吡啶类衍生物(E)‑MSTC在制备治疗卵巢癌药物中的用途的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及吡啶类衍生物(e)-mstc（(e)-methyl4-styryl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline-2-carboxylate，（e）-4-苯乙烯基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-羧酸甲酯，简称（e）-mstc）在制备治疗卵巢癌药物中的用途。

背景技术：

据相关统计研究发现，卵巢癌是导致全球女性死亡率最高的妇科疾病。2012年，全球有239000例病人被确诊为卵巢癌，其中152000例死亡。在我国的妇科恶性肿瘤中，卵巢癌的发病率位居第三位，但死亡率却列居首位。导致卵巢癌高死亡率和低存活率的主要原因是其早期临床症状不明显以及晚期治疗失败率较高。卵巢癌的传统治疗手段为肿瘤细胞减灭术配合紫杉烷类(如紫杉醇)及铂类（卡铂、顺铂等）药物进行化疗。然而，长期使用传统的化疗手段除了会出现耐药性之外，还会因其缺乏专一性而对正常组织细胞造成极大的伤害，这使得超过70%的患者术后寿命少于5年，严重威胁患者生命健康。目前，对卵巢癌治疗呈现多元化的发展趋势，除主要的手术治疗，化疗，放疗外，还有分子靶向和免疫疗法等，但上述治疗方法大多不是毒副作用太大就是技术不成熟，无法有效的应用于临床。因此，开发出一种能够对卵巢癌细胞具有高效杀伤能力而对人体正常组织细胞无伤害的化合物，从而提高患者存活率是生物医药工作者努力的方向。

本发明涉及的化合物（e）-mstc为吡啶类衍生物。吡啶类化合物的研究应用范围十分广泛，主要运用于医药、农药、饲料、染料等领域，其中在医药领域内的应用十分重要，如结核病药异烟肼，中枢兴奋药尼可刹米等。本发明所涉及的化合物的制备方法已在2016年报道与tetrahedron杂志上。本发明所涉及的化合物为白色粉末，熔点为123-124℃，呈弱碱性。本发明所涉及的化合物的生物学效应，尤其在抗卵巢癌活性方面的活性尚未见到相关研究报道。因此本发明就该化合物在制备治疗卵巢癌的药物时，抗卵巢癌方面的活性进行研究。研究表明，该化合物对正常人成纤维细胞无明显影响，但可以影响卵巢癌细胞的细胞周期及凋亡，使其无法进行正常的生长，并促使卵巢癌细胞的凋亡。因此，本发明涉及的吡啶类衍生物在抗卵巢癌活性方面具有非常大的作用，并对今后卵巢癌的治疗具有很大的价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，为更好的治愈或为资料卵巢癌提供一种可行的选择，本发明的发明人经过大量创造性的劳动，筛选出一种化合物（e）-mstc，在抗卵巢癌活性方面的具有很好的抑制作用，进而为治疗卵巢癌或诱导卵巢癌细胞的凋亡提供了新的疗法或手段。

本发明首先提供一种吡啶类衍生物在制备治疗癌症药物中的应用，其中所述的吡啶类衍生物为(e)-methyl4-styryl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline-2-carboxylate，（e）-4-苯乙烯基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-羧酸甲酯，简称（e）-mstc，其化学结构式如下：

。

其中，上面所述的癌症为卵巢癌；

其中所述应用为抑制癌细胞增殖，具体的，所述应用为阻滞细胞周期；

其中所述应用还有促进癌细胞凋亡；具体的，所述的应用为促进卵巢癌细胞晚期凋亡。

本发明还提供一种治疗癌症的药物，所述药物中的有效成分为吡啶类衍生物为7-methyl-2,4-diphenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氢喹啉,简称7-mdt。

其中所述的药物还包括药学上可接受的载体或辅料，所述载体和/或辅料为本领域技术人员所知晓，在此不做赘述。

其中所述药物为抑制癌细胞增殖的药物，具体的，所述药物为阻滞癌细胞周期的药物；

其中所述药物还可以为促进癌细胞凋亡的药物；具体的，所述的药物为促进卵巢癌细胞晚期凋亡的药物。

本发明通过对一系列化合物进行生物学活性筛选，筛选出候选化合物，并研究其在抗卵巢癌活性方面的相关作用。本发明所涉及的筛选细胞为卵巢癌a2780细胞。通过筛选，得到对卵巢癌细胞具有明显抑制作用的化合物（e）-mstc。

本发明筛选出的化合物（e）-mstc进一步通过体外mtt抗肿瘤活性实验和细胞周期检测进行凋亡活性测定，得到其对卵巢癌细胞和人正常成纤维细胞的增殖、细胞周期凋亡和的影响。结果表明，该化合物的抗癌活性非常显著。

本发明筛选出的化合物（e）-mstc可以有效抑制卵巢癌细胞生长，且对正常人成纤维细胞生长影响较小。

本发明通过体外mtt抗肿瘤活性实验证实，该化合物对正常人成纤维细胞的增殖影响不大，但对卵巢癌a2780和skov3细胞的增殖抑制十分明显，其1c50值作用浓度分别为83.0μm和105.8μm(ibmspssstatistics19)，在同等实验条件下，正常人成纤维imr90细胞无较大影响（细胞死亡率小于20%）。细胞周期检测结果表明，该化合物作用于卵巢癌a2780细胞时，使其g0/g1期过程受阻，细胞在g1期明显减少,并在g2/m期堆积，从而影响正常的细胞周期，抑制细胞增殖；细胞凋亡结果显示，该化合物作用于a2780细胞时，可引起细胞的早期凋亡明显增多，晚期凋亡也受到一定的影响，从而促进细胞的凋亡。以上研究证明化合物（e）-mstc具有明显的抑癌活性，在对卵巢癌的研究和治疗方面具有非常大的潜在价值，可以进一步对其进行抗卵巢癌药物的制备。

本发明的有益效果：本发明中所述的化合物（e）-mstc在抑制卵巢癌细胞增殖的同时，对正常细胞的增殖影响很小或无影响。相比于传统化疗药物对正常细胞的毒副作用（导致患者存活率低的一个主要因素），（e）-mstc对正常细胞的毒性大大减小。本发明所述化合物是通过改变卵巢癌细胞的细胞周期及促进细胞早期晚期凋亡来达到抑制卵巢癌细胞的增殖的。相对于紫杉醇主要作用于g2/m期及顺铂主要诱导细胞凋亡而言，本发明所述化合物可同时作用于细胞周期和细胞凋亡，具有明显优势。综上所述，本发明具有明显优于传统治疗的优势，在未来研究制备抗卵巢癌药物过程中具有更大的潜力。

附图说明

图1：不同化合物对卵巢癌a2780细胞的影响。

图2：（e）-mstc作用于卵巢癌a2780细胞，三次平行实验后统计所得的生长抑制曲线。其中，横坐标为化合物作用浓度，单位为µm，纵坐标为细胞存活率。

图3：（e）-mstc作用于卵巢癌skov3细胞，三次平行实验后统计所得的生长抑制曲线。其中，横坐标为化合物作用浓度，单位为µm，纵坐标为细胞存活率。

图4：（e）-mstc作用于正常人成纤维imr90细胞后，三次平行实验后统计所得的生长抑制曲线。其中，横坐标为化合物作用浓度，单位为µm，纵坐标为细胞存活率。

图5：分别用0µm、60µm剂量的（e）-mstc处理卵巢癌a2780细胞48h后pi染色的流式细胞检测图（图5上半部分）及三次平行实验后细胞周期统计图（图5下半部分）。

图6：分别0µm、60µm剂量的（e）-mstc处理卵巢癌a2780细胞96h后经pi/annexinv染色的流式细胞检测图（图6上半部分）及三次平行实验后细胞凋亡统计图（图6下半部分）。

具体实施方式

本发明所涉及的具体化合物为吡啶类衍生化合物（e）-mstc，通过下面的实施例做进一步详细的说明，下述非限制性实施例不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。

本发明所涉及的具体化合物（e）-mstc的制备方法请参见chunyinzhu*,benweibi,yading,tezhang,qiu-yunchen.iodine-catalyzedaerobicoxidativeformal[4+2]annulationfortheconstructionofpolyfunctionalizedpyridines.tetrahedron.2016,72(5),779.本发明涉及的化合物均由该论文作者提供。

实施例1.细胞的培养和传代

卵巢癌a2780、skov3细胞(购于americantypeculturecollection)体外分别培养于含10%胎牛血清及青霉素（100u/ml）-链霉素（100μg/ml）的dmem(购于lifetechnologies公司，美国)培养基和含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的rmpi-1640培养基中；人成纤维imr90细胞(购于americantypeculturecollection)培养于含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的专用dmem培养基中。中。每天定期观察细胞生长状态，待长满培养皿时及时传代（一般在贴壁细胞表面积占80%及以上时传代）。当细胞培养和传代效果良好时进行下一步实验。

其中所述专用dmem培养基500ml=1ml维生素(100×，购于lifetechnologies，美国)+5ml丙酮酸酯(100nm，购于lifetechnologies，美国)+2ml氨基酸(50×，购于lifetechnologies，美国)+1ml非必需氨基酸(100×，购于lifetechnologies，美国)+491mldmem培养基。

实施例2.mtt检测不同化合物对细胞存活率的影响

第一步：在底面直径为6cm的培养皿中培养卵巢癌a2780细胞，传代良好后，弃原培养液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的dmem，取溶液200g离心5min，弃上清，加含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的dmem培养基吹打混匀，取0.5ml到ep管，用移液枪吸取10µl于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。每孔种2×10⁴个细胞，一共11组孔，每组3个复孔，将细胞种到24孔板中，每孔吹打混匀。放入co2恒温培养箱（thermoscientific，37℃）静止培养24h，使其贴壁。

第二步：加入浓度约为100μm的表1所示化合物的dmso溶液。将一定量的化合物溶解于无菌干净的dmso溶液中，保持每孔所加的化合物溶液的体积保持不变，空白对照加等体积的培养液。放入co2恒温培养箱（37℃）静止培养48h。

表1中所示化合物分别为：

a：4-（2-氟苯基）-5,6,7,8-四氢喹啉-2-羧酸甲酯；

b：4-苯基吡啶-2,6-二羧酸2-乙基-6-甲酯；

c：正丁醛；

d：3，5-二甲基-1-甲苯磺酰基-1-氢-吡唑；

e：3,5-二甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯；

f：5-氨基-4-氰基-3-苯基-1h-吡唑-1-羧酸苄酯；

g：5-氨基-1-甲基-3-（4-硝基苯基）-1h-吡唑-4-甲腈；

h：5-氨基-1,3-二苯基-1h-吡唑-4-甲腈；

i：1-甲基-5-氧代-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-4-羧酸乙酯；

和（e）-mstc。各化合物的化学结构式如表1。所选化合物多为吡唑类和吡啶类化合物，这些化合物在医药领域的应用比较广泛，并且所筛选化合物多数未进行生物学评价。

表1.各化合物的化学结构式

第三步：将培养48h后的细胞取出，吸去培养基，分别加入100µl含10%mtt的dmem培养基（mtt浓度为5mg/ml），放入co2恒温培养箱（37℃）反应1.5~2h，待细胞染成蓝紫色后吸去培养基，加入0.5ml的dmso并轻轻震荡使结晶溶解。选择550nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组od值/对照组od值）×100%。

不同化合物对卵巢癌a2780细胞作用后的吸光度值见表2所示。

表2.不同化合物对卵巢癌a2780细胞作用后的吸光度值

三次平行实验后统计结果如图1所示：不同的化合物对卵巢癌a2780细胞的增殖影响不同，在作用浓度约为100µm时，其中（e）-mstc化合物对卵巢癌a2780细胞的增殖抑制效果最明显。

实施例3.mtt检测细胞存活率

第一步：在底面直径为6cm的培养皿中培养卵巢癌a2780、skov3细胞和正常人成纤维imr90细胞，传代良好后，弃原培养液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的dmem(或rmpi-1640,imr90专用dmem)培养基吹打混匀，取溶液200g离心5min，弃上清，加含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的dmem(或rmpi-1640，imr90专用dmem)培养基吹打混匀，取0.5ml到ep管，用枪吸取10µl于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。每孔种3500个细胞（imr90细胞每孔2000个），一共7组孔，每组3个复孔，将细胞种到96孔板中,每孔吹打混匀。并设立空白对照组，加等体积的细胞培养液。放入co2恒温培养箱（thermoscientific，37℃）静止培养24h，使其贴壁。

第二步：加不同浓度的（e）-mstc化合物dmso溶液。将化合物按不同比例稀释于无菌干净的dmso溶液中，保持每孔所加的化合物稀释液的体积保持不变，所加浓度分别为10µm、20µm、50µm、100µm、200µm、300µm，对照加等体积的dmso溶液。放入co2恒温培养箱（37℃）静止培养48h。

第三步：将培养48h后的加药细胞取出，吸去培养基，分别加入10µlmtt（5mg/ml），放入co2恒温培养箱（37℃）反应1.5~2h，待细胞染成蓝紫色后吸去培养基，加入0.1ml的dmso并轻轻震荡使结晶溶解。选择550nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组od值/对照组od值）×100%，用spss软件计算求出ic50值(细胞数量减少一半时所需化合物浓度)。

（e）-mstc作用于卵巢癌a2780、skov3细胞及人正常纤维imr90细胞后的mtt结果吸光度值分别如表3、4、5所示。

表3.（e）-mstc作用于卵巢癌a2780后的mtt结果吸光度值

表4.（e）-mstc作用于卵巢癌skov3细胞后的mtt结果吸光度值

表5.（e）-mstc作用于人正常纤维imr90细胞后的mtt结果吸光度值

三次平行实验后统计所得的生长抑制曲线实验结果显示：化合物对卵巢癌细胞及正常人成纤维细胞的增殖影响不同。如图2所示，化合物（e）-mstc对卵巢癌a2780细胞生长的抑制呈浓度依赖关系，ic50为83.0µm。如图3所示，化合物（e）-mstc对卵巢癌skov3细胞生长的抑制也同样呈浓度依赖关系，ic50为105.8µm。如图4所示，该化合物对正常人成纤维imr90细胞生长无明显影响。

实施例4.流式细胞仪检测细胞周期

第一步：底面直径6cm培养皿的卵巢癌a2780细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的dmem培养基吹打混匀，200g离心5min，弃上清，加含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的dmem培养基吹打混匀，取0.5ml到ep管，用枪吸取10µl于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。取底面直径6cm的细胞培养皿，每碟种1.5×10⁵个细胞,每组3碟。放入co2恒温培养箱（37℃）静止培养24h，使其贴壁。

第二步：分别取0µm、60µm化合物（e）-mstc剂量加入实验组细胞中，对照组加入等体积的dmso和培养基。放入co2恒温培养箱（37℃）静止培养48h。

第三步：将培养48h后的细胞取出，吸去培养基，分别取0.5ml的pbs清洗，吸去pbs，加0.5ml胰酶消化，加0.5ml相应培养基终止消化，延孔壁吹洗，转至ep管，重复用0.5ml培养基洗一次，减少细胞残余。转至4℃冰盒，并在4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。每管加300μl4℃预冷的pbs，混匀，4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。每管滴加0.5ml-20℃预冷的70%的乙醇，混匀，放入4℃冰箱保存至少24h。

第四步：从4℃取出待处理的细胞，4℃冷冻离心机中500g离心5min，弃上清，刮匀。每管加300μl4℃预冷的pbs,混匀，4℃冷冻离心机中500g离心5min。弃上清，刮匀，每管加500μlpi染色液（485μlpbs+10μl1mg/ml的pi+5μl1mg/ml的rnase），吹打4-5次混匀，转至周期检测管，避光中37℃水浴锅中孵育1h。流式细胞仪检测细胞周期。

实验结果显示：化合物（e）-mstc对卵巢癌a2780细胞周期有一定的阻滞作用，如图5所示，在60µm浓度下，a2780细胞的g0/g1期略微受到阻滞，使其停留在g2/m期，证明该化合物对卵巢癌a2780细胞具有一定的周期阻滞能力，从而抑制细胞的增殖。

实施例5.流式细胞检测细胞凋亡检测

第一步：底面直径6cm培养皿的卵巢癌a2780细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的dmem培养基吹打混匀，200g离心5min，弃上清，加含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的dmem培养基吹打混匀，取0.5ml到ep管，用枪吸取10µl于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。取底面直径6cm的细胞培养皿，每碟种1.5×10⁵个细胞,每组3碟。放入co2恒温培养箱（37℃）静止培养24h，使其贴壁。

第二步：分别取0µm、60µm剂量的化合物（e）-mstc加入实验组细胞中。放入co2恒温培养箱（37℃）静止培养96h。

第三步：将a2780细胞从6cm碟消化离心，收集所有的上清液。转至4℃冰盒，并在4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。将上清离心后的细胞和相应消化下来的细胞全部合并，用0.5ml预冷pbs洗涤，4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。每管加500ul4℃预冷的pbs，混匀，重复上述操作。加入100μl1×bindingbuffer重悬细胞，加入5μlannexinv-fitc和5μlpistainingsolution，轻轻摇匀(细胞凋亡试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司)。避光，室温反应10min，加入400μl1×bindingbuffer，混匀，1h内送流式细胞仪检测。

实验结果显示，化合物（e）-mstc对卵巢癌a2780细胞具有诱导凋亡的作用，如图6所示，在60µm的化合物浓度下，诱导卵巢癌a2780细胞的早期凋亡及晚期凋亡，从而可以得出结论，该化合物是通过诱导细胞的晚期凋亡来抑制癌细胞生长的。