍摩尔过量的双马来酰亚胺乙烷(BMOE)处理还原型COG112肽。通过加入醚沉淀出肽，过滤收集肽，洗涤去除未反应的BMOE，·然后在真空下干燥。将BMOE连接的肽溶解在缓冲液中并与I. 5-2. O倍摩尔过量的新鲜还原的C0G112混合。通过HPLC检测交联情况直到反应完成，产生的肽-BMOE-接头-肽二聚体用醚沉淀，收集、洗涤、并通过反相HPLC纯化到98%的纯度。通过MS确认该肽的身份(称之为C0G449)，并对其进行BV2N0释放测定法测定。如图3所示，我们观察到使用C0G449从BV2小胶质细胞释放一氧化氮的IC50为9. 4nM，相比于C0G445 ( 二硫化物连接的COGl 12 二聚体)活性提高大约2倍。为了进一步评估C0G449的效果，我们测量了稳定的二聚体化C0G449化合物在32D:p210BCE/Abl慢性髓性白血病细胞中活化PP2A的能力。用C0G445或C0G449处理后，由于PP2A的活化，导致磷酸的释放相对于未处理的对照细胞增加(图4A)。然而，C0G449处理增加该速率(rate)的程度比C0G445更高，这提示有可能会发现C0G449及其他稳定的二聚体肽具有更高的CLL细胞杀灭强度。C0G449还显示比FTH720 ( —种先前证明可活化PP2A 的物质(Neviani et al. (2007) J Clin Invest, Vol. I 17:2408-2421))更强的 PP2A活化。32D:p210BGK/Abl慢性髓性白血病细胞不用化合物处理、用IyM C0G449处理，或者用5 μ M FTH720处理。我们观察到，用C0G449单独处理后，与未处理的对照相比，ΡΡ2Α的相对比活性(磷酸释放/分钟/单位蛋白)稳健地增加约45%，并且与FTY720相比有大约20%的活化(图4Β)。根据在含血清的培养基中ΡΡ2Α的活化以及在BV2测定中对NO的强力抑制，我们测定了 C0G445和C0G449针对源自患者的CLL细胞和正常B细胞的细胞毒性(图5)。从CLL患者收集血液，使用RosetteS印( )人B细胞富集鸡尾酒根据制造商的说明分离⑶5+/⑶19+CLL细胞，并用COG化合物进行处理。将化合物施加于B-CLL细胞(96孔板中，2. 5x10s个细胞/孔)，然后处理细胞72小时。处理期之后，利用MTS测定法(Pharmacia)评估活细胞以确定可有效杀死50%的输入CLL细胞的COG化合物的浓度(EC50)。和PP2A活化以及NO释放的数值一样，C0G449相比于C0G445显示了更高的效力，如下面的表I所列。C0G445和C0G449处理来自志愿者的正常B细胞的细胞毒性的EC50值要高出将近200倍(高于10 μ M)。为了更充分地了解COG肽的PTD域和apoE域在抗CLL细胞毒活性中所起的作用，我们利用具有HIV-TAT PTD的其他化合物(C0G226)以及具有改变的apoE序列的肽(C0G1410和C0G248)，如表I中所示。值得注意的是触角足(ANTP)或TAT PTD分别将COG1410的效カ从5. 7 μ M增加到I. O μ M和I. 4 μ Μ。此外有趣的是，与ANTP连接的C0G1410 (C0G120)与C0G112单体相比作为单体的效カ更高，COG 120和COG 112的EC50值分别为I. O μ M和I. 4 μ M0该结果提示，构建含有改变的apoE域以及ANTP或TAT PTD域的ニ聚体肽可能进ー步提高肽的效カ。这些数据表明，apoE模拟化合物针对新鲜分离的人B-CLL细胞显示强效和选择性的细胞毒活性，并具有宽的安全范围。 我们还评估了这些不同的肽抑制BV2小胶质细胞在LPS刺激下诱导的ー氧化氮产生的功效(作为抗炎活性的量度)，以及在大鼠中耐受的最大剂量(表I和图6A)。对于LPS測定，EC50是导致LPS刺激后BV2细胞的一氧化氮释放的50%抑制的化合物浓度。对于小鼠毒性，MTD是能够通过静脉注射给药而不导致24小时后死亡的最大化合物剂量。ApoE肽ニ聚体，特别地，在抗炎测定中显示出显著的效カ(图6A)。将ApoE域与蛋白转导域偶联进一步增强了ニ聚体的效力。接下来，我们考察了ー种ApoE肽ニ聚体与其单体形式对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的增殖的效力。MDA-MB-231细胞用不同浓度的C0G435(单体；SEQ ID NO: 90)或C0G493 (ΒΜ0Ε连接的COG 435 ニ聚体)肽处理48小吋。肽处理之后，利用MTT测定法定量细胞。结果如图6B所示，表明ApoE模拟肽的ニ聚体形式对乳腺癌细胞的细胞毒性显著高于单体形式。为了确定ApoE肽ニ聚体是否对其他类型的癌症具有细胞毒性，我们评价了三种不同的ApoE BMOE连接的肽ニ聚体(C0G449, C0G492, C0G493;见表I)对U87MG成胶质细胞瘤细胞的生长特征的影响。使用多种浓度的C0G449，C0G492, C0G493或索拉非尼来处理U87MG成胶质细胞瘤细胞，并使用MTT来定量活细胞。使用索拉非尼作为阳性对照，因为它已被报道对成胶质细胞瘤细胞有细胞毒性(Yang et al. (2010)Mol CancerTher. ,Vol. 9(4) :953-962)。图6C所示的剂量响应曲线显示每一种ニ聚体肽对U87MG细胞都有细胞毒性。这ー系列实验证明ApoE肽对三种不同类型的癌细胞具有细胞毒性。有趣的是，这些ApoE肽的ニ聚体形式诱导癌细胞的细胞毒作用的效カ大大强于単体形式。
权利要求
1.一种肽二聚体，其包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽，其中所述第一和第二 ApoE肽通过连接模块共价连接，并且其中所述第一和第二 ApoE肽含有源自ApoE蛋白的氨基酸133-149的序列。
2.权利要求I的肽二聚体，其中所述连接模块选自下组二硫桥、双马来酰亚胺、1，4- 二取代的三唑、和N，N- 二炔丙胺。
3.权利要求2的肽二聚体，其中所述双马来酰亚胺是双马来酰亚胺-乙烷或双马来酰亚胺_己烧。
4.权利要求I的肽二聚体，其中所述第一和第二ApoE肽是相同的。
5.权利要求4的肽二聚体，其中所述第一和第二ApoE肽是具有选自下组的序列的肽LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO:3),AS (Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ ID NO: 5), LRVRLAS(Aib)LKRLRK(硝基-Arg)LL(SEQ ID NO:4)，和 LRVRLAS(Aib)LRKLR(K-Ac)RLL(SEQ ID NO:35)。
6.权利要求I的肽二聚体，其中所述第一和第二ApoE肽是不同的。
7.权利要求I的肽二聚体，其中所述第一ApoE肽通过一个或多个第一连接残基与第一蛋白转导域缀合。
8.权利要求7的肽二聚体，其中所述第一蛋白转导域选自下组源自触角足的肽、TAT、SynBl、SynB3、SynB5、和聚精氨酸。
9.权利要求8的肽二聚体，其中所述第一蛋白转导域具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQID N0:8)、YGRKKRRQRRR(SEQ ID 勵9)、或歷1(。
10.权利要求7的肽二聚体，其中所述一个或多个第一连接残基是半胱氨酸、叠氮高丙氨酸、或炔丙基甘氨酸。
11.权利要求7的肽二聚体，其中所述第一和第二ApoE肽是具有选自下组的序列的肽LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO:3)，AS(Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ ID NO:5)，LRVRLAS(Aib)LKRLRK(硝基-Arg)LL(SEQ ID NO:4)，和 LRVRLAS(Aib)LRKLR(K-Ac)RLL(SEQ ID NO:35)。
12.权利要求7的肽二聚体，其中所述第二ApoE肽通过一个或多个第二连接残基与第二蛋白转导域缀合。
13.权利要求12的肽二聚体，其中所述第二蛋白转导域选自下组源自触角足的肽、TAT、SynBU SynB3, SynB5、和聚精氨酸。
14.权利要求13的肽二聚体，其中所述第二蛋白转导域具有序列RQIKIffFQNRRMKffKK(SEQ ID NO:8)，YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:9)，或 WKK。
15.权利要求12的肽二聚体，其中所述一个或多个第二连接残基是半胱氨酸、叠氮高丙氨酸、或炔丙基甘氨酸。
16.权利要求12的肽二聚体，其中所述第一和第二ApoE肽是具有选自下组的序列的肽LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO:3), AS (Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ IDNO: 5), LRVRLAS (Aib) LKRLRK(硝基-Arg) LL(SEQ ID NO:4),和 LRVRLAS (Aib) LRKLR(K-Ac)RLL(SEQ ID NO:35)。
17.一种药物组合物，包含有效量的权利要求I的肽二聚体以及可药用的担载体。
18.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括对受试者施用权利要求17的组合物。
19.权利要求18的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤或乳腺癌。
20.权利要求19的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
21.权利要求19的方法，其中所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
22.权利要求18的方法，其中所述组合物与第二癌症治疗组合施用。
23.权利要求22的方法，其中所述第二癌症治疗是索拉非尼或吉非替尼。
24.一种用于在有需要的受试者中降低神经胶质细胞活化、小胶质细胞活化、或神经元细胞死亡的方法，该方法包括对所述受试者施用权利要求17的组合物。
25.权利要求24的方法，其中所述小胶质细胞活化与CNS炎症、创伤性脑损伤、脑缺血或脑水肿相关。
26.权利要求24的方法，其中所述神经元细胞死亡与谷氨酸兴奋性中毒相关。
27.权利要求26的方法，其中所述受试者已经被诊断为患有山黧豆中毒、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病、帕金森氏病，或精神分裂症。
28.一种在有需要的受试者中治疗动脉硬化或减少动脉硬化性斑块形成的方法，该方法包括对受试者施用权利要求17的组合物。
29.一种用于在有需要的受试者中治疗、预防或缓解细菌性脓毒病的症状的方法，该方法包括对受试者施用权利要求17的组合物。
30.一种用于在有需要的受试者中治疗、预防或缓解多发性硬化的症状的方法，该方法包括对受试者施用权利要求17的组合物。
31.一种用于在有需要的受试者中治疗、预防或缓解类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、或多关节型幼年类风湿性关节炎的症状的方法，该方法包括对受试者施用权利要求17的组合物。
32.一种用于在有需要的受试者中治疗、预防或缓解炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、或溃疡性结肠炎的症状的方法，该方法包括对受试者施用权利要求17的组合物。
33.一种用于在有需要的受试者中治疗、预防或缓解阿尔茨海默病的症状的方法，该方法包括对受试者施用权利要求17的组合物。
34.一种肽二聚体，其包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和第二肽通过双马来酰亚胺-乙烷共价连接，且其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 15或SEQID N0:90。
35.一种预测或评价用于治疗癌症的治疗性介入的功效的方法，该方法包括 测量来自患者的生物样品中SET蛋白的表达水平；并 将测得的水平与SET蛋白在对照样品中的表达水平比较， 其中测得的SET蛋白的表达水平指示治疗性介入的治疗功效。
36.权利要求35的方法，其中所述治疗性介入是ApoE肽或肽二聚体。
37.权利要求36的方法，其中测得的相对于对照样品为至少2倍的SET表达水平指示ApoE肽或肽二聚体在所述患者中治疗癌症的治疗功效。
38.权利要求35的方法，其还包括对所述患者施用至少一种ApoE肽或肽二聚体。
39.权利要求35的方法，其中所述生物样品是来自实体瘤的肿瘤活检。
40.权利要求39的方法，其中所述实体瘤是乳腺癌或淋巴瘤。
41.权利要求35的方法，其中所述生物样品是外周血单核细胞。
42.权利要求41的方法，其中所述生物样品是⑶19+/⑶5+白血病细胞。
43.一种试剂盒，其包括用于测量生物样品中的SET蛋白表达的试剂，和关于测量SET蛋白表达以用于预测或评估ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗癌症的功效的说明。
全文摘要
本发明提供包含ApoE衍生的肽二聚体的新型药物组合物。特别地，本发明的ApoE肽二聚体包含至少两个ApoE模拟域，并且能够包含一个或多个蛋白转导域。还公开了通过施用本发明的药物组合物治疗多种状况，如癌症、炎症状况和神经变性疾病的方法。
文档编号A61K38/16GK102917727SQ201180012673
公开日2013年2月6日 申请日期2011年1月6日 优先权日2010年1月6日
发明者M.P.维特克, D.J.克里斯滕森 申请人:克格诺西有限公司