用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制备方法
【专利摘要】用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制备，本发明涉及一种拉伸强度大、可以缝合固定的羟甲基几丁质复合神经导管的制造方法。通过将羟甲基几丁质溶液和聚乙烯醇混合溶液与胶原蛋白以不同体积配比混合成复合溶液，然后将该复合溶液注入模具，经反复冻融后，进行层层固化制得。通过周围神经缺损动物模型的电生理和组织学观察结果发现所制得的神经导管可进行神经缺损断端的桥接，拉伸强度大，体内维持时间长，并可促进神经的再生，神经轴突可沿导管生长。本发明工艺简单，价格低廉，可替代传统的神经缝接方法，在周围神经缺损的临床治疗中有较好的应用前景。
【专利说明】用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及医用生物材料【技术领域】，是一种涉及新型材料组成的神经导管制备方法，在进行周围神经缺损的治疗时可作为神经桥接管使用，并可以吸收及降解生物材料。
【背景技术】
[0002]周围神经缺损修复是一直困扰临床的一个难题。传统的修复方法如外膜缝合其疗效优良率仅为50%，在创伤外科领域，神经损伤修复是靠神经端端缝合，但由于周围神经是混合神经，而且目前还缺乏在手术中能够快速而准确地辨别神经断端感觉神经和运动神经纤维的科学鉴别方法，及时应用精细的显微镜下缝合，也难以避免在神经端端缝合后，因感觉、运动神经纤维的错向对接，而影响神经缝合的疗效，影响神经功能的恢复。近年来，有学者主张在神经断端间留2?3mm的间隙，由于神经的趋化作用，有利于使近端感觉神经纤维和运动神经纤维分别与远端相应神经纤维对接，从而提高神经修复效果。
[0003]羧甲基几丁质是甲壳素脱乙酰化的产物，大量的相关研究证明羧甲基几丁质是一种生物相容性好、可生物降解吸收以及无毒副作用的天然多糖，与聚乙烯醇混合溶液与胶原蛋白后形成一种新型、优良的医用生物材料，医用聚乙烯醇也是经过临床使用证明具有良好的生物相容性和良好的止血功能，它可以起到赋形剂的作用。胶原是组成胶原纤维的蛋白质，约占哺乳动物总蛋白质的1/3，其在皮肤和结缔组织中含量丰富，但一种成分的羧甲基几丁质导管弹性差，易破碎，神经断端无法在管中固定。
[0004]以羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液与胶原蛋白为基材神经导管不仅可以起到支架桥接作用，而且具有神经营养的作用，可以较好地促进神经再生。
[0005]非生物降解材料主要有硅胶管、碳纤维管、聚酯纤维管等，此类导管本身具有有一定毒性，管壁压缩神经、需二次手术取出导管等弊端。
[0006]用此制造导管生物相容性好、具有良好生物力学、可拉伸及在体内可降解吸收的导管在临床上具有很重要的现实意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种拉伸程度大、在体内可维持较长时间、可降解吸收的一种用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制造方法。
[0008]本发明提供一种用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制造方法，该神经导管的主要成分羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液和胶原蛋白溶液复合溶液，通过复合溶液在模具上进行层层固化制得的，具体包括以下步骤:
[0009]a.制备酸性条件下浓度为1.5-2.5% (w/v)的羧甲基几丁质溶液；
[0010]b.制备浓度为10-20% (w/v)的聚乙烯醇溶液；
[0011]c.羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合，其比例为4/l_l/4(m/m)混合溶液；
[0012]d.制备酸性条件下的浓度为1-1.5% (w/v)的胶原蛋白溶液；
[0013]e.制备羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液:将上述胶原蛋白-羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液复合溶液按照体积比为5: 5、6: 4、7: 3或8: 2的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡；
[0014]f.制备神经导管:在无菌环境下，将上述羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液涂层在外径0.5-1.6mm的模具上，涂层均匀后，在0.5%的氢氧化钠溶液中固化，然后用酒精脱水，注射用水洗涤，在30?40°C下烘至半干燥状态，然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程，直至导管壁厚达到150-200 μ m，然后将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min，脱模，用注射用水洗涤，自然晾干，包装后灭菌。
[0015]上述神经导管的制造方法，更具体的操作步骤如下:
[0016]a.制备羧甲基几丁质溶液:取新鲜蟹壳，去除头、脚和尾，用清水洗净，分别用5%HCl和10%的NaOH浸泡去除钙和蛋白，洗至中性，烘干，磨粉得到粉末几丁质，取粉末几丁质在50%的NaOH溶液中100°C以上脱乙酰反应24h以上，然后中和，用注射用水洗涤至中性，酒精脱水，最后真空干燥得脱乙酰度为85-95 %的羟甲基几丁质，将该羟甲基几丁质溶解在2% (v/v)的醋酸中，使最终羟甲基几丁质溶液浓度为1.5% (w/v)；
[0017]b.将羧甲基几丁质溶液与聚乙烯醇溶液混合2/1 (m/m)，充分搅拌，静置除去气泡，制得混合溶液；
[0018]c.制备胶原蛋白溶液:以牛跟腱为原料，进行脱脂处理和清洗后，冷冻，切片，用高速组织捣碎机捣碎，洗提，离心；取沉淀用2% (v/v)醋酸抽提，用胃蛋白酶消化，牛跟腱与胃蛋白酶的重量比为100: 1，提取72小时，过滤，高速离心30min ;取上清液加入氯化钠至最终浓度为2.5mol/L，进行盐析，去除杂蛋白，高速离心30min，取沉淀溶解在2% (v/v)醋酸，使最终胶原蛋白的浓度为1.5% (w/v)；
[0019]d.制备羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液:将上述胶原蛋白-羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液复合溶液按照体积比为5: 5、6: 4、7: 3或8: 2的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡；
[0020]e.制备神经导管:在无菌环境下，将上述羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液涂层在外径0.5-1.6mm的模具上，涂层均匀后，在0.5%的氢氧化钠溶液中固化，然后用酒精脱水，注射用水洗涤，在30?40°C下烘至半干燥状态，然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程，直至导管壁厚达到150-200 μ m，然后将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min，脱模，用注射用水洗涤，自然晾干，包装后灭菌，采用双层无菌包装后，进行6°Co辐照灭菌。
[0021]上述导管的长度可以根据临床应用要求剪裁成各种规格。
[0022]在制备羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液中，胶原蛋白溶液和羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液按照体积比7: 3的比例混合，效果最佳。
[0023]本发明在羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液与胶原蛋白的溶液复合溶液为基质神经导管的制造过程中，通过调节胶原和羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液的适合体积配t匕，将三者优势结合起来。相关文献已证明羧甲基几丁质与雪旺氏细胞有着良好组织相容性，此外羧甲基几丁质有抑成纤维细胞生长并可以减少神经断端间疤痕的形成利于神经轴索的生长，胶原蛋白对神经有营养作用，可以很好地促进神经的再生。医用聚乙烯醇也是经过临床使用证明具有良好的生物相容性和良好的止血功能，它可以起到赋形剂的作用。
[0024]本发明的优点:
[0025]1.本发明制造工艺简单。
[0026]2.本发明成本较低。
[0027]3.本发明制得的神经导管代替传统的神经缝接方法，并可用于小距离神经缺损的套接，在周围神经缺损的临床治疗中有较好的应用前景。
[0028]具体实施办法
[0029]现结合实施例，对本发明作详细描述:
[0030]实施例1:本发明是一种用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制备。
[0031]第一步:羧甲基几丁质溶液的制备
[0032]取新鲜蟹壳，去除头、脚和尾，用清水洗净，分别用5% HCl和10%的NaOH浸泡去除钙和蛋白，洗至中性，烘干，磨粉得到粉末几丁质，取粉末几丁质在50%的NaOH溶液中100°C以上脱乙酰反应24h以上，然后中和，用注射用水洗涤至中性，酒精脱水，最后真空干燥得脱乙酰度为85-95%的羟甲基几丁质，将该几丁质溶解在2% (v/v)的醋酸中，使最终羧甲基几丁质溶液浓度为1.5% (w/v)。
[0033]第二步:医用聚乙烯醇溶液制备
[0034]将医用聚乙烯醇溶于热的注射用水中，充分搅拌，静置除去气泡，最终聚乙烯醇溶液浓度为10% (w/v)。
[0035]第三步:羧甲基几丁质与聚乙烯醇混合溶液比例制备
[0036]将羟甲基几丁质与聚乙烯醇溶液混合2/1 (m/m)，充分搅拌，静置除去气泡，制得混合溶液。
[0037]第四步:胶原蛋白溶液的制备
[0038]以牛跟腱为原料，进行脱脂处理和清洗后，冷冻，切片，用高速组织捣碎机捣碎，洗提，离心。取沉淀用2% (v/v)醋酸抽提，用胃蛋白酶(牛跟腱与胃蛋白酶的重量比为100: I)消化，提取72小时，过滤，高速离心30min;取上清液加入氯化钠至最终浓度为
2.5mol/L,进行盐析,去除杂蛋白，高速离心30min,取沉淀溶解在2% (v/v)醋酸,使最终胶原蛋白的浓度为1.5% (w/v)。
[0039]第五步:羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合-胶原蛋白复合溶液的制备
[0040]将上述胶原蛋白溶液与羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液按照体积比为5: 5的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡。
[0041]第六步:模制多层复合神经导管的制备
[0042]在无菌环境下，将上述羧甲基几丁质和聚乙烯醇-胶原蛋白复合溶液涂层在外径为1.2mm的不锈钢模具上，涂层均匀后，在0.5%的氢氧化钠溶液中固化，然后用酒精脱水，注射用水洗涤，在30?40°C下烘干至半干燥状态，然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程，得到长2-3cm，内径1.2m，壁厚200 μ m的导管。然后，将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min，脱模，用注射用水洗涤，自然晾干。采用双层无菌包装后，进行6tlCo辐照灭菌。
[0043]实施例2:本发明是一种用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制备
[0044]第一步:羧甲基几丁质溶液制备和第二步医用聚乙烯醇制备按第三步比例混合制备和第四步胶原蛋白溶液制备同实例I。
[0045]第五步:羟甲基几丁质和聚乙烯醇混合-胶原蛋白复合溶液的制备
[0046]将上述胶原蛋白溶液与羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液按照体积比为6: 4的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡。
[0047]第六步:模制多层复合神经导管的制备同实例I。
[0048]实施例3:本发明是一种用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制备。
[0049]第一步:羧甲基几丁质溶液制备和第二步医用聚乙烯醇制备按第三步混合制备和第四胶原蛋白溶液制备同实例I。
[0050]第五步:羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液的制备
[0051]将上述胶原蛋白溶液与羟甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液按照体积比为7: 3的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡。
[0052]第六步:模制多层复合神经导管的制备同实例I。
[0053]实施例4:本发明是一种用于周围神经缺损的羟甲基几丁质复合神经导管的制备。
[0054]第一步:羧甲基几丁质溶液制备和第二步医用聚乙烯醇制备按第三步混合制备和第四胶原蛋白溶液制备同实例I。
[0055]第五步:羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液的制备
[0056]将上述胶原蛋白溶液与羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液按照体积比为8: 2的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡。
[0057]第六步:模制多层复合神经导管的制备同实例I。
[0058]实施例5:复合神经导管的力学强度检测
[0059]第一步:从实施制得的神经导管样品上截取一小段测试样，其长度不小于自然状态下样品的内径。将样品的两端固定在万能拉力机上，小心确保实验样品没有被拉伸、扭曲或被夹具损坏，以50mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂。测量断裂或屈服时的负载力。
[0060]第二步:将试样平放在万能拉力机的下压缩板中央，调整上压缩板。当上压缩板接触软管时，开始记录数据，拉力机以5mm/min的速度压缩软管，当位移为样品直径的50%时停机，然后反向运转至负荷为零时停机，记录整个过程中负荷变化。
[0061]实施例6:复合神经导管桥接周围神经缺损的电生理研究
[0062]第一步:选用20只雄性SD大鼠(180_220g)采用I %戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，大鼠左股后外侧行纵行切口，自肌间隙进入显露坐骨神经约2.5cm。于坐骨神经中段切取12mm,任其回缩到15mm,采用实施制得神经导管,长17mm,内径1.5mm,复合神经导管桥接神经缺损羟甲基几丁质复合神经导管，二端分别套入1_，10-0尼龙线3针固定。手术均在显微镜下完成，术后常规饲养，分别于术后4、8、12、16周取材料检测。
[0063]第二步:实验发现，在术后8周，缺损部位已经有新生神经，将远、近端相连。术后16周，有较明显的电生理反应。证明羟甲基几丁质复合神经导管有较好的修复神经作用。
[0064]实施例7:复合神经导管桥接周围神经缺损的组织学研究
[0065]第一步:雄性Wistan大鼠12只，体重200_250g，将右侧坐骨神经切除6mm，采用实施得到神经导管，左侧坐骨神经为正常对照组，术后I周处死动物。
[0066]第二步:实验发现，组织学检查低倍镜下可见再生神经纤维排列整齐通过神经导管。导管变薄，但仍可见，且神经与周围组织间粘连轻。高倍镜见再生神经纤维密集，形态正常。8周末辣根过氧化物酶(HRP)检查，至脊髓腰膨大灰质前角中可见HRP标记阳性的运动神经元，细胞集中在L5、L6及骶神经段。本发明可降解神经导管拉伸强度大，在体内维持时间长，神经轴突可沿导管生长。
【权利要求】
1.一种用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制备方法，其主要特征为以羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液，再与胶原蛋白溶液共混成复合溶液，经冻融固化而成，可替代传统的神经缝接方法，在周围神经损伤的治疗时用于小距离神经缺损的套接。 a.制备酸性条件下的浓度为1.5-2.5%(w/v)的羧甲基几丁质溶液； b.将聚乙烯醇溶于热的注射用水中，充分搅拌，静置除去气泡，最终制备聚乙烯醇溶液浓度为 10-20% (m/v)。 c.羧甲基几丁质和聚乙烯醇，其比例为4/l-l/4(m/m);混合溶液。 d.制备酸性条件下的浓度为1-1.5%(w/v)的胶原蛋白溶液； e.制备羧甲基几丁质与聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液:将上述胶原蛋白溶液与羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液按照体积比为5: 5、6: 4、7: 3或8: 2的比例混合成复合溶液，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡； f.制备神经导管:在无菌环境下，将上述羧甲基几丁质与聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液涂层在外径0.5-1.6mm的模具上，涂层均匀后，在0.5%的氢氧化钠溶液中固化，然后用酒精脱水，注射用水洗涤，在30?40°C下烘至半干燥状态，然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程，直至导管壁厚达到150-200 μ m，然后将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min，脱模，用注射用水洗涤，自然晾干，包装后灭菌。
2.根据权利要求1所述的羧甲基几丁质复合神经导管制备方法，其特征在该方法包括以下步骤: a.制备羧甲基几丁质溶液:取新鲜蟹壳，去除头、脚和尾，用清水洗净，分别用5%HCl和10%的NaOH浸泡去除钙和蛋白，洗至中性，烘干，磨粉得到粉末几丁质，取粉末几丁质在50%的NaOH溶液中100°C以上脱乙酰反应24h以上，然后中和，用注射用水洗涤至中性，酒精脱水，最后真空干燥得脱乙酰度为85-95 %的羧甲基几丁质，将该羧甲基几丁质溶解在2% (v/v)的醋酸中，使最终羧甲基几丁质溶液浓度为1.5% (w/v)； b.制备聚乙烯醇溶于热的注射用水中，充分搅拌，静置除去气泡，最终聚乙烯醇溶液浓度为 10% (w/v)； c.羧甲基几丁质和聚乙烯醇，其比例为4/l-l/4(m/m)配比混合溶液； d.制备胶原蛋白溶液:以牛跟腱为原料，进行脱脂处理和清洗后，冷冻，切片，用高速组织捣碎机捣碎，洗提，离心；取沉淀用2% (v/v)醋酸抽提，用胃蛋白酶消化，牛跟腱与胃蛋白酶的重量比为100: 1，提取72小时，过滤，高速离心30min ;取上清液加入氯化钠至最终浓度为2.5mol/L,进行盐析,去除杂蛋白，高速离心30min,取沉淀溶解在2% (v/v)醋酸，使最终胶原蛋白的浓度为1.5% (w/v)； d.制备羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液:将上述胶原蛋白溶液与羧甲基几丁质与聚乙烯醇混合溶液的复合溶液按照体积比为5: 5、6: 4、7: 3或8: 2的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡； e.制备神经导管:在无菌环境下，将上述羧甲基几丁质与聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液涂层在外径0.5-1.6mm的模具上，涂层均匀后，在0.5%的氢氧化钠溶液中固化，然后用酒精脱水，注射用水洗涤，在30-40°C下烘至半干燥状态，然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程，直至导管壁厚达到150-200 μ m ;然后将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min，脱模，用注射用水洗涤，自然晾干；采用双层无菌包装后，进行6tlCo辐照灭菌。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于周围神经缺损的羧甲基几丁质复合神经导管的制备方法，其特征在于其中e，制备羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液-胶原蛋白溶液复合溶液:将上述胶原蛋白溶液与羧甲基几丁质和聚乙烯醇混合溶液按照体积比为7: 3的比例混合。
【文档编号】A61L27/20GK104383595SQ201410670227
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】杨子中 申请人:杨子中