EV71 VP1和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了EV71?VP1和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽及其应用，该肠道病毒71型VP1和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽可诱导EV71感染者T细胞产生细胞免疫应答，分泌细胞因子IFN-γ，具体的氨基酸序列为如下SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.24所示。可应用于T细胞表位疫苗的制备，或应用于诱导产生表位肽特异性T细胞免疫应答，在肠道病毒71型特异免疫预防和治疗领域中有着良好的开发应用前景。
【专利说明】EV71 VP1和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗领域，尤其涉及EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽及其应用。
【背景技术】[0002]人肠道病毒71型(Enter0Virus71，EV71)是备受亚太地区日益关注的手足口病(hand, foot, and mouth disease, HFMD)主要病原体之一，HFMD的临床表现为发热,手、足、口及臀部皮肤受损，主要通过粪-口途径和呼吸道飞沫传播。HFMD是常见传染病，多发于幼儿和儿童。HFMD属于全球性传染病，自1974年Schmidt等首次报道手足口病的病原体EV71以来，在世界各国家和地区均有此病流行的报道，并且主要以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行。中国卫生部报道自2008年以来有7，237，297例HFMD病例，其中死亡病例2，462例。自该病首次发现以来，澳大利亚、亚太地区以及许多欧洲国家均有报道。EV71病毒是继脊髓灰质炎病毒后日益最受关注的嗜神经性肠道病毒。研究显示在HFMD死亡病例中EV71感染率高达94.4%。然而，迄今尚缺乏有效的抗病毒治疗药物和预防性疫苗。
[0003]EV71病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属。病毒颗粒为二十面体立体对称球形结构，无包膜和突起，直径大约为24~30nm，病毒颗粒衣壳由60个亚单位构成，后者由VP1，VP2，VP3，VP4四种衣壳蛋白拼装成的五聚体样结构。除了 VP4包埋在病毒颗粒衣壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他三种结构蛋白均暴露在病毒颗粒表面，因此抗原决定簇位于VPl~VP3上。
[0004]VPl蛋白是EV71病毒主要的结构蛋白之一也称为衣壳蛋白，在EV71研究中备受重视:①VPl是EV71病毒的主要中和决定子，直接决定病毒的抗原性VPl具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，是最具有研究价值的结构蛋白；?VP1作为肠道病毒属不同血清型分类的依据，也可作为小RNA病毒科不同属的分类参考VPl是EV71基因分型和遗传进化分析的最重要目标。目前，VPl蛋白成为研究EV71疫苗的首选靶抗原。
[0005]RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，位于EV71编码的非结构蛋白3D蛋白中，含有462个氨基酸残基，在不同血清亚型中高度保守，是复制过程中主要完成RNA链延伸的非结构蛋白，与人类蛋白同源性低，加强对RdRp蛋白诱导EV71感染者特异性细胞免疫应答的研究意义重大。
[0006]在中国，EV71感染可导致无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性脊髓灰质炎样麻痹、神经源性水肿等多种严重的神经系统并发症，尤其是5岁以下婴幼儿。研究报道肠道病毒感染常见于婴幼儿并诱导产生T细胞免疫应答。新生儿肠道病毒感染后细胞免疫较抗体为敏感指标。Chang等研究发现体液免疫在HFMD患者不同临床严重程度中无差异，而大多数EV71感染重症患者Thl细胞相关细胞因子水平较低并且淋巴细胞增殖反应也较弱。EV71感染小鼠体内细胞免疫和体液免疫(T细胞和IL-6)在降低体内病毒载量和死亡率起到重要的作用。EV71感染人体时，引发的广泛周围神经和中枢神经系统炎症反应，如IL-10、IL-13、IFN-Y的产生异常以及淋巴细胞的耗竭可能与EV71相关性肺水肿发病机制密切有关。然而目前，有关细胞免疫在EV71感染过程中的详细机制尚未报道。
[0007]Elispot 技术参考 Cox, J.H., et al., Results of an ELI SPOT proficiencypanel conducted in 11 laboratories participating in international humanimmunodeficiency virus type I vaccine trials.AIDS Res Hum Retroviruses,2005.21 (1):p.68-81.英汉对照
Enterovirus71人肠道病毒71型
hand, foot, and mouth disease 手足口病
RdRp RNA依赖性RNA聚合酶
IL-6白细胞介素6
IL-1O白细胞介素10
IL-13白细胞介素13
IFN- Y干扰素-Y
EV71-湖北-09-中国病毒株(基因号:⑶434678.1) EV71C4亚型VPl和RdRp蛋白氨基酸基因序列在美国国立生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation, NCBI)可以查到。
【发明内容】
[0008]发明的目的:为了提供一种作用广泛的肽，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。
[0009]为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案:
方案1:
EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽，其氨基酸序列为下列SEQ ID N0.1~SEQID N0.24:
SEQ ID N0.1:FVSTIRSVPIGRALAIPN ；
SEQ ID N0.2:ELKMVAYGDDVLASYPFP ；
SEQ ID N0.3:ELRSLDKIRKGKSRLIEA ；
SEQ ID N0.4:LEPSVFHDVFEGNKEPAV ；
SEQ ID N0.5:PIGRALAIPNFENLRRNW ；
SEQ ID N0.6:PNFENLRRNWLELF ；
SEQ ID N0.7:VFEGNKEPAVLTSKDPRL ；
SEQ ID N0.8:PYSTYVKDELRSLDKIRK ；
SEQ ID N0.9 =AVGCNPDVFffSKLPILLP ；
SEQ ID N0.10:MDKYGLDLPYSTYVKDEL ；
SEQ ID N0.11:LELVLREIGYSEEAVSLI ；
SEQ ID N0.12:GYSEEAVSLIEGINHTHH ；
SEQ ID N0.13:NPGTVTGSAVGCNPDVFff ；
SEQ ID N0.14:YVTQAALHYANQLKQLDI ；
SEQ ID N0.15:HLYEVFHANPGTVTGSAV ；SEQ ID N0.16:DINTSKMSMEEACYGTEY ；
SEQ ID N0.17:PSVFVKLSDPPAQVSVPF ；
SEQ ID N0.18 =LAffQTATNPSVFVKLSDP ；
SEQ ID N0.19 =PFMSPASAYQffFYDGYPT ；
SEQ ID N0.20: FSVRTVGSSKSKYPLVIR ；
SEQ ID N0.21 =HVRAffIPRPMRNQNYLFK ；
SEQ ID N0.22:EKDLEYGACPNNMMGTFS ；
SEQ ID N0.23:EVVPQLLQYMFVPPGAPK ；
SEQ ID N0.24:PMRNQNYLFKSNPNYA⑶。
[0010]方案2:
EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽的医疗用途。
[0011]方案3:
EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽的制备方法，结合EV71-湖北-09-中国病毒株(基因号:⑶434678.1)EV71C4亚型VPl和RdRp蛋白氨基酸基因序列，合成覆盖VPl蛋白36条和RdRp蛋白57条重叠肽段,重叠肽段合成技术(PEPscreen ；Sigma-AIdrich)合成VPl和RdRp蛋白区重叠肽段，VPl蛋白区包含有297个氨基酸，RdRp蛋白区包含462个氨基酸，每条肽段由18个氨基酸组成，相邻肽段间重叠10个氨基酸，重叠肽段纯度> 95 %、溶解在RPMI1640，浓度为20mg / ml, _80°C液氮保存；采用体外IFN-YElispot法，检测覆盖EV71 VPl和RdRp蛋白序列重叠肽段作为抗原，诱导EV71感染血T细胞、⑶4+和⑶8+T细胞免疫反应，筛选VPl和RdRp蛋白区特异性T细胞表位24条；T细胞表位肽采用Elispot技术检测PBMC分泌IFN- Y水平而获得筛选鉴定；CD4+T细胞表位肽采用阴性磁珠分选法(MACS)去除CD8+T或CD4+T细胞后，再采用Elispot技术检测PBMC分泌IFN- Y水平而获得筛选鉴定；PBMC应用Ficoll密度梯度离心法获得，Elispot筛选能够刺激EV71感染患者PBMC产生特异性T细胞免疫应答的EV71 VPl和RdRp阳性多肽。
[0012]方案4:
EV71VP1和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽诱导CD4+T细胞产生的免疫蛋白和利用其的疫苗。
[0013]采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果:上述EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽可诱导T细胞产生细胞免疫应答，可用于制备T细胞表位肽疫苗，或用于诱导产生表位特异性CD4+T细胞。本发明提供的EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽，可诱导T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平的IFN- Y，并可诱导CD4+T细胞产生细胞免疫应答，可应用于在不同HLA背景下T细胞表位肽疫苗的制备，在EV71特异性免疫预防和治疗领域有可观的开发应用前景。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]为了进一步说明本发明，下面结合附图进一步进行说明:图1为EV71的病毒颗粒模拟图。
[0016]EV71的病毒颗粒为球形结构,直径24~30nm,核衣壳呈二十面体立体对称,无包膜。核衣壳由60个亚单位构成，每个亚单位由四种衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)组成的五聚体构成。四种结构蛋白中，VP4位于衣壳内部，与病毒核心连接，VPU VP2和VP3均暴露在病毒衣壳表面，带有抗原表位，VPl还与病毒与祀细胞的结合有关。病毒颗粒核心内是长度为7408个核苷酸的单正链RNA，携带遗传物质，编码含2194个氨基酸的大分子多聚蛋白。该多聚蛋白经酶切后形成P1、P2和P3三个前体蛋白，Pl前体蛋白进一步酶切为VPl~VP4四种衣壳蛋白，P2及P3前体蛋白则形成七个功能性蛋白。选取其中EV71的衣壳蛋白VPl和内部蛋白RdRp作为重点研究蛋白。
[0017]VPl-----是EV71 / HFMD发病的主要病毒中和决定子，它直接决定病毒的抗原性，
是EV71致病性关键蛋白。
[0018]RdRp---病毒复制起关键作用。
【具体实施方式】[0019]下面对本发明的实施例进行说明，实施例不构成对本发明的限制: 申请人:根据EV71-湖北-09-中国病毒株(基因号:⑶434678.1) EV71C4亚型VPl和RdRp蛋白氨基酸基因序列设计，合成覆盖VPl蛋白36条和RdRp蛋白57条重叠肽段，利用重叠肽段合成技术(PEPscreen ；Sigma-AIdrich)合成VPl和RdRp蛋白区重叠肽段，公别包含有297个和462个氨基酸，每条肽段由18个氨基酸组成，相邻肽段间重叠10个氨基酸。重叠肽段纯度>95%、溶解在RPMI 1640，浓度为20mg / ml，_80°C液氮保存备用。
[0020]采用体外IFN-YElispot法，检测覆盖EV71 VPl和RdRp蛋白序列重叠肽段作为诱导抗原，诱导EV71感染患儿和健康同龄儿童对照外周血T细胞、⑶4+和⑶8+T细胞免疫反应，筛选VPl和RdRp蛋白区特异性T细胞表位24条。
[0021]T细胞表位肽采用Elispot技术检测PBMC分泌IFN- Y水平而获得筛选鉴定。
[0022]⑶4+T细胞表位肽采用阴性磁珠分选法(MACS)去除⑶8+T或⑶4+ T细胞后，再采用Elispot技术检测PBMC分泌IFN- Y水平而获得筛选鉴定。
[0023]PBMC应用Ficoll密度梯度离心法获得，Elispot技术筛选能够刺激EV71感染患者PBMC产生特异性T细胞免疫应答的EV71 VPl和RdRp阳性多肽。
[0024]具体方法实施过程:
1.分离外周血单个核细胞(PBMC)
(1).肝素钠抗凝管取外周静脉血10~20ml,室温放置15~2h,离心2000rpm5min后，吸取血浆保存于-80°C冰箱；
(2).取等量RPMI充分混匀稀释外周血，用移液管吸取等量(避光、温至室温)淋巴细胞分离液(Lymphocyte Separation Medium, LSM),移至50ml无菌维形离心管；
(3).将装有LSM的离心管倾斜30°，用吸管吸取稀释的血液，在LSM液面Icm处，沿管壁缓慢加入稀释血液，保持二者界面倾斜；
(4).采用Ficoll密度梯度离心法水平离心2000rpm20min；
(5).离心后，离心管内分为3层，上层为少量血浆，中间层为LSM，下层主要为红细胞和粒细胞，上中层中间有以单个核细胞为主的一个白色云雾状狭窄带，包括淋巴细胞、单核细胞，此外还含有血小板，将吸管插入到云雾层吸取位于LSM胞界面的大颗粒细胞(^ 1.5ml)；(6).RPMI液洗涤细胞两次，第二次洗涤后弃上清，加入IOml FCS的完全培养液；采用一次性细胞计数器计数，并调整细胞密度≥0.5X IO6个/ ml。
[0025]2.阴性磁珠分选法(MACS)
(1).润洗磁珠抗体:用含有I% FCS的D-PBS (不含Ca2+&Mg2+)缓冲液洗涤抗-⑶4或抗-CD8抗体包被的磁珠2遍后，弃之缓冲液；
(2).孵育:上述获取的PBMC中分别加至润洗好的磁珠抗体中，置于4°C摇晃孵育30min ；
(3).分选:将混匀的PBMC固定于磁力架磁场中静置5min后，弃去液体，吸附剩余管壁的即是不含有CD4+T细胞和不含有CD8+T细胞的细胞；
(4).重悬细胞:获取的⑶4+T细胞和⑶8+T细胞细胞加入于完全RPMI1640培养液，制成单细胞悬液待用；
(5).检验纯度:采用流式细胞术(FlowCytometry，FCM)检测CD4+/ CD8+T细胞的纯度达98%以上。以上步骤均在冰上操作。
[0026]3.1FN-g酶联免疫斑点吸附试验(Elispot)
(1).包被:用每孔50mL终浓度IOmg/ ml抗人IFN- Y抗体包被96孔PVDF膜酶标板，4°C过夜；
(2).加样:用RPMI1640培养液洗板6次后，每孔加完全RPMI1640培养液50 μ L，置于37°C,5% CO2孵箱中封闭30min后弃之；分别加入实验组重叠肽库5 μ L单个肽段的终浓度为2.5g / ml和100 μ L上板前已计数的细胞(0.5_10 X IO5个细胞)，阳性对照组为同一细胞加ΡΗΑ5 μ L终浓度为10 μ g / ml，阴性对照组为同一细胞加加完全1640培养液5 μ L，置于37°C、5% CO2孵箱中过夜(12~18h)；
(3).显色:每孔加入0.05% Tween20-PBS200mL洗板6遍后加入终浓度为I μ g / ml生物素标记的抗人INF- Y抗体(二抗)100 μ 1，室温放置2h后；0.05% Tween20-PBS200mL洗板6遍，每孔加50mL碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(I: 1000)，室温放置lh，0.05%Tween20-PBS200mL洗板6遍后加50mL /孔显色剂，反应孔出现蓝色斑点，并且斑点不再增加即可停止显色。弃掉显色液，用自来水流水直接冲洗96孔板终止反应；
(4).计数:待反应板自然干后，Elispotreader (德国AID公司)读反应孔蓝色斑点数，每个斑点代表一个特异性T细胞,用斑点形成单位(SFUs, spot forming cells) /IO6PBMCs来表示；
(5).阳性反应判定标准:设定反应孔内SFUs大于20个，并且大于3倍阴性对照孔SFUs为阳性反应判定标准。反应强度用每IO6个PBMC中斑点形成单位数表示，EV71病毒蛋白特异性免疫应答的反应频率用特异性反应阳性例数占全部例数的百分比表示。
[0027]表1:筛选出的EV71 VPl和RdRp蛋白区特异性CD4+T细胞表位
【权利要求】
1.EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽，其氨基酸序列为下列SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.24:
SEQ ID N0.1:FVSTIRSVPIGRALAIPN ；
SEQ ID N0.2:ELKMVAYGDDVLASYPFP ；
SEQ ID N0.3:ELRSLDKIRKGKSRLIEA ；
SEQ ID N0.4:LEPSVFHDVFEGNKEPAV ；
SEQ ID N0.5:PIGRALAIPNFENLRRNW ；
SEQ ID N0.6:PNFENLRRNWLELF ；
SEQ ID N0.7:VFEGNKEPAVLTSKDPRL ；
SEQ ID N0.8:PYSTYVKDELRSLDKIRK ；
SEQ ID N0.9:AVGCNPDVFWSKLPILLP ；
SEQ ID N0.10:MDKYGLDLPYSTYVKDEL ；
SEQ ID N0.11:LELVLREIGYSEEAVSLI ；
SEQ ID N0.12: GYSEEAVSLIEGINHTHH ；
SEQ ID N0.13:NPGTVTGSAVGCNPDVFff ；
SEQ ID N0.14:YVTQAALHYANQLKQLDI ；
SEQ ID N0.15:HLYEVFHANPGTVTGSAV ；
SEQ ID N0.16:DINTSKMSMEEACYGTEY ；
SEQ ID N0.17:PSVFVKLSDPPAQVSVPF ；
SEQ ID N0.18 =LAffQTATNPSVFVKLSDP ；
SEQ ID N0.19 =PFMSPASAYQffFYDGYPT ；
SEQ ID N0.20:FSVRTVGSSKSKYPLVIR ；
SEQ ID N0.21 =HVRAffIPRPMRNQNYLFK ；
SEQ ID N0.22:EKDLEYGACPNNMMGTFS ；
SEQ ID N0.23:EVVPQLLQYMFVPPGAPK ；
SEQ ID N0.24:PMRNQNYLFKSNPNYAGD。
2.EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽的医疗用途。
3.EV71VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽的制备方法，结合EV71-湖北-09-中国病毒株(基因号:⑶434678.1)EV71 C4亚型VPl和RdRp蛋白氨基酸基因序列，合成覆盖VPl蛋白36条和RdRp蛋白57条重叠肽段,利用重叠肽段合成技术(PEPscreen ；Sigma-AIdrich)合成VPl和RdRp蛋白区重叠肽段，VPl蛋白区包含有297个氨基酸，RdRp蛋白区包含462个氨基酸，每条肽段由18个氨基酸组成，相邻肽段间重叠10个氨基酸，重叠肽段纯度> 95 %、溶解在RPMI1640，浓度为20mg / ml, _80°C液氮保存；采用体外IFN-YElispot法，检测覆盖EV71 VPl和RdRp蛋白序列重叠肽段作为抗原，诱导EV71感染血T细胞、⑶4+和⑶8+T细胞免疫反应，筛选VPl和RdRp蛋白区特异性T细胞表位24条；T细胞表位肽采用Elispot技术检测PBMC分泌IFN- Y水平而获得筛选鉴定；CD4+T细胞表位肽采用阴性磁珠分选法(MACS)去除CD8+T或CD4+T细胞后，再采用Elispot技术检测PBMC分泌IFN- Y水平而获得筛选鉴定；PBMC应用Ficoll密度梯度离心法获得，Elispot筛选能够刺激EV71感染患者PBMC产生特异性T细胞免疫应答的EV71 VPl和RdRp阳性多肽。
4.EV71 VPl和RdRp蛋白特异性T细胞表位肽诱导⑶4+T细胞产生的免疫蛋白和利用其的疫 苗。
【文档编号】A61K39/125GK103694318SQ201310745172
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】党双锁, 高宁, 李梅, 李亚萍, 翟嵩, 贾晓黎 申请人:党双锁