刀豆球蛋白A(ConA)的刺激 下，脾细胞也可产生IL-22(Dumoutier等，J.Immunology, 164:1814-1819, 2000)。人IL-22 的mRNA主要由被抗⑶3抗体或ConA刺激的外周T细胞表达。
[0109]天然的IL-22前体肽由179个氨基酸残基组成，而成熟肽为146个氨 基酸残基。Dumoutier等人最先报道了小鼠和人IL-22基因的克隆（Dumoutier 等，2000;US6, 359, 117and6, 274, 710)。IL-22主要由被激活的T细胞（特别是Thl7细胞）、 外源凝集素（lectin)刺激后的脾细胞（Dumoutier等，2000)、IL-2/IL-12刺激后的NK细 胞（Wolk，K等，J.Immunology, 168:5397-5402, 2002)和LPS刺激后的多个器官和组织中表 达，包括肠道、肝、胃、肾、肺、心脏、胸腺、脾都可以检测到IL-22的表达升高。IL-22通过结 合IL-22R1受体和IL-10R2受体，发挥生物学功能。IL-22R1是IL-22特异的受体，主要在 皮肤、肾、消化系统（胰腺，小肠，肝，大肠，结肠）以及呼吸系统（肺，支气管）中表达。已 公开的研究表明，IL-22是一个免疫调节剂。
[0110]IL-22 二聚体
[0111] 本发明的IL-22二聚体的结构如式I所示。代表性的结构如图1-3中所示。其中， 载体蛋白，包括（但并不限于）人IgG(l, 2, 3, 4)的Fc片段,或人白蛋白（albumin)。
[0112] 或者，本发明的IL-22二聚体包含两个单体亚基，其中，每个单体亚基包含一个 IL-22区域和二聚化区域，每个单体亚基包含一个通过连接序列连接于一个二聚化区域的 IL-22区域。所述IL-22区域位于二聚化区域的C-末端，也可位于二聚化区域的N-末端。 所述二聚体的载体蛋白由两个二聚体化区域通过二聚化形成。
[0113] 如本文所用，术语"连接肽"或"连接序列"（linker)指位于IL-22单体和载体蛋 白之间的或IL-22单体(或IL-22区域）和二聚化区域之间的、起连接作用的短肽。连接肽 的长度没有特别限制。连接肽的长度通常为5-50个氨基酸。在一些实施方式中，连接肽不 影响或不显著影响IL-22单体和IL-22单体形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例 子包括（但并不限于）：
[0114] 较佳地，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：
[0115] (a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成的3-16个氨基酸序列，例如 Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro;
[0116] (b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为5-20个，较佳地10-20个氨 基酸；
[0117] (c)来自于IL-22单体之外的蛋白的氨基酸序列，例如来自于IgG或白蛋白的氨基 酸序列；
[0118] (d)由（a)、（b)和（c)组合形成的氨基酸序列。
[0119]优选的连接肽包括：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDN0:1)或ASTKGP(SEQID NO. : 10)。
[0120] 此外，在融合蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响IL-22单体活性的氨基酸 序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达（如信号肽），有利于纯化（如6XHis序 列）、酿酒酵母a-因子信号肽切割位点（Glu-Lys-Arg)，或可促进融合蛋白的活性。
[0121] 在一些实施方式中，IL-22二聚体包含两个单体亚基，其中每个单体亚基包含一个IL-22区域和一个二聚化区域。在一些实施方式中，IL-22区域融合于二聚化区域的N末端。 在一些实施方式中，IL-22区域融合于二聚化区域的C末端。在一些实施方式中，IL-22区 域和二聚化区域通过连接肽连接（例如，大约5-50个氨基酸长度的连接肽，又如具有如SEQ IDNO: 1或SEQIDNO. : 10所示序列的连接肽）。在一些实施方式中，IL-22二聚体的二聚 化区域包括亮氨酸拉链结构。
[0122] 在一些实施方式中，IL-22二聚体包含两个IL-22单体亚基，其中每个IL-22单体 亚基包含一个IL-22单体和至少免疫球蛋白Fc区域（Fe区域，或称为Fc片段）的一部分。 在一些实施方式中，IL-22区域融合于Fe区域的N端。在一些实施方式中，IL-22区域融 合于Fe区域的C端。在一些实施方式中，IL-22区域和Fe区域通过连接肽连接（例如，大 约5-50个氨基酸长度的连接肽，又如具有如SEQIDNO: 1或SEQIDNO. : 10所示序列的连 接肽）。在一些实施方式中，IL-22区域具有如SEQIDNO: 3所示的序列。在一些实施方式 中，Fe区域包含至少2个能形成分子间二硫键的半胱氨酸。在一些实施方式中，Fe区域的 N末端被截断，例如缺失完整的免疫球蛋白Fe区域起始的1、2、3、4、5、6、7、8、9,或10个氨 基酸。在一些实施方式中，Fe区域来自IgG2。在一些实施方式中，Fe区域具有如SEQID NO:2或SEQIDNO. :9所示的序列。
[0123]在一些实施方式中，IL-22二聚体包含两个IL-22单体亚基，其中每个IL-22单体 亚基包含或为如SEQIDNO:4和SEQIDNO:6-8所示的序列。
[0124]本发明包含对提及的多肽的修饰，包括不显著影响特性的功能上等价的蛋白和活 性提高或降低的变体。在领域中多肽的修饰是常规的实践并且不需要在本发明中详述。修 饰的多肽的例子包括多肽的氨基酸残基的保守替代，一个或更多缺失或增加那些不显著危 害性地改变功能活性的氨基酸，不显著危害性地改变功能活性的非保守的突变，或化学类 似物的使用。
[0125]氨基酸序列插入包含在N端或C末端融合长度为一个残基到含有数百甚至更多残 基的多肽，包含内部序列中插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的例子包括一个N末端 甲硫氨酸残基或一个表位标签，IL-22二聚体的单体亚基的其它插入变体包含在N端或C端 融合多肽或能提高IL-22二聚体血清半衰期的多肽。
[0126] 蛋白中存在20种常见氨基酸，根据侧链的化学特性，这些氨基酸可以分为9类或 组，本发明的"保守的"替代指的是在同类/组中的一种氨基酸替代另一种氨基酸。对蛋 白的保守的氨基酸替代通常不显著改变蛋白的构象和功能。相反，非保守的氨基酸替代趋 于破坏蛋白的构象和功能。具有相似的侧链的氨基酸残基的家族已在领域中被定义，这些 家族包括的氨基酸侧链如下：碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸），酸性侧链（天冬氨 酸、谷氨酸），不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪 氨酸、半胱氨酸），非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 甲硫氨酸、色氨酸），(6-支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如酪 氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。（参见下表）
[0127] 氨基酸分类示例
【主权项】
1. 一种白介素-22 (IL-22)二聚体的用途，其特征在于，用于制备静脉注射药物。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物可用于制备治疗如下疾病的药物： 代谢性疾病、脂肪肝、病毒性肝炎、MODS、神经障碍、和胰腺炎。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的白介素-22二聚体是式I所示的白介 素-22二聚体， M1-L-M2 式 I 式中， Ml是白介素-22的第一单体； M2是白介素-22的第二单体； L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起 的接头兀件。
4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的接头元件L选自下组： (i) 3-50个氨基酸的短肽； (ii) 式II所示的多肽元件： -Z-Y-Z-式 II 式中， Y为载体蛋白； Z为无、或1-30个氨基酸的短肽； 为化学键或共价键。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片 段。
6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述二聚体由两个单体亚基构成，每一个所 述的单体亚基包含IL-22区域、二聚化区域以及连接所述IL-22区域和二聚化区域的连接 序列。
7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述单体亚基包含一段选自如SEQ IDN0:4 和SEQ ID N0:6-8所示的氨基酸序列。
8. 如权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，所述二聚体具有选自下组的一种 或多种生物活性： (a) 在体内降低淀粉酶和/或脂肪酶； (b) 在体内减轻胰腺水肿； (c) 在体内抑制胰腺腺泡细胞和/或脂肪细胞的坏死； (d) 在体内减轻制胰腺中炎症细胞的浸润。
9. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物按如下方式给药：按述二聚体的 给药剂量为大约2 y g/kg至大约200 y g/kg给药；较佳地，按述二聚体的给药剂量为大约 5 ii g/kg至大约80 y g/kg给药；更佳地，按述二聚体的给药剂量为大约10 y g/kg至大约 45 ii g/kg 给药。
【专利摘要】本发明涉及IL-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用。具体地，本发明提供了对个体，例如人类个体，施用IL-22二聚体的方法，包括对个体静脉给予一种有效量的IL-22二聚体，其中，IL-22二聚体的施用量大约为2μg/kg至大约200μg/kg（例如大约10μg/kg至大约45μg/kg），同时还提供了按照所述施用方法来治疗疾病的方法，还提供了适用于本发明中所描述的任意一种方法的药盒、单位剂量、和制品。
【IPC分类】A61K9-08, A61P1-18, A61P31-12, A61P1-16, A61K38-20, A61P3-00, A61P25-00
【公开号】CN104623637
【申请号】CN201310549838
【发明人】严孝强, 黄诚, 武栋栋, 汤凯扬, 黄予良
【申请人】健能隆医药技术（上海）有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月7日
【公告号】WO2015067199A1