一种碳纳米管复合基因载体系统及其制备方法
【专利摘要】本发明构建了一种碳纳米管复合基因载体系统，并研究了其有效性、生物相容性、细胞毒性及转染效率等。本发明在碳纳米管管壁上通过疏水作用结合聚乙烯亚胺-胆固醇（PEI-Chol）与聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG），获得了碳纳米管复合基因载体系统，具体方法如下：（1）以三乙胺为脱水剂，在无水低温条件下，利用聚乙烯亚胺以及胆固醇甲酰氯合成聚乙烯亚胺-胆固醇；（2）通过超声分散法，利用聚乙烯亚胺-胆固醇以及聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺获得水溶性的阳离子碳纳米管复合系统。本发明所得的碳纳米管复合系统能够24h稳定均匀分散于磷酸盐溶液（pH=7.4）、细胞培养基和血清中；毒性低；有效结合并浓缩DNA分子；转染率高。
【专利说明】一种碳纳米管复合基因载体系统及其制备方法
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种碳纳米管复合基因载体系统及其制备方法。
(二)【背景技术】
[0002]基因治疗在先天性及后天性疾病的治疗或预防中，为一项有前景的治疗手段。目前，大部分基因的体内传递方式是靠病毒性载体或非病毒性载体。病毒性载体转染效率虽高，却存在一些缺陷，包括引起人体的炎症及免疫反应。非病毒性载体包括聚阳离子脂质体、阳离子聚合物、纳米粒子。虽然非病毒性载体的免疫原性较弱，但抵达和穿越核膜的能力也弱。因此，寻找一个低毒性、低免疫原性、高穿胞膜能力的基因载体，势在必行。
[0003]碳纳米管分为单壁碳纳米管(SWNTs)和多壁碳纳米管(MWNTs)。自1993年Ijima发现单壁碳纳米管以来，单壁碳纳米管(SWNTs)因其新颖独特的结构、机械、电子特性在多种领域得到关注和应用。碳纳米能任意弯曲，且修饰过的碳纳米管能与细胞膜表面进行多点结合；比表面积大，侧壁能有效携载多个分子进入细胞，且几乎无毒性。碳纳米管在700~IlOOnm处的近红外吸收的光学特性，使其应用于光热治疗或基因、化疗、影像等多学科的综合治疗。且经过合适修饰后的碳纳米管能以“分子针”的形式穿过胞核，且能到达细胞核，是一个具有良好前景的基因载体。
[0004]然而，碳纳米管几乎不溶于所有溶剂，且碳纳米管含有催化剂和无定形碳，具有生物不溶性。以上两点限制了其作为药物载体在医药领域的应用。目前，已有较多关于修饰碳纳米管以获得良好溶解性及应用价值的研究报道，包括共价修饰方法以及非共价修饰。共价修饰通过对碳纳米管头端以及侧壁的化学反应使其接上亲水基团；共价修饰虽能极大增加碳纳米管的溶解度，但却会破坏碳纳米管的结构。而非共价修饰的方法能避免以上缺点。为此，本发明着力于寻找非共价修饰碳纳米管，力图设计出一种高水溶性、低毒性、高稳定性及生物相容性、高转染效率的基因载体系统。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明的目的是构建一种通过非共价修饰的手段获得阳离子的碳纳米管复合系统，此方法简单、易行和高效，且极大增溶了碳纳米管，并获得了高生物相容性、低毒性、高转染效率的基因载体。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]—种碳纳米管复合基因载体系统，由碳纳米管(包括单壁碳纳米管和多壁碳纳米管)管壁上通过疏水作用结合聚乙烯亚胺-胆固醇共聚物(PE1-Chol)和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)得到，具体由如下方法制得:称取质量之比为1:10~50:1~2的碳纳米管、聚乙烯亚胺-胆固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入适量去离子水，300~60 0w功率超声波清洗20~60min，得到碳纳米管分散液；将碳纳米管分散液10000~13000rpm转速离心取上清液，重复离心，收集上清液于IOOkDa的离心过滤器中，4000rpm离心30~40min，取膜上浓缩液，用去离子水定容，即得所述碳纳米管复合基因载体系统的溶液。
[0008]所述聚乙烯亚胺-胆固醇共聚物(PE1-Chol)具体可由如下方法制得:称取聚乙烯亚胺，加入适量无水二氯甲烷(用分子筛脱水)和三乙胺的混合溶液，冰浴搅拌混合均匀得到PEI溶液；称取酰氯胆固醇溶于冰无水二氯甲烷中，将此溶液缓慢滴加到上述PEI溶液中，30min内滴加完毕；混合物在冰浴条件下继续搅拌反应12h。反应后的溶液转移至茄形瓶中，旋转蒸发出去溶剂，所得的产物经真空干燥后，加入HCl (0.1M)溶液溶解，并用二氯甲烷萃取数次，以除去未反应的酰氯胆固醇；萃取后的水溶液经过冷冻干燥后得到白色粉末，即PE1-ChoL。所述的聚乙烯亚胺的分子量为0.6kDa~25kDa，优选为0.6KDa~IOKDa ;聚乙烯亚胺与酰氯胆固醇的投料质量之比为1000:20~2000，所述DSPE-PEG优选为 DSPE-PEG2(I(I(I。所述的聚乙烯亚胺为 PEI600，PEI1800，PEI10000 或 PEI25000 时，与胆固醇甲酰氯的质量之比分别为1000:1000~2000，1000:330~660,1000:60~120，或1000:24 ~48。
[0009]本发明还涉及一种制备所述碳纳米管复合基因载体系统的方法，所述方法如下:称取质量之比为1:10~50:1~2的碳纳米管、聚乙烯亚胺-胆固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入适量去离子水，300~600w功率超声波清洗20~60min，得到碳纳米管分散液；将碳纳米管分散液10000~13000rpm转速离心取上清液，重复离心，收集上清液于IOOkDa的离心过滤器中，4000rpm离心30~40min，取膜上浓缩液，用去离子水定容，即得所述碳纳米管复合基因载体系统的溶液。
[0010]本发明的有益效果主要体现在:本发明用非共价方法修饰碳纳米管，不破坏碳纳米管的结构，工艺温和，操作简单易控制。且以非共价修饰的方法构建阳离子碳纳米管是首次提出，此方法可充分利用碳纳米管极大的比表面积，可弹性调节PE1-Chol的投料量，从而获得不同的转染效率。本发明得到的碳纳米管复合基因载体系统能够在磷酸盐缓冲液、细胞培养基以及血清中稳定分散，不易聚集或沉降；生物相容性好，毒性低；能够浓缩并保护质粒DNA，成功转染L929细胞及HEK293细胞；携载siRNA，结合激光治疗还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤效果。
(四)【专利附图】
【附图说明】`
[0011]图1是实施例1所制备的PE1-Chol的合成过程，以PEI1800为例。
[0012]图2是实施例1所制备的四种PE1-Chol的傅立叶红外光谱图谱、核磁共振图谱。其中，A 为胆固醇甲酰氯、B 为 PEI600-Chol、C 为 PEI1800_Chol、D 为 PEI1000O-Chol、E 为PEI25000-Chol。
[0013]图3是实施例1所制备的四种PE1-Chol的核磁共振图谱。其中，A为PE1-Chol结构图，将氢信号编号。B 为 PEI600-Chol、C 为 PEI1800_Chol、D 为 PEI 10000-Chol、E 为PEI25000-Chol。
[0014]图4是实施例1制备的PE1-Chol的缓冲能力的测定结果图。
[0015]图5是实施例2所制备的碳纳米管复合系统分散液的透射电镜图，以PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs为例。A图为未修饰的原始碳纳米管(Hipco SffNTs), B图为PEI1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs，C图为四种含不同分子量PE1-Chol的碳纳米管超声后的图片。[0016]图6是碳纳米管复合系统用不同介质中放置24h后的图，以PEI1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs为例。不同介质从左至右，依次为水、磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)、含10%胎牛血清的DMEM高糖细胞培养基、100%的小牛血清。其中，A图为PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SffNTS, B 图为 PEI1800-Chol/SWNTs。
[0017]图7是碳纳米管复合系统的24h细胞毒性实验结果。
[0018]图8是碳纳米管复合系统的体外转染试验结果图，以PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SffNTs为例。
[0019]图9是碳纳米管复合系统的24h细胞内定位试验的CLSM结果图，以PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs 为例。
[0020]图10是碳纳米管复合系统与cy3_DNA形成核酸载体复合物后，通过尾静脉注射24h的活体成像图。A图为碳纳米管/核酸组，B图为裸cy3-DNA组。
(五)【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0022]实施例1:聚乙烯亚胺-胆固醇的合成
[0023]分别称取不同分子量的分枝状聚乙烯亚胺(0.6kDa, 1.8kDa, IOkDa, 25kDa)各lg,置于50mL的圆底烧瓶中，加入IOmL无水二氯甲烷(用分子筛脱水)和IOOuL三乙胺的混合溶液，冰浴搅拌30m in得到PEI溶液；称取酰氯胆固醇分别为1000、330、60、24mg，溶于5mL冰无水二氯甲烷中，将此溶液缓慢滴加到上述PEI溶液中，30min内滴加完毕；混合物在冰浴条件下继续搅拌反应12h。反应后的溶液转移至茄形瓶中，旋转蒸发除去溶剂。所得的产物经真空干燥后，加入50mL HCl (0.1M)溶解，并用IOOmL 二氯甲烷萃取3次，以除去未反应的酰氯胆固醇；萃取后的水溶液经过冷冻干燥后得到白色粉末，即PE1-Chol，-20°C储存。其合成过程以PEI1800为例，参见见图1。
[0024]PEI600，1800，10000，25000Da 与胆固醇甲酰氯的反应率分别为 87.5%,92.8%,
89.1%, 93.2%。
[0025]实施例2:碳纳米管复合系统的制备
[0026]分别称取Img单壁碳纳米管(timesnano)或Img多壁碳纳米管(南京先丰纳米材料科技有限公司)、10~50mg实施例1中制备的PE1-Chol (用量分别为:PEI600-Chol50mg，PEI1800-Chol30mg, PEI10000_Chol20mg，PEI25000_Choll0mg)以及 2mg DSPE-PEG2000 (西安瑞禧生物科技有限公司)于50mL的圆底烧瓶中，再加入5mL的去离子水蒸馏水，在功率为300~600w的超声波清洗其中超声30min以上。取碳纳米管分散液，10000~13000rpm转速离心30min后取上清，弃碳纳米管聚集体，离心取上清，重复离心3次，收集上清于IOOkDa的离心过滤器(Millipore)中，离心洗漆,离心转速为4000rpm, 30min以上,弃去游离的聚合物分子，转移膜上浓缩液，用去离子水定容至5mL，分别得到四种PE1-Chol/DSPE-PEG/SffNTs 和四种 PE1-Chol/DSPE-PEG/MWNTs 的溶液。
[0027]实施例3:聚乙烯亚胺-胆固醇的表征
[0028]取实施例1所得的PE1-Chol，分别用IR、1H_NMR表征其官能团与化学结构；利用盐酸进行电位滴定，测定其缓冲能力。IR结果如图2所示，3300 - 3500(3!^1附近的-NH吸收峰为PE1-Chol的-NH2的伸缩振动峰:29000^1峰代表亚甲基C-H伸缩振动，表明聚合物PEI中存在有-NH-和CH2-;图2A中的1776(^1是C=O键的吸收峰，因为胆固醇甲酰氯中氯原子的吸电子诱导效应，使羰基吸收峰的位置向高频方向移动；图2B-E中的羰基吸收峰为1650CHT1处，这表明胆固醇甲酰氯中的C=O中的-Cl被PEI中的氨基取代而形成酰胺键，吸收峰发生向低频区迁移。IH-NMR (500MHz, D2O)结果如图3所示，A~D依次是 PEI600-Chol、PEI 1800-Chol、PEI 10000-Chol、PEI25000-Chol。根据聚合物中 δ ~2.50-3.60ppm (N-CH2CH2-N, PEI)和 δ ~4.50ppm (-CH-C00)中相关氢的积分面积之比，计算出聚合物中两组分的摩尔比，结果可知，四种聚合物的两组分摩尔比分别为2.23/1、2.01/1、1.02/1、1.06/1。缓冲性能的测定结果如图4所示。在ρΗ3.87~6.87之间，PEI的分子量越长，聚合物PE1-Chol的缓冲能力相对较大。
[0029]实施例4:碳纳米管复合系统不同介质中的分散性、生物相容性及稳定性研究
[0030]图5中的C图为碳纳米管复合系统PE1-Chol/DSPE-PEG/SWNTs的溶液图，由C图可知，碳纳米管被极大地增溶，故而，溶液颜色非常深。另取PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs的水溶液10 μ L，滴于铜网上，充分挥干后进行TEM测定。TEM结果如图5所示，图A为原始Hipco SffNTs,管子较长，并聚集团绕，分散性差。图B为经PEI1800-Chol和DSPE-PEG2ciqq修饰后的碳纳米管。管子长度明显缩短，且呈单根分散。可见，碳纳米管被成功修饰，能极大溶解于水溶液中、分散性也得到极大增加。取上述水溶液、仅由PEI 1800-Chol修饰的碳纳米管水溶液少量，分别用去离子水、磷酸盐缓冲液(pH=7.4)、DMEM高糖细胞培养基+10%胎牛血清、100%小牛血清稀释，静置24h，观察碳纳米管是否絮集、沉降。结果如图6所示，A图为复合系统在上述四种介质中24h保持稳定，不发生絮集、沉降。B图为仅由PEI1800-Chol修饰的碳纳米管，在DMEM+10%胎牛血清、100%小牛血清的介质中均不稳定，24h后均发生絮集沉降。可见，DSPE-PEG2_能显著增加系统的稳定性和生物相容性，是体系中必要的组分。
[0031]实施例5:碳纳米管复合系统浓度测定
[0032]取实施例2中的PE1-Chol/DSPE-PEG/SWNTs刚超声结束后的水分散液和最终的碳纳米管溶液，取定量稀释100倍后，进行`紫外-可见吸收光谱(300-1100nm)测定，因为PE1-Chol与DSPE-PEG均无紫外吸收。取两者500nm处的吸光度比值，从而计算出四种复合系统的碳纳米管含量约为最初碳纳米管水分散液的48.93% (PEI600-Chol/DSPE-PEG/SffNTs),57.6% (PEI1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs),43.68% (PEI10000-Chol/DSPE-PEG/SffNTs),45.08% (PEI25000-Chol/DSPE-PEG/SWNTs)。
[0033]实施例6:碳纳米管复合系统体外细胞毒性研究
[0034]MTT法检测碳纳米管复合系统对细胞的24h毒性。取100 μ L的L929细胞培养液按3000个/孔的密度接种于96孔板，于37°C，5%C02细胞培养箱中培养。当细胞贴壁率达到70%时，用PBS细胞培养液配制四种碳纳米管(PE1-Chol/DSPE-PEG/SWNTs，实施例2制备)溶液，分别加入到含有细胞的孔中，不加药孔作为空白对照，每个浓度平行6个复孔。培养24h，用倒板法弃去培养基，用PBS清洗两三次，去掉未入胞的碳纳米管材料(碳纳米管在570nm处有紫外吸收)，分别加入31.5 μ L的MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h，弃去培养液，加入200 μ L DMS0，孵育IOmin后，吸出每孔的DMSO溶液，用酶标仪570nm条件下测定其吸光度，各浓度复孔的吸光度取平均值。以空白组的细胞存活率为100%，并通过公式(2)计算各浓度梯度条件下细胞的存活率:[0035]细胞存活率％=(Asample/Acontrol) *100%
[0036]Asample-实验组吸光值
[0037]Acontrol——对照组吸光值
[0038]结果见图7。四种碳纳米管系统的细胞存活率随浓度增大而减小，即毒性增大，PEI25000-Chol/DSPE-PEG/SWNTs 系统的毒性较大。
[0039]实施例7:碳纳米管复合系统与DNA结合后的体外细胞转染实验
[0040]在超净台内，将L929细胞按每孔I X IO5个细胞接种到放好盖玻片的24孔板中，每个孔的培养液体积为lmL。将24孔板于细胞培养箱中37°C、5%C02条件下的培育18h。。吸取4 μ L标记的碳纳米管复合系统(PEI1800-Chol/DSPE-PL/SWNTs，实施例2制备，250 μ g/mL)溶液于无双抗的1640培养基中，吸取0.8μ g的pCCl (Hollis,Roger)于无双抗无血清的1640培养基中，静置5s后，将载体溶液滴入质粒溶液中，分别混合均匀，室温静置30min孵育。吸去24孔板内的培养液，然后在每孔中分别加入碳纳米管质粒复合物，加无FBS的RMPI1640培养基补至每孔总体积为500 μ L，于细胞培养箱中37°C、5%C02条件下的培育。转染6h后，弃去培养基，加入含10%CS的1640培养基lmL，继续培养42h后。荧光倒置显微镜(Leica DMI4000H,Germany)观察碳纳米管复合系统转染后的细胞，观测GFP的绿色荧光结果如图8所示，表明此复合系统可成功转染L929细胞。
[0041]实施例8:碳纳米管复合系统的细胞内定位实验
[0042]在超净台内，将无菌的盖玻片放于6孔板内，每孔I片。将L929细胞按每孔I X IO5个细胞接种到放好盖玻片的6孔板中，每个孔的培养液体积为2mL。将6孔板于细胞培养箱中37°C、5%C02条件下的培育24h，使细胞爬片生长。FITC预先标记PE1-Chol，用此荧光标记的PE1-Chol按照实施例2制备碳纳米管复合系统(PEI1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs)。并吸取16 μ L标记的碳纳米管复合系统(250 μ g/mL)与pCMV质粒(4μ g)分别混合均匀，室温静置60min孵育。吸去6孔板内的培养液，然后在每孔中分别加入碳纳米管质粒复合物，加无FBS的RMPI1640培养基补至每孔总体积为lmL，于细胞培养箱中37°C、5%C02条件下的培育。转染4h后，加入含10%FBS的培养基lmL，继续培养8h后，弃去培养基，加入含10%FBS的培养基2mL，继续培养12h后。然后除去培养基，用2mL PBS冲洗盖玻片3次，每孔中加入1.5mL4%的多聚甲醛溶液，室温下固定30min。吸除多聚甲醛溶液，PBS洗3次，加入1.5mL10 μ g/mL的Hoechest33342溶液，室温下染色15min,用PBS冲洗3次，然后取出盖玻片，滴加一滴含甘油水溶液(1/1，V/V),置于载玻片上封片。激光共聚焦显微镜(CLSM)观察标记的碳纳米管复合系统转染后的细胞，分别采用488nm和405nm两个激发波长分别观测FITC的绿色荧光和H0echeSt33342的蓝色荧光。结果如图9所示，绿色荧光散落在核中，由此可见，附着在碳纳米管上的PE1-Chol可以运载质粒，进入核中。
[0043]实施例8:碳纳米管复合系统的体内分布
[0044]以cy3-DNA 为模型药物，取 PEI1800-Chol/DSPE_PEG/SWNTs50uL，与 3nmol 的cy3-DNA的50uL的PBS溶液混合，避光静置30min后，通过尾静脉注入小鼠体内。等体积等浓度裸cy3-DNA作为治疗对照组。24h后观察，如图10可见，裸cy3_DNA几乎已不存在小鼠内脏，而碳纳米管系统能保护DNA。
【权利要求】
1.一种碳纳米管复合基因载体系统，由碳纳米管管壁上通过疏水作用结合聚乙烯亚胺-胆固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺得到，具体由如下方法制得:称取质量之比为1:10~50:1~2的碳纳米管、聚乙烯亚胺-胆固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入适量去离子水，300~600w功率超声波清洗20~60min,得到碳纳米管分散液；将碳纳米管分散液10000~13000rpm转速离心取上清液，重复离心，收集上清液于IOOkDa的离心过滤器中，4000rpm离心30~40min,取膜上浓缩液,用去离子水定容，即得所述碳纳米管复合基因载体系统的溶液。
2.制备权利要求1所述碳纳米管复合基因载体系统的方法，所述方法如下:称取质量之比为1:10~50:1~2的碳纳米管、聚乙烯亚胺-胆固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入适量去离子水，300~600w功率超声波清洗20~60min，得到碳纳米管分散液；将碳纳米管分散液10000~13000rpm转速离心取上清液，重复离心，收集上清液于IOOkDa的离心过滤器中，4000rpm离心30~40min,取膜上浓缩液,用去离子水定容，即得所述碳纳米管复合基因载体系统的溶液`。
【文档编号】A61P35/00GK103877580SQ201310558175
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】金 一, 孔芬芬, 沈松, 王成润 申请人:浙江大学