本发明涉及三苯基新木脂素类化合物的应用，尤其涉及含有红花八角醇(dunnianol)、大花八角醇(macranthol)及其衍生物为有效成分在制备抗万古霉素耐药肠球菌中(vancomycin-resistantenterococcus，vre)药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
肠球菌属细菌(enterococcusspp.)是临床常见革兰氏阳性条件致病菌，主要引起的院内感染包括手术伤口感染、泌尿系统感染、腹腔感染、败血症等严重感染，当患者在原有严重基础疾病及机体免疫力降低时，极易侵入体内或易位，导致局部或全身重症感染，给临床治疗带来困难。以粪肠球菌(enterococcusfaecalis)和屎肠球菌(enterococcusfaecium)为代表的肠球菌属细菌已被列为院内感染革兰氏阳性球菌中仅次于葡萄球菌的第二大病原菌。
肠球菌细胞壁厚，对多种抗生素固有耐药。此外，肠球菌还可通过携带耐药基因的质粒及转座子产生获得性耐药。1988年英国首次分离出耐万古霉素粪肠球菌和屎肠球菌后，万古霉素耐药肠球菌(vre)开始在全球不同国家和地区出现，且分离率逐年上升。由于万古霉素耐药肠球菌能够同时携带多种耐药基因，对大多数抗生素表现耐药，因此严重威胁临床抗感染治疗。糖肽类抗生素万古霉素是临床治疗耐药肠球菌阳性球菌感染的最有效药物，也被称为最后一道防线。美国疾病控制与预防中心(cdc)2013年抗生素耐药性威胁报告将vre列为严重威胁等级(严重威胁，seriousthreat)。
红花八角醇，大花八角醇是自八角属(illicium)植物茎叶中分离得到的一种三苯基新木脂素类化合物。其提取分离操作简便，因此，由其生产的抗菌药物或其衍生物具有成本低，安全性高的特点。目前未见将其应用于制备抗万古霉素耐药肠球菌(vre)药物中的相关报道。
技术实现要素：
本发明目的在于提供含有化合物红花八角醇或大花八角醇为有效成分的药物在制备治疗抗万古霉素耐药肠球菌(vre)中的应用。
为实现本发明目的，本发明人在长期从事抗菌天然药物研究与开发的基础上，对初筛的几种抗菌活性较好的药用植物进行活性追踪，从中分离得到2个具有显著抗肠球菌活性的天然产物红花八角醇，大花八角醇。发现红花八角醇，大花八角醇及其衍生物作为有效成分在治疗抗万古霉素耐药肠球菌(vre)上有较好的效果。
本发明所说的三苯基新木脂素类化合物为红花八角醇，大花八角醇及其衍生物，其化学通式如下：
其中r1为h或oh，r2为h或oh。
优选如下式(1)、(2)化合物：
红花八角醇，大花八角醇提取方法：在典型的分离方法中，将包含该化合物的植物与一种或多种有机试剂一起粉碎以形成一种或多种植物提取物，然后纯化该提取物以得到化合物。本发明化合物得自八角属植物，特别是得自八角属植物野八角(illiciumsimonsii)，红花八角(illiciumdunnianum)或文山八角(illiciumtsaii)中提取分离得到。其它八角属植物种例如华中八角(illiciumfargesii)也可用于提取本发明化合物。本发明从天然来源分离红花八角醇，大花八角醇。
本发明化合物所采用的制备方法均为公认技术，在各种文献中均可查阅到。
在针对抗万古霉素耐药肠球菌方面，本发明所述化合物具有比现有技术有更好的活性，例如在发明人进行的实验中，发现所述化合物具有对β-内酰胺类、大环内脂类、氟喹诺酮类和四环素类耐药的菌株在内的所有多药抗药性菌株的显著活性。可以将本化合物直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有质量百分比0.1-99％本发明化合物，优选为0.5-90％，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明药物组合物以单位体重服用量或涂膜剂的形式使用。红花八角醇，大花八角醇及其衍生物的组合物采用制药领域公认的方法制备成各种剂型。如液体制剂(注射液、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等)、喷剂、气雾剂、软膏剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射，静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行细菌感染的治疗。
本发明优点：所得红花八角醇，大花八角醇及其衍生物分离自植物天然产物，显示出对革兰氏阳性球菌的抗菌活性，尤其针对临床治疗困难的万古霉素耐药肠球菌(vancomycin-resistantenterococcus，vre)。作为有效成分将其应用在制备治疗vre药物中具有较好的效果。有利于新型抗vre感染药物的研发。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：以下所述百分比均为质量百分比。
实施例1：红花八角醇(1)，大花八角醇(2)的提取分离纯化：
采集野八角茎叶，阴干，其学名经鉴定为illiciumsimonsiimaxim.，粉碎。取7.0kg阴干、粉碎的野八角茎叶，用95％乙醇回流提取3次，每次40l，每次3小时，过滤液浓缩至小体积，加水3l使悬浮，分别用氯仿(3l×3)和正丁醇(3l×4)萃取，减压蒸馏得到氯仿部分(300g)和正丁醇部分(300g)。氯仿部分经硅胶柱层析，石油醚/乙酸乙酯(90∶10，80∶20，70∶30)梯度洗脱。其中对石油醚：乙酸乙酯＝80:20洗脱部分合并得流分a。对流分a可经两种方法进一步分离。(1)流分a经硅胶柱层析，石油醚：丙酮＝90：10，85：15梯度洗脱，tlc检测合并得到红花八角醇，大花八角醇；(2)以反相rp-c18柱层析，以甲醇：水＝60：40，70：30梯度洗脱，tlc检测合并得到红花八角醇，大花八角醇。
结构测定：旋光由jascodip-370旋光仪测定；红外光谱(ir)采用kbr压片法，由bio-radfts-135型红外光谱仪测定；核磁共振谱(1h-、13c-nmr、dept)用bruckeram-400型和drx-500型超导核磁共振仪测定、tms(四甲基硅烷)作内标；质谱(ms)用vgautospec-3000型质谱仪测定；薄层色谱硅胶、柱层析硅胶(200-300目)购自青岛海洋集团有限公司。
uv(甲醇)：λmax(1ogε)＝320(2.39),295(2.69),216(3.41)。
ir(溴化钾)：irvmax(kbr)cm-1：3250，3070，2975，2870，1640，1498，1405。
ei-msm/z(％):398([m]+，100)，369(15)，316(20)，298(18)。
1h-nmr(500mhz，cdcl3)：δ:7.13(2h，s，h-3，h-5)，7.11(2h，d，j＝10.0hz，h-5'，h-5″)，7.09(2h，s，h-3'，h-3″)，6.85(2h，d，j＝10.0hz，h-6'，h-6″)，6.00(3h，m，h-8，h-8'，h-8″)，5.95(4h，m，h-9，h-9″)，5.13(2h，m，h-9)，3.37(6h，d，j＝8.5hz，h-7，h-7'，h-7″)。
13c-nmr(125mhz，cdcl3)δ:147.6(s，c-1)，125.8(s，c-2，c-6)，131.4(d，c-3，c-5)，133.8(s，c-4)，39.4(t，c-7)，137.3(d，c-8)，116.1(t，c-9)，150.9(s，c-1'，c-1″)，124.8(s，c-2'，c-2″)，131.6(d，c-3'，c-3″)，133.2(s，c-4'，c-4″)，129.7(d，c-5'，c-5″)，117.0(d，c-6'，c-6″)，39.4(t，c-7'，c-7″)，137.5(d，c-8'，c-8″)，115.8(t，c-9'，c-9″)。
uv(甲醇)：λmax(1ogε)＝295(2.73),214(3.28),204(3.29)。
ir(溴化钾)：irvmax(kbr)cm-1：3434，3217，1637，1498，1468，1174，913cm-1。
ei-msm/z(％):398([m]+，100)，369(15)，316(20)，298(18)。
1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ:7.29(1h，d，j＝2.2hz，h-2)，7.25(1h，d，j＝2.2hz，h-6)，7.14(1h，dd，j＝8.1，2.2hz，h-4″)，7.10(1h，d，j＝2.2hz，h-6″)，7.04(1h，d，j＝2.2hz，h-6')，7.03(1h，overlaped，h-4')，6.94(1h，d，j＝8.1hz，h-3″)，6.88(1h，dd，j＝7.2，1.8hz，h-3')，6.05(1h，m，h-8)，5.98(1h，m，h-8″)，5.93(1h，m，h-8')，5.17(2h，m，h-9)，5.03-5.10(2h，overlaped，h-9')，5.03-5.10(2h，overlaped，h-9″)。
13c-nmr(125mhz，cdcl3)δ:130.1(s，c-1)，130.9(d，c-2)，128.3(s，c-3)，150.9(s，c-4)，124.8(s，c-5)，130.0(d，c-6)，35.0(t，c-7)，136.2(d，c-8)，116.7(t，c-9)，127.5(s，c-1')，150.8(s，c-2')，115.8(d，c-3')，128.9(d，c-4')，132.4(s，c-5')，130.3(d，c-6')，39.3(t，c-7')，137.4(d，c-8')，115.9(t，c-9')，123.3(s，c-1″)，151.2(s，c-2″)，116.8(d，c-3″)，130.2(d，c-4″)，133.4(s，c-5″)，131.3(d，c-6″)，39.4(t，c-7″)，137.7(d，c-8″)，115.6(t，c-9″)。
实施例2.红花八角醇，大花八角醇的体外抗菌活性实验
微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,mic):
实验方法：参照clsim07-a9文件关于稀释法抗菌药物敏感性试验方法标准，测定本发明药物对vre临床株的最低抑菌浓度。该实验中，本发明药物的溶解剂为dmso，稀释剂为纯水，dmso终浓度≤1％；受试药物稀释检测范围为8-0.015μg/ml；粪肠球菌atcc29212为质控菌株。具体方法如下：按照倍比稀释法，将抗菌药物原液用mh肉汤稀释成10个梯度，依次加入96孔细胞培养板前10个孔中，每孔100μl。用mh肉汤将测试菌株稀释成105cfu/ml，在每排前10孔各加入稀释菌液100μl。第11孔加100μlmh肉汤作阴性对照，第12孔加100μl稀释菌液作阳性对照。37℃培养16～20h，观察各孔培养液中细菌的生长情况，以抑制细菌生长的药物最高稀释度作为测试药物的最小抑菌浓度(mic)。每种药物做2个平行。
实验结果：由表1可见，本发明药物对万古霉素耐药肠球菌(vre)临床株表现出与利奈唑胺相当的显著抗菌活性。
表1本发明药物对10株无重复临床分离万古霉素耐药肠球菌vre的mic(μg/ml)
实施例3红花八角醇，大花八角醇对小鼠表皮感染模型的抗菌活性试验
实验方法：
将小鼠适应性饲养1周，期间给予充足的鼠粮和水。1周后随机挑取30只小鼠剪去背毛，用质量百分比10％水合氯醛0.1ml/20g将其麻醉，麻醉后的小鼠用恒温烫伤仪100℃烫伤10秒，烫伤压力1000g烫伤面积为2.5cm2；挑取过夜培养的万古霉素耐药肠球菌(vre)临床株，200rmp37℃过夜培养，取100μl菌液于每只小鼠烫伤伤口处涂匀进行感染，反复感染11次，经检测30只小鼠全部感染成功。将30只感染小鼠随机分为2组，每组15只，再将每组的15只小鼠随机分为5组每组3只，分别为大花八角醇组、红花八角醇组、利奈唑胺组、生理盐水组、1％dmso组，小鼠感染感染24和48h后给药，每3h给药1次，连续给药5次，每次给药量4μg(100μl，浓度40μg/ml)。给药后第15个小时将小鼠脱臼处死，用酒精棉球简单消毒感染部位周围，用蘸有生理盐水的棉签刮擦感染部位，取脓液于1ml生理盐水中，3000转离心5分钟，弃上清，再加1ml生理盐水重悬菌体，混匀，稀释适当倍数后涂布于肠球菌显色培养基(粪肠球菌和屎肠球菌在此板上显红色或紫红色，其他细菌受抑制)，37℃培养16-18h后读取菌落数(每组每只小鼠平行涂板3块，菌落数取平均数)，观察持续给药后感染部位菌落减少数。
实验结果：由表2可见，本发明药物大花八角醇和红花八角醇，对小鼠万古霉素耐药肠球菌(vre)表皮感染模型的治疗效果显著，能够显著降低小鼠感染部位的菌落数，对vre具有抑杀活性。
表2本发明药物对小鼠vre表皮感染模型的治疗效果
实施例4：注射液
本发明化合物1或化合物2用少量的dmso溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例5：片剂
本发明化合物1或化合物2与赋形剂按照重量比为1:5的比例加入赋形剂，制粒压片，得片剂。
实施例6：胶囊
本发明化合物1或化合物2与赋形剂按照重量比为1:5的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例7：软膏剂
本发明化合物1或化合物2与赋形剂按照重量比为1:5的比例加入赋形剂，制成软膏剂。
通过上述实验的综合分析可知，红花八角醇、大花八角醇具有较好的抗万古霉素耐药肠球菌(vre)活性。其抗菌效果虽稍弱于阳性药利奈唑胺，但利奈唑胺是一种细菌蛋白质合成抑制剂，在临床使用中发现具有头疼、恶心、失眠等症状，严重的可引起骨髓抑制、周围神经病等症状，极大的影响了其临床疗效。而本发明所特供的红花八角醇、大花八角醇作为天然来源的药物，安全性高，毒副作用小，用于制药生产具有良好的临床应用前景。同时，红花八角醇、大花八角醇提取分离操做简单，来源广泛，具有较低的成本。