技术领域本发明涉及INTS10基因/蛋白在抑制HBV基因复制或者预防或治疗HBV相关疾病中的用途。
背景技术：
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是全球最常见的病毒性传染病之一，全球范围内，大约有2.5亿HBV慢性携带者。我国约有1.2亿HBV慢性携带者，是HBV感染的流行区。HBV感染可能引发一系列肝脏疾病，包括慢性乙型肝炎、肝硬化、直至肝癌。每年乙肝患者花费的医疗费用可高达1,000亿人民币，间接损失预计是直接损失的一倍以上。因此，乙型肝炎是危害我国人民健康和造成国民经济损失的最严重的传染病之一。有效的预防和治疗乙型肝炎是我国公众健康的一个重要目标。然而，目前HBV引起的肝类疾病的预防或治疗方面的研究仍有待加强。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种新的抑制HBV基因复制或者预防或治疗HBV相关疾病的手段。首选，需要说明的是，本发明是基于下列研究、探索才意外发现的：以单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)为遗传标记，通过全基因组关联研究(Genome-wideassociationstudy，GWAS)，研究人员已发现HLA-DP(rs3077与rs9277535)，HLA-DQ(rs2856718和rs7453920)等多个与HBV感染慢性化相关的易感区域。虽然全基因组关联研究成功发现了多个HBV感染慢性化相关的易感区域，但是这些研究中均存在一定的缺陷，如发掘人群样本量相对较少，或对照样本并不是严格意义上的自限性恢复者，导致这些研究所具有的统计效能无法全面地发掘HBV感染慢性化相关的易感区域。同时，这些研究均没有对易感区域内的候选基因进一步进行深入的功能机制研究。候选基因是否确实与HBV感染后的作用密切相关仍旧未知。发明人开展了新一轮的HBV感染慢性化全基因组关联研究，在多个人群中发现，8p21.3区域的rs7000921与HBV感染慢性化显著相关。特别地，在8p21.3区域内，发明人使用表达谱数据和基因型数据，发现rs7000921保护性等位与该区域INTS10基因的高表达显著相关。发明人通过细胞学实验(敲低INTS10基因或过表达INTS10基因)，证明INTS10能够抑制肝脏细胞中HBV的复制。此外，发明人运用酶联反应检测了INTS10蛋白在血浆样本中的表达，发现，INTS10蛋白表达量在HBV持续性感染者血浆中显著低于自限性恢复者(P＝2.0×10-19，倍数＝2.0)。同时，INTS10的表达与HBVDNA载量呈负性相关，且在HBVe抗原(hepatitisBeantige，HBeAg)阳性个体中，该相关性更强。总的来说，这些结果提示INTS10能够抑制肝脏细胞中HBV的复制。因而，在本发明的第一方面，本发明提供了INTS10基因/蛋白在抑制HBV基因复制或者预防或治疗HBV相关疾病中的用途。由此，使目的细胞例如肝脏细胞或肝癌细胞过表达INTS10基因，能够有效抑制肝脏细胞或肝癌细胞中HBV基因的复制，从而有效预防或治疗HBV相关疾病。根据本发明的实施例，所述HBV相关疾病为乙型肝炎、肝硬化或肝癌。在本发明的第二方面，本发明提供了一种抑制目的细胞中HBV基因复制的方法。根据本发明的实施例，所述方法是使所述目的细胞过表达INTS10基因。由此，能够有效抑制肝脏细胞或肝癌细胞中HBV基因的复制，从而有效预防或治疗HBV相关疾病。根据本发明的实施例，所述目的细胞为肝脏细胞，或者肝癌细胞。根据本发明的实施例，通过对所述目的细胞转染包含INTS10基因的载体，使所述目的细胞过表达INTS10基因。由此，简单有效。在本发明的第三方面，本发明提供了INTS10基因/蛋白在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抑制HBV基因复制或者预防或治疗HBV相关疾病。具体地，例如将包含INTS10基因的载体直接作为药物，注射或以其他途径给予患者，使患者肝脏细胞的INTS10基因过表达；或者利用INTS10基因制备重组细胞进而生产INTS10蛋白，然后直接以INTS10蛋白作为药物活性成分，对患者进行给药，从而使患者目的细胞例如肝脏细胞或肝癌细胞过表达INTS10基因，由此，能够有效抑制肝脏细胞或肝癌细胞中HBV基因的复制，从而有效预防或治疗HBV相关疾病。根据本发明的实施例，所述HBV相关疾病为乙型肝炎、肝硬化或肝癌。在本发明的第四方面，本发明提供了INTS10基因/蛋白在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抑制HBV基因复制或者预防或治疗HBV相关疾病。具体地，将INTS10基因/蛋白作为筛选药物的生物标志物，例如，可以将所述INTS10基因/蛋白作为靶标，基于候选试剂加入前后样本的INTS10基因/蛋是否显著增加来筛选所述能够有效抑制HBV基因复制或者预防或治疗HBV相关疾病的药物。根据本发明的实施例，所述HBV相关疾病为乙型肝炎、肝硬化或肝癌。根据本发明的实施例，所述用途通过下列步骤实现：(1)将候选试剂加入表达INTS10基因的体系中；(2)检测加入所述候选试剂前后所述体系中INTS10基因/蛋白的含量变化，并与对照进行比较，其中，相对于对照，加入候选试剂后所述体系中INTS10基因/蛋白的含量显著增加是所述候选试剂作为目的药物的指示。由此，能够有效地筛选抑制HBV基因复制或者预防或治疗HBV相关疾病的药物，且结果准确可靠。在本发明的第五方面，本发明提供了INTS10基因/蛋白在制备或筛选HBV相关疾病诊断试剂中的用途。具体地，将INTS10基因/蛋白作为生物标志物，用于制备或筛选HBV相关疾病诊断试剂。根据本发明的实施例，所述HBV相关疾病为乙型肝炎、肝硬化或肝癌，根据本发明的实施例，所述INTS10基因/蛋白用作生物标志物。根据本发明的实施例，所述用途通过下列至少一种方式实现：(1)当用于制备HBV相关疾病诊断试剂时，将所述INTS10基因/蛋白作为所述HBV相关疾病诊断试剂的标准品或阳性对照，用于样本中INTS10基因/蛋白的检测；(2)当用于筛选HBV相关疾病诊断试剂时，将所述INTS10基因/蛋白作为靶标，基于样本的INTS10基因/蛋白水平筛选所述诊断试剂。具体地，当用于制备HBV相关疾病诊断试剂时，将所述INTS10基因/蛋白作为所述HBV相关疾病诊断试剂的标准品或阳性对照，用于样本中INTS10基因/蛋白的检测，当样本中的INTS10基因/蛋白含量低于标准品或阳性对照时，则可以确定样本易患HBV相关疾病；当用于筛选HBV相关疾病诊断试剂时，将所述INTS10基因/蛋白作为靶标，基于样本的INTS10基因/蛋白水平筛选所述诊断试剂，当候选试剂能够有效确定样本中INTS10基因/蛋白含量的变化时，则可以将其作为HBV相关疾病的诊断试剂。在本发明的第六方面，本发明提供了一种HBV相关疾病诊断试剂盒。根据本发明的实施例，包括能够特异性检测INTS10基因/蛋白含量的试剂。由此，利用该试剂盒能够有效检测样本中的INTS10基因/蛋白含量，进而基于标准品或参照的INTS10基因/蛋白含量，能够有效确定样本是否患有HBV相关疾病。根据本发明的实施例，所述HBV相关疾病为乙型肝炎、肝硬化或肝癌。根据本发明的实施例，所述能够特异性检测INTS10基因/蛋白含量的试剂为特异性扩增INTS10基因的引物或特异性抗INTS10蛋白的抗体。由此，检测待测样本INTS10基因/蛋白含量的结果准确、可靠，特异性好。在本发明的第七方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包含INTS10基因/蛋白，其中所述INTS10基因以携带INTS10基因的载体形式存在。也即，可以将携带INTS10基因的载体作为药物，注射或以其他途径给予患者，使患者肝脏细胞的INTS10基因过表达；或者直接将INTS10蛋白作为药物活性成分，对患者进行给药，从而使患者目的细胞例如肝脏细胞或肝癌细胞过表达INTS10基因，由此，能够有效抑制肝脏细胞或肝癌细胞中HBV基因的复制，从而有效预防或治疗HBV相关疾病。其中，需要说明的是，本文中所采用的表达方式“INTS10基因/蛋白”是指INTS10基因或INTS10蛋白。但具体情况，可以按照本技术领域的知识具体理解。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例，rs7000921在合并所有人群后进行荟萃分析得到的森林图(Forestplot)；图2显示了根据本发明一个实施例，8p21.3区域的局部关联图；图3显示了根据本发明一个实施例，rs7000921eQTL分析结果；图4显示了根据本发明一个实施例，病例-对照中血浆INTS10定量结果；图5显示了根据本发明一个实施例，血浆INTS10表达与HBVDNA载量相关性分析结果；图6显示了根据本发明一个实施例，L-02细胞、HepG2细胞和HepG2.2.15细胞过表达INTS10实验结果，即过表达INTS10抑制HBVDNA的复制；图7显示了根据本发明一个实施例，L-02细胞、HepG2细胞和HepG2.2.15细胞过表达INTS10实验结果，即过表达INTS10可抑制HBVRNA的表达；图8显示了根据本发明一个实施例，L-02细胞、HepG2细胞和HepG2.2.15细胞过表达INTS10实验结果，即INTS10过表达抑制HBsAg和HBeAg的分泌；图9显示了根据本发明一个实施例，沉默肝细胞中INTS10的表达对HBV复制的影响的实验结果；图10显示了根据本发明一个实施例，敲低细胞中INTS10的表达对HBVRNA表达影响的实验结果；以及图11显示了根据本发明一个实施例，敲低肝细胞中INTS10的表达对HBsAg和HBeAg的分泌的影响的实验结果。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1一、材料方法：研究人群：本项全基因组关联研究分为发掘阶段和验证阶段两个部分。所有研究对象均为中国成年个体，招募自中国南部、中部和北部，共包含5,156例病例和4,413例对照。病例样本为HBV持续感染者，入选标准为血清乙肝表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)和乙肝核心抗体(anti-HBcimmunoglobulinG，IgGanti-HBc)呈阳性至少6个月。对照样本为HBV感染后自限性恢复者，入选标准为血清HBsAg呈阴性，IgGanti-HBc呈阳性至少6个月。病例-对照人群个体均不存在亲缘关系。所有患者均已签署知情同意书，且本研究经放射与辐射医学研究所伦理委员会批准执行。发掘阶段包括：广西病例-对照人群、江苏病例-对照人群和广东病例-对照人群。其中，广西病例-对照人群包括三部分：广西人群I(286例病例和656例对照)由血清补体C3和C4水平全基因组关联研究(参见：YangX,SunJ,GaoY,etal.Genome-wideassociationstudyforserumcomplementC3andC4levelsinhealthyChinesesubjects.PLoSGenet2012；8:e1002916.，通过参照将其全文并入本文)人群中符合本项研究入选标准的个体组成，使用IlluminaOminione芯片分型，病例人群平均年龄37.2±10.1，全部为男性个体；对照人群平均年龄37.1±10.8，全部为男性个体；广西人群II(707例病例)来自HBV相关肝癌的全基因组关联研究(参见：ZhangH,ZhaiY,HuZ,etal.Genome-wideassociationstudyidentifies1p36.22asanewsusceptibilitylocusforhepatocellularcarcinomainchronichepatitisBviruscarriers.NatGenet2010；42:755-8.，通过参照将其全文并入本文)，其中348例病例同时患有肝癌，使用Affymatrix5.0芯片分型，病例人群平均年龄43.7±11.6，男女比例为6.5；广西人群III(78例病例和74例对照)招募于广西，使用illumina中华芯片分型，病例人群平均年龄62.8±8.3，男女比例为0.34，对照人群平均年龄66.0±7.2，男女比例为0.80。江苏病例-对照人群(91例病例和203例对照)由肺癌全基因组关联研究(参见：HuZ,WuC,ShiY,etal.Agenome-wideassociationstudyidentifiestwonewlungcancersusceptibilitylociat13q12.12and22q12.2inHanChinese.NatGenet2011；43:792-6.，通过参照将其全文并入本文)对照人群中符合本项研究入选标准的个体组成，使用Affymatrix6.0芯片分型，病例人群平均年龄56.6±10.0，男女比例为4.4，对照人群平均年龄57.5±9.7，男女比例为2.3。广东病例-对照人群(89例病例和124例对照)由鼻咽癌全基因组关联研究(参见：BeiJX,LiY,JiaWH,etal.Agenome-wideassociationstudyofnasopharyngealcarcinomaidentifiesthreenewsusceptibilityloci.NatGenet2010；42:599-603.，通过参照将其全文并入本文)对照人群中符合本项研究入选标准的个体组成，使用IlluminaHuman610-Quad芯片分型，病例人群平均年龄46.3±11.1，男女比例为2.9，对照人群平均年龄47.7±13.0，男女比例为2.8。验证阶段包括四个人群：江苏病例-对照人群、广西病例-对照人群、广东病例-对照人群和北京病例-对照人群。江苏病例-对照人群(1,279例病例和1,360例对照)2004年至2009年招募自江苏省常州市，对收集的血清样本进行HBV标志物检测后，获得符合研究要求的病例对照人群。病例人群平均年龄50.5±11.1，男女比例为1.4，对照人群平均年龄50.4±11.0，男女比例为1.4。广西病例-对照人群(1,299例病例和1,067例对照)从14,327个广西个体中(广西玉林地区肝癌高危人群前瞻性队列样本，2011年2月至2012年10月招募)通过HBV标志物检测后获得，病例人群平均年龄38.2±10.7，男女比例为1.6，对照人群平均年龄38.4±12.4，男女比例为1.6。广东病例-对照人群(783例病例和560例对照)由中山三院2012年6月至2014年7月招募自广东省广州市，对收集的血清样本进行HBV标志物检测后，获得符合研究要求的病例对照人群。病例人群平均年龄39.8±14.9，男女比例为1.4，对照人群平均年龄40.7±17.0，男女比例为1.2。北京病例-对照人群(544例病例和369例对照)病例人群由北京佑安医院和302医院招募。平均年龄35.5±11.9，男女比例为3.2，对照人群平均年龄28.0±10.5，男女比例为3.8。Sequenom分型SequenomMassARRAY系统SNP分型采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术。首先对DNA模板进行多重PCR反应扩增，在扩增产物中加入SNP特异性延伸引物，进行单碱基延伸反应，该反应终止于SNP位点，因此，所得到的延伸产物因为SNP的等位基因多态性的不同，分子量也不相同，最后通过MALDI-TOFMS技术检测延伸产物的分子量，应用分析软件对分子量的差异进行判读，从而得知SNP位点的基因型。SequenomMassARRAY系统SNP分型的实验步骤主要有引物设计、引物稀释、多重PCR反应、SAP反应、去盐纯化反应、质谱分析。二、结果：1、关联分析采用SNP芯片中的方法，在发掘阶段对rs7000921进行分型。以验证其在发掘人群中的关联结果。以加性模式为例，结果显示，rs7000921C等位在对照人群中的等位频率显著高于病例人群(表2；P＝2.4×10-6)。采用Sequnome分型技术，在验证阶段对rs7000921进行分型，以验证其在验证阶段人群中的关联结果。以加性模式为例，结果显示，rs7000921C等位在对照人群中的等位频率显著高于病例人群(表2；P＝6.7×10-3，1.4×10-4，9.1×10-3和6.8×10-2)。将所有独立人群进行合并分析，结果见图1。图1rs7000921在合并所有人群后进行荟萃分析得到的森林图(Forestplot)。图1显示了每个人群的OR值(蓝色方块所处位置)和95％CI(蓝色水平线)。垂直虚线表示六个人群中的最终OR值。上面6行分别代表各个人群的数据，其下方的蓝色菱形代表合并效应值。每个蓝色方块的面积与该人群在荟萃分析中的权重成正比。荟萃分析指出联合P值为3.2×10-12，联合OR值为0.78(95％CI＝0.73-0.84)。P异质性＝0.29。由结果可知，rs7000921与HBV感染慢性化存在显著的关联，且达到了全基因组关联所需的显著性水平(P＝3.2×10-12)联合比值比(oddsratio，OR)为0.78(图1)。此外，在各人群之间不存在显著的异质性(异质性检验P值为0.29)。发明人进一步按照性别和年龄分层来检测rs7000921对HBV感染慢性化发生风险的影响。按照年龄和性别分层则没有发现遗传效应存在任何显著性差异(表3；异质性检验P值为0.26和0.088)。2、易感基因确定新鉴定的HBV感染慢性化发生相关的易感基因组区域8p21.3包括INTS10等在内的6个基因(图2)。图2显示了8p21.3区域的局部关联图。如图2所示，rs7000921及其周围SNP对应的横坐标是其所在的基因组位置(NCBI组装版本36)，纵坐标是关联P值(-log10P)。rs7000921在荟萃分析中的P值以紫色菱形显示，在GWAS阶段的P值以紫色圆形表示。其它位点的颜色代表其与rs7000921之间的LD程度：r2≥0.8的位点为红色，0.6≤r2<0.8的位点为橘黄色，0.4≤r2<0.6的位点为绿色，0.2≤r2<0.4的位点为浅蓝，r2<0.2的位点为深蓝。连锁不平衡的计算基于千人基因组2012年3月版本的亚洲人群数据。发明人分析了rs7000921基因型与1Mb范围内6个编码基因表达的相关性。图3显示了rs7000921eQTL分析结果。如图3所示，其中图a，图b分别为rs7000921在两个肝脏数据集中与附近6个编码基因(1Mb范围内)表达的相关性，纵坐标是log2变换后的mRNA表达值。第一个数据集包含实验室收集的31个HBV相关肝癌数据。其中一个样本检测失败，去除。第二个数据集基于已发表数据，包含88个肝癌数据。其中3个样本表达发生异常去除。eQTL分析使用线性回归模型分析，校正性别和年龄。也即，通过表达数量性状基因座(ExpressionQuantitativeTraitLoci，eQTL)分析，发明人在两个数据集中均发现，有且仅有INTS10基因的表达与rs7000921的基因型相关，且rs7000921保护性C等位与INTS10基因的高表达呈正相关(P＝6.8×10-3和3.1×10-3，见图3)。3、易感基因临床相关性分析发明人使用酶联反应检测了INTS10蛋白在血浆样本中的表达。图4显示了病例-对照中血浆INTS10定量结果。如图4所示。SR：自限性恢复者；PI：HBV持续性感染者，P值通过非配对的t检验计算而得。由结果可知，INTS10蛋白表达量在HBV持续性感染者血浆中显著低于自限性恢复者(图4)。进一步研究血浆INTS10表达与HBVDNA载量相关性分析，结果见图5。图5使用Pearson相关系数分别评估了HBeAg阳性和阴性个体INTS10含量与HBVDNA载量的相关性。由结果可知，在持续性感染者的血浆样本中，INTS10的表达与HBVDNA载量呈负性相关，且在HBVe抗原(hepatitisBeantige，HBeAg)阳性个体中，该相关性更强(图5)。4、易感基因抗病毒效应1.1过表达INTS10对HBV的影响1.1.1INTS10过表达抑制HBVDNA的复制为了验证INTS10过表达后对HBVDNA的影响，发明人在正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2中瞬时共转染PLV-INTS10-EGFP-N质粒和pAAV-1.2HBV质粒，在肝癌细胞系HepG2.2.15中瞬时转染PLV-INTS10-EGFP-N质粒。转染72h后收集细胞，提取细胞内的HBVDNA，使用荧光定量PCR的方法检测细胞内HBVDNA的载量。结果见图6，图6为过表达INTS10抑制HBVDNA的复制的实验结果。在图6中，(a)在L-02细胞中，采用qRT-PCR定量检测INTS10过表达后HBVDNA的复制情况，**P<0.01；(b)在HepG2细胞中，采用qRT-PCR定量检测INTS10过表达后HBVDNA的复制情况，***P<0.001；(c)在HepG2.2.15细胞中，采用qRT-PCR定量检测INTS10过表达后HBVDNA的复制情况，***P<0.001；(d)在L-02细胞中，采用Southernblot检测INTS10过表达后的HBV复制中间体DNA；(e)在HepG2.2.15细胞中，采用Southernblot检测INTS10过表达后的HBV复制中间体DNA。结果显示，L-02细胞中INTS10过表达组的HBVDNA是其对照组的63.7％(图6a)，差异有统计学显著性(P<0.05)；HepG2细胞中INTS10过表达组的HBVDNA是其对照组的52.6％(图6b)，差异有统计学显著性(P<0.05)；HepG2.2.15细胞中INTS10过表达组的HBVDNA是对照组的39.5％(图6c)，差异有统计学显著性(P<0.05)。为了观测细胞内HBV复制中间体的情况，发明人使用地高辛标记的Southernblot实验来检测细胞中HBV复制中间体各个形态的DNA复制情况。本实验仅在L-02细胞和HepG2.2.15细胞中进行。结果显示，在两种细胞系中过表达INTS10均可抑制HBV复制中间体各个形态DNA(图6d、6e)。1.1.2INTS10过表达下调HBVRNA的表达INTS10过表达可以抑制HBV复制中间体DNA，那么其是否也同样可以抑制HBVRNA的表达呢？为此发明人在正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2中共转染PLV-INTS10-EGFP-N质粒和pAAV-1.2HBV质粒，在肝癌细胞系HepG2.2.15中转染PLV-INTS10-EGFP-N质粒。转染72h后收集细胞，提取细胞总RNA，反转录后使用qRT-PCR的方法检测HBVpgRNA和preS/SRNA的表达变化情况。结果见图7，图7显示了过表达INTS10可抑制HBVRNA的表达。在图7中，(a)在L-02细胞中，采用qRT-PCR检测INTS10过表达后HBVperS/SRNA和pgRNA的表达，***P<0.001；(b)Q-PCR定量检测在HepG2细胞中，采用qRT-PCR检测INTS10过表达后HBVperS/SRNA和pgRNA的表达，***P<0.001；(c)在HepG2.2.15细胞中，采用qRT-PCR检测INTS10过表达后HBVperS/SRNA和pgRNA的表达，***P<0.001；(d)在L-02细胞中，采用Southernblot检测INTS10过表达后的HBVperS/SRNA和pgRNA表达；(e)在HepG2.2.15细胞中，采用Southernblot检测INTS10过表达后的HBVperS/SRNA和pgRNA表达。结果显示，L-02细胞中INTS10过表达组HBVpgRNA和preS/SRNA的表达分别是对照组的24.1％和3.2％(图7a)，差异有统计学显著性(P<0.05)；HepG2细胞中INTS10过表达组HBVpgRNA和preS/SRNA的表达分别是对照组的12.1％和7.7％(图7b)，差异有统计学显著性(P<0.05)；HepG2.2.15细胞中INTS10过表达组HBVpgRNA和preS/SRNA的表达分别是对照组的6.8％和8.8％(图7c)，差异有统计学显著性(P<0.05)。除了采用qRT-PCR的方法来检测HBVpgRNA和preS/SRNA的表达外，同时发明人还使用地高辛标记的Northernblot实验来验证L-02细胞和HepG2.2.15细胞中HBVRNA各个转录本的表达情况，结果显示，在L-02细胞和HepG2.2.15细胞中过表达INTS10均可抑制HBVRNA各个转录本的表达(图7d、7e)。1.1.3过表达INTS10对HBsAg和HBeAg分泌的抑制上述实验发现过表达INTS10可以抑制HBVDNA复制和HBVpgRNA和preS/SRNA的表达，为了进一步的了解是否INTS10也同样可以抑制HBVHBsAg和HBeAg的分泌，发明人在正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2中共转染PLV-INTS10-EGFP-N质粒和pAAV-1.2HBV质粒，在肝癌细胞系HepG2.2.15中转染PLV-INTS10-EGFP-N质粒。转染72h后收集细胞的上清，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法检测HBsAg和HBeAg的分泌情况。结果见图8。图8显示了INTS10过表达抑制HBsAg和HBeAg的分泌。在图8中，(a)在L-02细胞中，采用ELISA检测INTS10过表达后HBVHBsAg和HbeAg的分泌，***P<0.001；(b)在HepG2细胞中，采用ELISA检测INTS10过表达后HBVHBsAg和HbeAg的分泌，***P<0.001；(c)在HepG2.2.15细胞中，采用ELISA检测INTS10过表达后HBVHBsAg和HbeAg的分泌，n.s.，无统计学差异。结果显示，L-02细胞中INTS10过表达组HBVHBsAg和HBeAg的表达量分别是对照组的17.1％和7.5％(图8a)，差异有统计学显著性(P<0.05)；HepG2细胞中INTS10过表达组HBVHBsAg和HBeAg的表达量分别是对照组的26.2％和14.0％(图8b)，差异有统计学显著性(P<0.05)；但HepG2.2.15细胞中INTS10过表达组HBsAg和HBeAg的表达量与对照组无显著的统计学差异(图8c)。1.2干扰内源性INTS10的表达对HBV的影响1.2.1内源性INTS10的下调可促进HBVDNA的复制上述实验显示，在多株肝细胞系中过表达INTS10可抑制细胞内HBVDNA的复制、HBVRNA的表达以及HBsAg和HBeAg的分泌(HepG2.2.15细胞系除外)。为了更进一步的了解INTS10的抗病毒功能，发明人干扰INTS10后观察HBV各项指标的变化。首先，在正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2中瞬时转染INTS10的两个干扰片段和一个阴性对照干扰片段，转染后siRNA36h后，细胞换液再瞬时转染pAAV-1.2HBV质粒。在肝癌细胞系HepG2.2.15中，只需转染INTS10的干扰片段和阴性对照干扰片段，无需转染HBV质粒。72h后收集细胞，提取细胞内HBVDNA，使用qRT-PCR的方法检测DNA的拷贝数。结果见图9。图9显示了沉默肝细胞中INTS10的表达可以促进HBV的复制。在图9中，(a)在L-02细胞中，采用qRT-PCR定量检测INTS10敲低后HBVDNA的复制情况，*P<0.05，**P<0.01；(b)在HepG2细胞中，采用qRT-PCR定量检测INTS10过表达后HBVDNA的复制情况，**P<0.01，***P<0.001；(c)在HepG2.2.15细胞中，采用qRT-PCR定量检测INTS10过表达后HBVDNA的复制情况，**P<0.01，***P<0.001；(d)在HepG2.2.15细胞中，采用Southernblot检测INTS10敲低后的HBV复制中间体DNA。结果显示，在L-02细胞中，INTS10两个干扰片段组的HBVDNA分别是对照组的118.7％±4.0％和129.8％±6.3％(图9a)，差异有统计学显著性(P<0.05)；在HepG2细胞中，INTS10两个干扰片段组的HBVDNA分别是对照组的186.5％±5.0％和139.1％±9.6％(图9b)，差异有统计学显著性(P<0.05)；在HepG2.2.15细胞中，INTS10两个干扰片段组的HBVDNA分别是对照组的136.9％±1.1％和133.4％±6.9％(图9c)，差异有统计学显著性(P<0.05)。为了观测HBV复制中间体的情况，发明人还使用地高辛标记的Southernblot实验来检测L-02、HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体的形态。结果显示，在L-02、HepG2.2.15细胞中敲低INTS10可以促进细胞内HBV复制中间体DNA的量(图9d、9e)。1.2.2内源性INTS10减少可上调HBVRNA的表达通过干扰内源性INTS10的表达，发现INTS10的表达下调可以促进HBVDNA的复制。为此，发明人进一步想要验证INTS10的表达下调是否可以促进HBVRNA的表达。同样在正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2中转染INTS10的干扰片段，转染siRNA36h后，细胞换液后再转染pAAV-1.2HBV质粒。而在肝癌细胞系HepG2.2.15中只转染INTS10的干扰片段。72h后收集细胞，提取细胞内总RNA,反转录成cDNA。以cDNA为模板，用qRT-PCR的方法检测HBVRNA的表达情况。结果见图10。图10显示了敲低细胞中INTS10的表达可以促进HBVRNA的表达。在图10中，(a)在L-02细胞中，采用qRT-PCR检测敲低INTS10后HBVperS/SRNA和pgRNA的表达，***P<0.001；(b)在HepG22细胞中，采用qRT-PCR检测敲低INTS10后HBVperS/SRNA和pgRNA的表达，**P<0.01、***P<0.001；(c)在HepG2.2.15细胞中，采用qRT-PCR检测敲低INTS10后HBVperS/SRNA和pgRNA的表达，**P<0.01、***P<0.001；(d)左：在L-02细胞中，采用Northernblot检测敲低INTS10后HBVRNA的表达；右：在HepG2.2.15细胞中，采用Northernblot检测敲低INTS10后HBVRNA的表达。结果显示，在L-02细胞中INTS10两个干扰片段组的HBVpgRNA和preS/S的表达分别是对照组的515.9％±4.3％、280.0％±15.0％和333.5％±1.5％、165.4％±0.8％(图10a)，差异有统计学显著性(P<0.05)；在HepG2细胞中INTS10两个干扰片段组的HBVpgRNA和preS/S的表达分别是对照组的234.0％±2.5％、165.3％±3.3％和252.3％±4.38％、180.0％±7.3％(图10b)，差异有统计学显著性(P<0.05)；在HepG2.2.15细胞中INTS10两个干扰片段组的HBVpgRNA和preS/S的表达分别是对照组的145.7％±4.6％、155.1％±5.8％和164.8％±3.9％、145.3％+15.3％(图10c)，差异有统计学显著性(P<0.05)。为了观测HBVRNA剪接体的情况，发明人也使用地高辛标记的Nothernblot实验来检测L-02细胞和HepG2.2.15细胞中HBVRNA剪接体的表达情况。结果显示，在L-02细胞和HepG2.2.15细胞中敲低INTS10均可促进HBVRNA的表达(图10d)。1.2.3内源性INTS10下调促进HBsAg和HBeAg的分泌INTS10的表达下调可以促进HBVDNA的复制和HBVRNA的表达，因此发明人进一步观察INTS10的下调是否也可以促进HBsAg、HBeAg的分泌。在正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2中，先转染INTS10的干扰片段，转染36h后再转染pAAV-1.2HBV质粒，然后将细胞继续培养72h。HepG2.2.15肝癌细胞中只需转染INTS10的干扰片段，继续培养72h。收集细胞的上清，采用ELISA的方法检测HBsAg和HBeAg的分泌情况。结果见图11。图11显示了敲低肝细胞中INTS10的表达可促进HBsAg和HBeAg的分泌。在图11中，(a)在L-02细胞中，采用ELISA检测敲低INTS10后HBVHBsAg和HbeAg的分泌，***P<0.001；(b)在HepG2细胞中，采用ELISA检测敲低INTS10后HBVHBsAg和HbeAg的分泌，***P<0.001；(c)在HepG2.2.15细胞中，采用ELISA检测敲低INTS10后HBVHBsAg和HbeAg的分泌。结果显示，在L-02细胞中INTS10敲低组的HBsAg和HBeAg的分泌分别是对照组的241.8％±2.1％、183.2％±3.5％和295.4％±0.6％、229.1％±0.6％(图11a)，差异有统计学显著性(P<0.05)；在HepG2细胞中，INTS10敲低组的HBsAg和HBeAg的分泌分别是对照组的160.7％±10.3％、179.1％±5.0％和130.1％±1.6％、180.9％±4.1％(图11b)，差异有统计学显著性(P<0.05)；在HepG2.2.15细胞中，INTS10敲低组的HBsAg和HBeAg的分泌与对照组相比变化幅度稍小，这可能与细胞特异性的抗病毒作用有关(图11c)。发明人进一步探索INTS10抗HBV复制的分子机制。INTS10是整合因子复合体(Integratorcomplex)家族中的一员。整合因子复合体参与小核RNA的加工，对mRNA前体的剪接至关重要，能够影响mRNA的持续合成能力和表达水平。但是，整合因子复合体如何在HBV感染过程中发挥作用尚未见报道。通过组学数据，发明人将机制研究聚焦到RLR通路，推测INTS10是通过RLR信号通路来抑制HBV的复制。为了证实发明人的推测，首先在L-02、HepG2细胞中共转染PLV-INTS10-EGFP质粒和pAAV-1.2HBV质粒或敲低细胞内源性INTS10同时转染pAAV-1.2HBV质粒，72小时后收集细胞，进行蛋白提取，来验证INTS10对RLR通路相关基因的影响。而在HepG2.2.15细胞中则只需过表达PLV-INTS10-EGFP质粒或敲低细胞内源性INTS10，72小时后收集细胞提取蛋白，同样进行RLR信号通路相关蛋白的检测。Westernblot的检测结果表明，过表达INTS10，IRF3总蛋白下调，而p-IRF3(ser396/ser386)则上调，而p65/p-p65(ser536)、IκBα/p-IκBα(ser32/36)的表达则未发生变化。相反，干扰细胞内源性INTS10表达后，p-IRF3(ser396/ser386)则下调，p65/p-p65(ser536)、IκBα/p-IκBα(ser32/36)的表达也未发生变化。发明人还在L-02、HepG2和HepG2.2.15细胞中过表达INTS10或沉默INTS10，观察ISRE的转录活性是否发生改变。报告基因结果显示过表达INTS10可激活ISRE，敲低INTS10可抑制ISRE的转录活性。这样的结果在L-02、HepG2和HepG2.2.15三个细胞系中都得到了一致的验证。下游效应分子检测结果显示，肝细胞过表达INTS10后IFN-λ的mRNA表达水平上调，沉默肝细胞内源性INTS10后IFN-λ的mRNA表达下调。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。