质干细胞悬液细胞中，边添加，边进行 混合，至所述明胶制剂与所述脂肪间充质干细胞悬液的体积比为1~3 :1~2;混合均匀 后，即得到本发明干细胞制剂，并将其分装到预充的注射器中，放到-80°C冰箱中冻存，备 用。
[0024]本发明将明胶制剂高分子材料添加到脂肪间充质干细胞活细胞悬液中，可以提高 细胞活率，延长细胞存活时间，达到长时间促进表皮细胞生长，缩短创口愈合时间，促进经 久不愈的溃疡愈合等作用。
[0025] 实施例一：
[0026] 称取10g明胶，lg聚赖氨酸，lg梭甲基纤维素于121°C高压灭菌15分钟后加入到 含10%DMS0、5%丙二醇的100ml无血清DMEM培养基中，制成均一的明胶制剂；
[0027] 取生长状态良好的第3代人ADSCs以1X106个/mL的密度接种至75cm2培养瓶， 置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的C02培养箱中常规培养，24h后轻轻弃去培养液，去 除未贴壁的细胞，无菌PBS轻微冲洗1次，更换完全培养液，以后每隔Id(即1天）更换培 养液1次，每次换液时于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞生长至约80 %融 合时，弃去培养液，无菌PBS冲洗2遍，加入无血清DMEM约15ml，于37 °C、饱和湿度、体积分 数为5%的C02培养箱中常规培养；培养48h后，于生物安全柜内收集培养上清液，置于无 菌10mL离心管内，于室温下离心半径为16cm的高速离心机上，以3000rpm/min离心lOmin， 轻柔的吸取收集上清液，除去下层沉淀，以〇. 22μm的滤膜过滤，得到脂肪间充质干细胞悬 液。
[0028] 将上述明胶制剂逐滴添加到上述细胞悬液中，边添加，边进行混合，至明胶制剂与 细胞悬液的体积比为2 : 1为止；混合均匀后，分装到预充注射器中，放到-80°C冰箱中冻 存，待用。
[0029] 为进一步验证本发明提供的干细胞制剂的显著效果，通过以下实验及实验数据进 行具体说明。
[0030] 验证实验：
[0031] 实验动物分组和模型构建：采取同体对照法，在20只Sprague-Dawley大鼠（SD 大鼠）背部制作两个III度切痂创面。左侧创面采用本发明干细胞制剂，将本发明干细胞制 剂装入注射器中，涂抹于左侧，给予200μL，浓度为1X106个/ml，右侧创面采用单纯制剂 (普通的干细胞的活细胞悬液，作为对照组），后用纱布覆盖包扎。在连续多天的观察下，两 侧创面的缺损面积见下表1 :
[0032]
[0033] 表1，大鼠两侧创面缺损面积比例值
[0034] 结果显示：随着天数增加，左侧创面的缺损面积越来越小，反应本发明干细胞制剂 逐渐显效，伤口愈合速度快于对照组，结果提示本发明干细胞制剂能促进伤口愈合，缩短病 程。
[0035] 以上仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种干细胞制剂，其特征在于，包括混合在一起的明胶制剂和脂肪间充质干细胞悬 液，所述明胶制剂和干细胞悬液的体积比为1~3 : 1~2。2. 根据权利要求书1所述的一种干细胞制剂，其特征在于，所述明胶制剂和干细胞悬 液的体积比为2 : 1。3. -种干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 制备明胶制剂的步骤，其包括：称取l〇g明胶，lg聚赖氨酸和lg梭甲基纤维素于 100-140°C高温下灭菌10-20分钟后，再加入到含10%WT的DMS0(防冻剂）和5%WT的丙 二醇（保湿剂）的l〇〇ml的无血清DMEM或DF12培养基中，制成明胶制剂； 制备脂肪间充质干细胞悬液的步骤，其包括：取第3代人脂肪间充质干细胞以1X106 个/mL的密度接种至培养瓶中，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的C02培养箱中常规 培养，24h后轻轻弃去培养液，去除未贴壁的细胞，无菌PBS轻微冲洗1次，更换完全培养液， 以后每隔1天更换培养液1次，待细胞生长至80 %融合时，弃去培养液，无菌PBS冲洗2遍， 加入无血清DMEM约15ml，于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的C02培养箱中常规培养，培 养48h后，于生物安全柜内收集培养上清液，置于无菌10mL离心管内，于室温下离心半径为 16cm的高速离心机上，以3000rpm/min离心lOmin，轻柔的吸取收集上清液，除去下层沉淀， 以0. 22μm的滤膜过滤，收集细胞悬液，S卩脂肪间充质干细胞悬液； 配制所述干细胞制剂的步骤，其包括：将所述明胶制剂逐滴添加到所述脂肪间充质干 细胞悬液细胞中，边添加，边进行混合，至所述明胶制剂与所述脂肪间充质干细胞悬液的体 积比为1~3 :1~2 ;混合均匀后，分装到预充注射器中，放到-80°C冰箱中冻存。4. 根据权利要求3所述的一种干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述制备脂肪间 充质干细胞悬液的步骤中，还包括： 每次换液时于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况的步骤。5. 根据权利要求3所述的一种干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述配制所述干 细胞制剂的步骤中，边添加，边进行混合时，至所述明胶制剂与所述脂肪间充质干细胞悬液 的体积比为2 : 1。
【专利摘要】本发明提出了一种干细胞制剂及其制备方法，该干细胞制剂包括混合在一起的明胶制剂和脂肪间充质干细胞悬液，所述明胶制剂和干细胞悬液的体积比为1～3︰1～2。本发明将明胶制剂高分子材料添加到脂肪间充质干细胞活细胞悬液中，可以提高细胞活率，延长细胞存活时间，达到长时间促进表皮细胞生长，缩短创口愈合时间，促进经久不愈的溃疡愈合等作用。
【IPC分类】A61P17/02, A61K47/42, A61K35/28
【公开号】CN105311056
【申请号】CN201510752796
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月9日