专利名称：脂肪酸-rgd-脂肪醇偶联物介导表阿霉素靶向脂质体制备及抗肿瘤活性评价的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶向释药载体，尤其涉及脂肪酸-RGD-脂肪醇介导靶向药物载体及其构建方法，本发明还涉及药物载体在制备靶向抗肿瘤药物脂质体中的应用，属于生物医药学领域。
背景技术：
许多恶性肿瘤的生长和转移均与整合素表达异常或分子结构改变相关。整合素是一跨膜蛋白大家族，由a、^两种亚基构成异二聚体。目前发现a约有18种，P约有8 种，至少有24种异二聚体的整合素形式。整合素在肿瘤的进展可能具有两重性I)肿瘤发生早期，整合素表达降低可致瘤细胞与基底膜或ECM成分的粘附作用减弱，从而有利于肿瘤在局部生长与扩散；2)瘤细胞进入血循环后，整合素表达增高有利于瘤细胞粘附于血管内皮，继而定位增殖。整合素在肿瘤细胞表面的表达高于正常细胞是公认的事实。
已知，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(Arg-Gly-Asp，RGD)是整合素特异识别序列片段，RGD三肽及修饰物通过与整合素特异结合，具有阻止肿瘤细胞定位增殖、抗肿瘤新生血管生成作用。
脂质体(liposome)是直径50 IOOOnm的球型脂质双层，磷脂膜的组成成分灵活，可以制成种类、大小、表面特征不同的多种类型，作为生物活性物质的有效运输载体。亲水性药物可以包容在脂质体的水核内，脂溶性药物可以嵌入磷脂双层间，中性药物可以通过调整脂质体内的PH值或通过添加反相离子与药物形成分子复合物而稳定地结合于脂质体内。
普通脂质体不具有靶向性。如在脂质体表面结合抗体、配体，利用肿瘤细胞与正常细胞表面表达的抗原受体的差异，通过抗原、抗体和受体、配体的特异性作用增加脂质体的主动靶向性，这样可以提高治疗指数。
抗肿瘤药物的主动靶向性制剂将是改进抗肿瘤药物制剂的新趋向。为了使载体系统具有特异靶向性，可将各种活性物质耦联到载体表面。借助这种特异性相互作用可将载有各种抗肿瘤药物的载体系统靶向到含有特异性受体的器官、组织或细胞；同时受体与配体结合可促进载体系统内药物释放到肿瘤细胞内。发明内容
本发明涉及一种作为锚点化合物的偶联化合物，其化学式如下=CH3(CH2) nC0-Arg-Gly-Asp-0CH2 (CH2)ltlCH3,其中，n = 4-16。
优选的偶联化合物，n = 6，8，10，12，14。
本发明还包括所述的作为锚点化合物的偶联化合物的方法，包括将 Arg-Gly-Asp与脂肪酸链进行缀合，再与十二醇进行缀合，即得。
本发明还涉及一种抗肿瘤药物靶向脂质体，含有所述的作为锚点化合物的偶联化合物。
进一步的，所述的抗肿瘤药物靶向脂质体，由以下各组分组成抗肿瘤药物，磷脂， 胆固醇和锚点化合物的偶联化合物。
进一步的，所述的抗肿瘤药物靶向脂质体，由以下组分制成，下述百分比均为质量百分比抗肿瘤药物2-8%，磷脂70-80%，胆固醇10-20%和权利要求I或2所述的作为锚点化合物的偶联化合物为3-10%。
进一步的，抗肿瘤药物为表阿霉素，阿霉素，吡喃阿霉素，紫杉醇，多西紫杉醇，柔红霉素阿克拉霉素、光辉霉素中的一种或多种。
进一步的，磷脂为卵磷脂，大豆磷脂，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种或多种。
本发明涉及一种制备上述抗肿瘤药物靶向脂质体的方法，包括将除抗肿瘤药物之外的其他各组分用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入150mmol L^1 (NH4)2SO4溶液，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取出透析内液置于茄瓶中；另精密称取抗肿瘤药物适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，混匀，于热水浴中放置，振摇，即得。
本发明涉及所述的具有两亲性的脂肪酸-RGD-脂肪醇缀合物在制备抗肿瘤靶向脂质体药物中的应用。
本发明涉及所述的靶向脂质体等各种药物载体在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明涉及以腹水瘤S180小鼠为模型，采用尾静脉给药的治疗方案评价所述的抗肿瘤靶向脂质体制剂的抗肿瘤活性，结果显示靶向脂质体比各对照组具有更优异的抗肿瘤活性。
本发明涉及以肝癌细胞H印G2为模型，采用MTT法评价所述的抗肿瘤靶向脂质体制剂的抗肿瘤活性，结果显示靶向脂质体比各对照组具有更优异的抗肿瘤活性。
以下为实验内容
本发明的抗肿瘤药物靶向脂质体对S180腹水瘤小鼠的治疗作用
取腹腔接种S■腹水瘤第八天的昆明种小鼠一只，脱颈椎处死，用75%酒精消毒后置于超净台内，用镊子夹起腹部中线偏右的皮肤并用小剪刀剪一小口至可见乳白色腹水流出。将吸管由开口处轻轻插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水加到装有约3ml灭菌生理盐水的15ml的离心管中，使体积增至约10ml。用吸管轻轻吹气，使腹水与生理盐水混匀。试管加盖，1000转/分离心5分钟。弃去上清液后，加9ml灭菌生理盐水，1000转/分离心5 分钟,弃去上清液。往试管底部的乳白色胶状物中加9ml灭菌生理盐水，用吸管吹均匀。取 IOOu I该悬浮液加至9. 9ml灭菌生理盐水中，混匀，加盖，放入冰中待用。取IOOiU上述瘤细胞稀释液置入Eppendoff小管中，加IOOy I台盼兰染液,混匀。取少许该混匀液加至计数板的计数池内，于显微镜下计算4个大格中被染上蓝色的存活瘤细胞的个数。将原液中的存活瘤细胞稀释成I. 5X IO7个/ml，用于接种。用2%碘酒棉球和75%酒精棉球在小鼠右侧腋下消毒，并注入0. 2ml瘤细胞液，缓缓抽出针头。按此方法给每批昆明种小鼠接种， 随机分组，放入动物室饲养。
药物配制本实验共设14组1.表阿霉素注射液组；2.表阿霉素脂质体(实施例2所制备)组；3.膜材中含有Ch3(CH2)10CO-GGD-O(CH2)11CH3的表阿霉素脂质体组(实施例3所制备)组；4.膜材中含有Ch3(Ch2)6CO-RGDO(Ch2)11Ch3的表阿霉素脂质体组(实施例4所制备)组；5.膜材中含有Ch3(Ch2)8CO-RGDO(Ch2)11Ch3的表阿霉素脂质体组(实施例5所制备)组；6.膜材中含有Ch3(Ch2)10CO-RGDO(Ch2)11Ch3的表阿霉素脂质体组(实施例6所制备)组；7.膜材中含有CH3(CH2)12C0-RGD0(CH2)nCH3的表阿霉素脂质体组(实施例7所制备)组；8.膜材中含有Ch3(Ch2)14CO-RGDO(Ch2)11Ch3的表阿霉素脂质体组(实施例8所制备)组9.膜材中含有小量CH3(CH2)1QC0-RGD0(CH2)nCH3的表阿霉素脂质体组； 10.膜材中含有Ch3(Ch2)iciCO-RGDO(Ch2)11Ch3的大剂量表阿霉素脂质体组；11.膜材中含有 Ch3(Ch2)10CO-RGDO(Ch2)11Ch3 的小剂量表阿霉素脂质体组；12. Ch3(Ch2)10CO-RGDO(Ch2)11Ch3 脂质体组(实施例6所制备)组；13.空白脂质体组；14.生理盐水溶液组。
药物注射液制备精密称取药物，加入0.9%氯化钠注射液溶解即得。阳性对照是表阿霉素的脂质体，阴性对照为空白脂质体。各组药物除第10，11组(膜材中含有 CH3(CH2) 10CO-RGDO (CH2) nCH3的大剂量与小剂量表阿霉素脂质体组)以0. 3mg/mL与0. Img/ ml夕卜,其余均为0. 25mg/mL配制,脂质体制备方法采用硫酸铵梯度法。
实验方法将右侧腋下接种有腹水瘤的小鼠随机分组，每组10只，共14组。各组小鼠正常饲养，从接种后24小时开始给药，每隔2天一次，共4次。每次尾静脉注射上述药物0.2ml。9天后将各组腹水瘤小鼠处死，解剖，取瘤。并称瘤重，按抑瘤率=[(阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]X 100%计算抑瘤率。获得的数据以(X 土SDg)表示，并做t检验。结果见表I。
由表I可见，含有RGD肽偶联物的表阿霉素脂质体有优越的抗肿瘤活性；通过统计学分析可看出其中4，5，6，7，8，9，10组抗肿瘤作用均高于表阿霉素脂质体组；2，3，4，5，6， 7,8,9,10组抗肿瘤作用均高于表阿霉素注射液组；4，5，6，7，8，9，10组抗肿瘤作用均高于含有对照化合物CH3 (CH2) 10CO-GGDO (CH2) nCH3的表阿霉素脂质体组。
表I表阿霉素靶向制剂对腹水瘤S180小鼠的作用(n = 10)
药剤瘤重(X土SDg)抑瘤率I.表阿霉素注射液组1.056士 0.29618.54%2.表阿霉素脂质体组0.769士 0.231*40.83%3.含有CH3(CH2)ioCO-GGDO(CH2)nCH3的表阿霉素脂质组0.767士 0.219*41.82%4.含有CH3(CH2)6CO-RGDO(CH2)nCH3的表阿霉素脂质体组0.522士0.146*，#，&59.72%5.含有CH3(CH2)8CO-RGDO(CH2)nCH3的表阿霉素脂质体组0.469士0.225*，#，&63.83%6.含有CH3(CH2)10CO-RGDO(CH2)nCH3的表阿霉素脂质体组0.426士0.121*，#，&67.88%7.含有CH3(CH2)12CO-RGDO(CH2)nCH3的表阿霉素脂质体组0.399±0.090*, #，&69.18%8.含有CH3(CH2)14CO-RGDO(CH2)nCH3的表阿霉素脂质体组0.316士0.351*，#，&75.61%9.含有小量CH3(CH2)10CO-RGDO(CH2)nCH3的表阿霉素脂质0.539士0.193*，#，&58.42%体组10.含有CH3(CH2)10CO-RGDO(CH2)nCH3的大剂量表阿霉素脂0.375士0.086*，#，&71.04%质体组11.含有CH3(CH2)10CO-RGDO(CH2)nCH3的小剂量表阿霉素脂0.692士 0.22246.62%质体组12. RGD脂质体组0.999士 0.26022.92%13.空白脂质体组1.201 士 0.13214.生理盐水溶液1.296士 0.261
#对比于表阿霉素注射液有显著意义(P < 0. 01) 对比于表阿霉素注射液有意义(P < 0. 05) ;*对比于表阿霉素脂质体组有显著意义(P < 0. 01) ;&对比于含有对照化合物Ch3(Ch2)iciCO-GGDO(Ch2)11Ch3的表阿霉素脂质体组有显著意义(P < 0. 01)。
本发明的抗肿瘤药物靶向脂质体对肝癌细胞株HepG2的抑制作用
细胞培养
人肝癌细胞株H印G2用含10%灭活的胎牛血清，青霉素浓度最终为100U/ml，硫酸链霉素的最终浓度为100ug/ml的DMEM培养液培养，置37°C 5% C02恒温培养箱中，每天换新培养液，每2-3天传代一次。
药物配制
实验组参照实施例4制备含CH3 (CH2) 6C0_RGD0 (CH2) nCH3的抗肿瘤药物靶向脂质体。药物浓度分别为 I. 2、0. 6、0. 3、0. 15、0. 075ug/ml。
对照组参照实施例2制备抗肿瘤药物普通脂质体。药物浓度分别为I. 2,0. 6、 0.3、0.15、0. 075ug/ml。
阴性对照组用含10%胎牛血清培养的H印G2细胞，不加药
空白组含10%胎牛血清的培养液。
实验方法将对数生长期的HepG2细胞用胰蛋白酶消化后，培养液稀释，制成 3 X 104/ml细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔IOOiU。实验设不同浓度实验组、对照组、 阴性对照组及空白对照组。接种后培养24小时，分别加入以上各组5个浓度10ul，每个浓度重复5孔，37°C 5% C02培养48h，每孔加MTT lmg/ml 100 u I 37°C培养箱中培养4h。将 96孔板弃去上液，每孔加二甲亚砜150 ii I，振荡器振摇lOmin，使充分溶解，自动酶标仪测定光密度OD值(测量波长570nm，参比波长630nm)。IfepG2细胞存活率％=[(抗癌药物组 OD值-空白对照组OD值)/ (阴性对照组OD值-空白对照组OD值)]X 100%，计算半数抑制浓度(IC5tl)见表2实验结果表明抗肿瘤药物靶向脂质体组比普通脂质体组有更好的抗肿瘤活性。表2表阿霉素制剂对IfepG2细胞的抑制作用
制剤组半数抑制浓度(ug/ml)
表阿霉素普通脂质体组0.471 ±0.013
含有 CH3(CH2)ioCO-GGDO(CH2)nCH3 的表0.453 士0.033
阿霉素非靶向脂质体组
含有 CH3(CH2)6CO-RGDO(CH2)nCH3 的表0.377±0.011*#
阿霉素靶向脂质体组_*对比于表阿霉素普通脂质体组有显著意义(P < 0. 05)#对比于表阿霉素非靶向脂质体组有显著意义(ρ < 0. 05)
具体实施例方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例ICH3 (CH2) 10CO-Arg-Gly-Asp-OCH2 (CH2) 10CH3 的制备1) Boc-Arg (N02)-Gly-OBzl 的制备将1. 59g (5mmol) Boc-Arg (N02) -OH, 0. 68g (5mmol) N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于无水THF中。冰浴下再滴入1. 34g(5. 75mmol) 二环己基羰二亚胺(DCC)的无水THF溶液， 冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把1. 69g(5. OmmoDTosOH · Gly-OBzl悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7_8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液⑴滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌lh，再室温搅拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10 1)显示Boc-Arg (N02) -OH消失，停止反应。滤除二环己基脲(D⑶)，滤液吹去DMF。 残留物用150ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5% NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、 5% KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到2. 09g(90% )标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)467. 8[M+1]+， 489. 8 [M+23] +，955. 4 [2M+23] +。2) HCl · Arg (N02)-Gly-OBzl 的制备将2. 09g(4. 5mmol)Boc-Arg(N02) -Gly-OBzl 溶解在 5ml 4mol/l 氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯， 残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成 1.52g(92. 5%)标题化合物，为白色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)367.4[M+l]+， 389. 4[M+23]+，733. 8[2M+1] +3) CH3 (CH2) 10CO-Arg (N02) -Gly-OBzl 的制备按照Boc-Arg (N02) -Gly-OBzl 的制备方法，由 1. OOg (5讓ol) CH3 (CH2) 10COOH 禾口 2. 38g(6. 5mmol)HCl 'Arg(N02)-Gly-OBzl 制得 2. 41g(88. 12% )标题化合物，为白色固体。 ESI-MS (m/z)M9. 7[M+1]+，571. 7[M+23]+。 4) CH3 (CH2) 10CO-Arg (N02) -Gly-OH 的制备
将1. 81g(3. 3mmol)CH3(CH2) 10CO-Arg(N02)-Gly-OBzl 溶于 15ml 甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOHON)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10 1)显示 CH3 (CH2) 10CO-Arg (N02) -Gly-OBzl消失。反应混合物用饱合KHSO4水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱合KHSOyK溶液调pH至2，用乙酸乙酯萃取(50mlX3)。合并的乙酸乙酯相用饱和NaCl水溶液洗3次，无水Na2SO4干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得
1.466g(97. 6% )标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)457. 7[Μ-1Γ。5) Boc-Asp (OBzl) -OCH2 (CH2) 10CH3 的制备按照Boc-Arg (N02)-Gly-OBzl 的制备方法，由 0. 93g (5mmol) CH3 (CH2)11OH 禾口
2.423(7. 5mmol)Boc-Asp (OBzl)-OH 制得 2. 078g(84. 8% )标题化合物，为白色固体。ESI-MS (m/z)492. 7[M+1]+,514. 4[M+23]+, 1005. 5 [2M+23] +。6) HCl · Asp (OBzl) -OCH2 (CH2) 10CH3 的制备将2· 04 (4. 15mmol) Boc-Asp (OBzl) -OCH2 (CH2) 10CH3 溶解在 5ml 4mol/l 氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成1.51g(93.5% )标题化合物，为白色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/ z)392. 7[Μ+1]+，783. 1[2M+1] +。7) CH3 (CH2) 10CO_Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -OCH2 (CH2) 10CH3 的制备按M Boc-Arg (N02)-Gly-OBzl 的制备方法，1. 51g (3. 85mmol) HCl · Asp (OBzl)-OCH2 (CH2)10CH3 和 1. 465g(3. 2mmol) CH3 (CH2) 10CO-Arg (N02) -Gly-OH 制得 2. 39g(90. 2% )标题化合物，为白色固体。[α ]d20 = -9. 73 (c = 1. 0，MeOH) ；ESI-MS (m/ ζ) 832. 4 [M+l] +，855. O [Μ+23] +。8) CH3 (CH2) 10CO-Arg-Gly-Asp-OCH2 (CH2) 10CH3 的制备将0. 831g (Immol) CH3 (CH2) 10CO_Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) OCH2 (CH2) 10CH3 置于250ml茄形瓶中、用乙醇溶解、加200mgPd/C Q5 % )、通H2 (0. 02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得 0.6^g(90% )标题化合物，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z) :695·9[Μ_ Γ。(注CH3(CH2) nC0-Arg-Gly-Asp-0CH2 (CH2) IOCH3, η = 6,8,12,14 偶联物的具体制备参照 CH3 (CH2) 10CO-Arg -Gly-Asp-OCH2(CH2)10CH3 的制备方法。)实施例2.表阿霉素脂质体O)的制备采用硫酸铵梯度法制备。取适量磷脂和胆固醇至圆底烧瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将150mmol (NH4)2SO4溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取出透析内液置于茄瓶中；另精密称取表阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，于热水浴中放置，并不时振摇。从热水浴中取出后，即得表阿霉素脂质体。粒径 150 250nm，Zeta-Potential-20 _40mV。实施例3.膜材中含CH3 (CH2) 10CO-GGD-OCH2 (CH2) 10CH3的表阿霉素脂质体(3)的制备各组分的用量表阿霉素2-8 % ；天然卵磷脂，胆固醇和 CH3 (CH2) 10CO-GGD-OCH2 (CH2) 10CH3 的混合物 90-97 %，该混合物中，天然卵磷脂 70-80 % (质量百分比)，胆固醇10-20% (质量百分比)和化合物CH3 (CH2) 10CO-GGD-OCH2 (CH2) 10CH33-10% (质量百分比)。取磷脂，胆固醇和CH3 (CH2) 10CO-GGD-OCH2 (CH2) 10CH3至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将150mmol ·L—1 (NH4)2S04溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取出透析内液置茄瓶中；另精密称取表阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，置于热水浴中，并不时振摇。从热水浴中取出后，即得含CH3 (CH2) 10CO-GGD-OCH2 (CH2) 10CH3 的表阿霉素脂质体。粒径 150 250nm，Zeta-Potential-20 _40mV。实施例4.膜材中含CH3 (CH2)6C0-RGD_0CH2 (CH2) 10CH3的表阿霉素脂质体⑷的制备各组分的用量表阿霉素2-8 % ；天然卵磷脂，胆固醇和 CH3 (CH2)6C0RGD-0CH2 (CH2) 10CH3的混合物90-97%，该混合物中，天然卵磷脂70-80% (质量百分比)，胆固醇10-20% (质量百分比)和整合素受体靶向锚点化合物3-10% (质量百分比)。参照实施例2的制备方法，取磷脂，胆固醇和CH3 (CH2) 6C0RGD-0CH2 (CH2) 10CH3 至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将 150mmol (NH4)2SO4溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取出透析内液置茄瓶中；另精密称取表阿霉素适量， 溶于少量蒸馏水中，将此溶液与空白脂质体混悬液混合，于热水浴中放置，不时振摇。取出， 即得含CH3 (CH2) 6C0RGD-0CH2 (CH2) 10CH3表阿霉素脂质体。粒径 150 250nm，Zeta-Potential-20 _40mV。实施例5.膜材中含CH3 (CH2)8C0-RGD_0CH2 (CH2) 10CH3的表阿霉素脂质体(5)的制备各组分的用量表阿霉素2-8 % ；天然卵磷脂，胆固醇和 CH3 (CH2)8C0RGD-0CH2 (CH2) 10CH3的混合物90-97%，该混合物中，天然卵磷脂70-80% (质量百分比)，胆固醇10-20% (质量百分比)和整合素受体靶向锚点化合物3-10% (质量百分比)。照实施例2的制备方法，取磷脂，胆固醇和CH3 (CH2) 8C0RGD_0CH2 (CH2) 10CH3 至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将 150mmol ^r1(NH4)2SO4溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取出透析内液置茄瓶中；另精密称取表阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，于热水浴中放置，不时振摇。取出即得含 CH3 (CH2) 8C0RGD-0CH2 (CH2) 10CH3 的表阿霉素脂质体。粒径 150 250nm，Zeta-Potential-20 _40mV。实施例6.膜材中含CH3 (CH2) 10CO-RGD-OCH2 (CH2) 10CH3的表阿霉素脂质体(6)的制备各组分的用量表阿霉素2-8 % ；天然卵磷脂，胆固醇和 CH3 (CH2) 10CORGD-OCH2 (CH2) 10CH3的混合物90-97%，该混合物中，天然卵磷脂70-80% (质量百分比)，胆固醇10-20% (质量百分比)和整合素受体靶向锚点化合物3-10% (质量百分比)。照实施例2的制备方法，取磷脂，胆固醇和CH3 (CH2) 10CORGD-OCH2 (CH2) 10CH3 至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将 150mmol ^r1(NH4)2SO4溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取出透析内液置于茄瓶中；另精密称取表阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，于热水浴中放置，不时振摇。即得含CH3 (CH2) 10CORGD-OCH2 (CH2) 10CH3 的表阿霉素脂质体。 粒径 150 250nm，Zeta-Potential-20 _40mV。实施例 7. CH3 (CH2) 12C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH3 脂质体(7)的制备各组分的用量表阿霉素2-8 % ；天然卵磷脂，胆固醇和 CH3 (CH2) 12C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH3 的混合物 90-97 %，该混合物中，天然卵磷脂 70-80 % (质量百分比)，胆固醇10-20% (质量百分比)和化合物CH3 (CH2) 12C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH33-10 % (质量百分比)。取磷脂，胆固醇和CH3 (CH2) 12C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH3至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将150mmol ·L—1 (NH4)2S04溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取出透析内液置茄瓶中；另精密称取表阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，置于热水浴中，并不时振摇。从热水浴中取出后，即得含CH3 (CH2) 12C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH3 的表阿霉素脂质体。粒径 150 250nm，Zeta-Potential-20 _40mV。实施例8. CH3 (CH2) 14C0-RGD_0CH2 (CH2) 10CH3 脂质体(8)的制备各组分的用量表阿霉素2-8 % ；天然卵磷脂，胆固醇和 CH3 (CH2) 14C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH3 的混合物 90-97 %，该混合物中，天然卵磷脂 70-80 % (质量百分比)，胆固醇10-20% (质量百分比)和化合物CH3 (CH2) 14C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH33-10 % (质量百分比)。取磷脂，胆固醇和CH3 (CH2) 14C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH3至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将150mmol ·L—1 (NH4)2S04溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取出透析内液置茄瓶中；另精密称取表阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，置于热水浴中，并不时振摇。从热水浴中取出后，即得含CH3 (CH2) 14C0-RGD-0CH2 (CH2) 10CH3 的表阿霉素脂质体。粒径 150 250nm，Zeta-Potential-20 _40mV。
权利要求
1.一种作为锚点化合物的脂肪酸-RGD-脂肪醇偶联化合物，其结构式如下CH3(CH2)n CO-Arg-Gly-Asp-OCH2 (CH2)ltlCH3,其中，n = 4-16。
2.权利要求I所述的偶联化合物，其特征在于，其中，n= 6，8，10，12，14。
3.一种制备权利要求1-2任一项所述的偶联化合物的方法，包括将Arg-Gly-Asp与脂肪酸链进行缀合，再与十二醇进行缀合，即得。
4.一种抗肿瘤药物靶向脂质体，其特征在于含有权利要求I或2所述的偶联化合物。
5.权利要求4所述的抗肿瘤药物靶向脂质体，其特征在于，由以下组分制成抗肿瘤药物，磷脂，胆固醇和权利要求I或2所述的偶联化合物。
6.权利要求5所述的抗肿瘤药物靶向脂质体，其特征在于，各组分质量百分比为抗肿瘤药物2-8%，磷脂70-80%，胆固醇10-20%，权利要求I或2所述的偶联化合物3-10%。
7.权利要求6所述的抗肿瘤药物靶向脂质体，其特征在于，所述的抗肿瘤药物选自 表阿霉素，阿霉素，吡喃阿霉素，紫杉醇，多西紫杉醇，柔红霉素阿克拉霉素、光辉霉素中的一种或多种。
8.权利要求7所述的抗肿瘤药物靶向脂质体，其特征在于，所述的磷脂选自卵磷脂， 大豆磷脂，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种或多种。
9.一种制备权利要求4-8任一项所述抗肿瘤药物靶向脂质体的方法，包括以下步骤将除抗肿瘤药物之外的其他各组分用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入 150mmol L—1 (NH4)2S04溶液，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析4-5次，每次透析约10h，取透析内液置于茄瓶中；另精密称取抗肿瘤药物适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，混匀，于热水浴中放置，振摇，即得。
10.权利要求1-2任一项所述的偶联化合物在制备抗肿瘤靶向脂质体药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了脂肪酸-RGD-脂肪醇偶联物介导表阿霉素靶向脂质体制备及抗肿瘤活性评价，本发明的偶联物，其结构式如下CH3(CH2)nCO-Arg-Gly-Asp-OCH2(CH2)10CH3，其中，n＝4-16，本发明将抗肿瘤药物引入到该偶联物中得到抗肿瘤靶向脂质体药物，该脂质体可以增加抗肿瘤药物在靶部位的浓度并可减少其在非靶部位的毒副作用，提高药物的治疗指数。
文档编号A61K47/42GK102532262SQ20121005443
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者吴曼, 崔国辉, 崔纯莹 申请人:首都医科大学