专利名称：抗氧化活性合成肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗氧化活性合成肽及其用途。
背景技术：
现代自由基学说指出自由基是机体在氧化反应中产生的有害化合物，会导致脂质、蛋白质和DNA氧化性退变等氧化损害，引发糖尿病、动脉硬化、癌症等一系列慢性疾病。在食品中，一些营养成分会氧化产生氢过氧化物，降低食品品质，甚至会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找抗氧化剂以抑制氢过氧化物的产生一直是人们关注的焦点之一。目前，BHA, BHT、PG等化学合成抗氧化剂已广泛的应用于食品行业以防止食品劣性氧化，但是因其潜在危害限制了其应用范围；一些抗氧化肽因其具有清除自由基、淬灭单线态氧、分解过氧化物及抑制脂质过氧化等功效，且具有分子量小、易吸收等特点，也已经用于化妆品行业，以抑制皮肤老化及化妆品自身氧化。 抗氧化肽作为抗氧化剂的一个重要组成，近几年其相关研究也越来越多。抗氧化肽大多是蛋白质酶解、分离纯化后获得，但是方法成本高、分离时间长、品质难以控制、抗氧化活性各有高低，从而限制了抗氧化肽的大规模生产及应用。而利用定量构效关系(QSAR)模型可以揭示抗氧化肽的构效关系，并预测高活性抗氧化肽的结构。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗氧化活性合成肽。本发明提供的多肽，为如下I) -3)中任意一种I)序列表中序列I所示的多肽；2)序列表中序列2所示的多肽；3)序列表中序列3所示的多肽。上述三条多肽均为本发明保护的范围，且这几条多肽具有相同的氨基酸残基，均自N末端起第一位氨基酸残基和第二位氨基酸残基分别为酪氨酸和脯氨酸，且均具有较高的抗氧化活性，一般在多肽筛选和多肽合成中作为一组。上述多肽为具有抗氧化活性的多肽；上述抗氧化活性具体通过ABTS清除活性、ORAC活性和/或抑制脂质过氧化活性体现。本发明的另一个目的是提供一种多肽溶液。本发明提供的多肽溶液，为将上述多肽溶于醇溶液或酸性溶液中得到的溶液；所述醇溶液具体可为浓度50% (体积百分含量)及其以上的乙醇水溶液；所述酸性溶液具体可为浓度为2-20mM的盐酸水溶液。上述多肽或多肽溶液在如下I) -3)中任一所述中的应用也是本发明保护的范围I)制备抗氧化活性产品；2)制备清除自由基产品；3)制备抑制脂质过氧化产品。在上述应用中，清除自由基在本发明的实施例中具体通过清除ABTS自由基和/或淬灭AAPH自由基体现。
上述多肽或多肽溶液在作为抗氧化剂中的应用也是本发明保护的范围。上述多肽或多肽溶液在制备化妆品中的应用也是本发明保护的范围。上述多肽或多肽溶液在作为动物营养补充剂中的应用也是本发明保护的范围。上述多肽或多肽溶液在作为食品营养补充剂中的应用也是本发明保护的范围。上述多肽通过多肽合成仪进行化学合成的，合成肽通过质谱鉴定；具有较高的ABTS清除活性、ORAC活性以及抑制脂质过氧化活性。本发明即是在研究抗氧化肽定量构效关系模型的基础上，预测出高活性抗氧化肽的序列，经化学合成后进行活性验证，得出的一组结构相似、功能活性相同的序列。这些序列经过与蛋白质资源库的比对，存在于天然蛋白质序列中。与酶解法制备并分离纯化的抗氧化肽相比，本发明具有高自由基清除率、高抗氧化活性等特征。采用化学合成的方法制备这些抗氧化肽，功能活性高且稳定、成本较低。·
本发明的实验证明，本发明合成3条多肽，其具有抗氧化活性，由于该抗氧化肽具有分子量小，活性高，易于人工合成，成本低等特点，可以广泛的用于食品、化妆品、医药等行业的大规模生产；具体可作为抗氧化剂用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。总之，本发明的优点在于(1)发明了未见报道的具有高抗氧化活性(ABTS清除活性、ORAC活性和抑制脂质过氧化活性)的肽序列；(2)发明的多肽是4肽，分子量小，易吸收。(3)发明的抗氧化肽结构简单，人工合成方便，易于工业化生产，在食品、医药、饲料和化妆品领域中具有广阔的应用前景。
图I为抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的质谱2为抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的高效液相色谱图3为抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的质谱4为抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的高效液相色谱图5为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的质谱6为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色谱
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、抗氧化活性合成肽的获得多肽的合成由北京中科亚光生物技术有限公司提供。多肽的制备采用Apex 396型号的多肽合成仪，通过Fmoc固相合成法合成。分别按照三个不同肽序列Tyr-Pro-Tyr-Trp, Tyr-Pro-Trp-Tyr, Tyr-Pro-Phe-Trp 的特征，由 C 端到 N 端逐步依次将氨基酸连接上。开始，将第一个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物树脂上。用六氢吡啶将Fmoc保护基去掉后，第二个Fmoc保护的氨基酸被连接上了上去，连接方法有预活化或“一锅煮”等。目标序列连接后，用TFA将肽链从树脂上洗脱得到粗品。所合成的多肽经高效液相色谱仪纯化，纯度达到90%以上，并经过质谱仪鉴定结构。本发明根据QSAR模型提供一组具有高抗氧化活性的合成多肽，具体如下
多妝I :Tyr-Pro-Ty;r-Trp (序列 I)；多妝2 :Tyr-Pro-Trp-Tyr (序列 2);多妝3 :Tyr-Pro-Phe-Trp (序列 3);上述3条多肽均为4肽；且每条多肽的NI位置均为酪氨酸、N2位置均为脯氨酸。上述多肽可以人工合成，其质谱图和高效液相色谱检测结果如图1-6所示图I为抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的质谱图，质谱图是通过Voyager-DE PRO型号的质谱仪测定得到的，质谱参数正极模式，手工集控；加速电压为20000V ;采集质量范围为300-2000Da，激光投射的数量为50/频谱，激光强度为2753，激光频率为3. 0HZ。图2为抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的高效液相色谱，色谱条件分析柱为Agela (250 X 4. 6mmI. D. )C18 ;检测波长为 220nm ;梯度为 30-45%,时间 15min ;流动相 A 为 O. 05%TFA+2%CH3CN,流动相 B 为 O. 05%TFA+90%CH3CNo ； 图3为抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的质谱图,质谱图是通过Voyager-DE PRO型号的质谱仪测定得到的，质谱参数正极模式，手工集控；加速电压为20000V ;采集质量范围为300-2000Da，激光投射的数量为50/频谱，激光强度为2753，激光频率为3. OHZ ;图4为抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的高效液相色谱,色谱条件分析柱为Agela (250 X 4. 6mm I. D.)C18 ;检测波长为220nm ;梯度为28_43%，时间15min ;流动相A为O. 05%TFA+2%CH3CN,流动相 B 为 O. 05%TFA+90%CH3CNo图5为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的质谱图,质谱图是通过Voyager-DE PRO型号的质谱仪测定得到的，质谱参数正极模式，手工集控；加速电压为20000V ;采集质量范围300-2000Da,激光投射的数量为50/频谱，激光强度为2753，激光频率为3. 0HZ。图6为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色谱,色谱条件分析柱为Agela (250 X 4. 6mm I. D.)C18 ;检测波长为220nm ;梯度为28_48%，时间20min ;流动相A为O. 05%TFA+2%CH3CN,流动相B为O. 05%TFA+90%CH3CN ;图6的具体结果如下表I : 表I为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色谱结果
Rank Time Cone.AreaHeight
19. 787 3.174 107912 6972
211.513 1.597 5428333143 11.972 1.996 678667531
412.281 92.23 3135119 167261
512.968 1.01343333192
Total1003399513 188270实施例2、抗氧化活性合成肽的活性检测将上述多肽1、2、3分别溶于50%的乙醇水溶液中，得到多肽I溶液、多肽2溶液、多肽3溶液,母液浓度为10mM，然后用去离子水稀释至下面所需浓度。I、用TEAC法测定抗氧化肽的ABTS清除活性将7mmol/L ABTS(水溶液)与终浓度为2. 45mmol/L的过硫酸钾混合反应产生ABTS+ ，混合液在黑暗室温(25°C)下放置16h，得到ABTS+ ·溶液。ABTS+ ·溶液用无水乙醇稀释，至在734nm下的吸光值为O. 7±0.02。取该溶液4ml与40 μ 10. 5mM的待测多肽溶液混合，30°C下在734nm下测定吸光度，用蒸馏水代替样品作为空白对照，实验平行3次。采用系列Trolox (中文名水溶性维生素E)溶液代替待测多肽溶液，测定后绘制标准曲线。结果表示为待测多肽溶液相当的抗氧化能力所需要的Trolox的浓度。ABTS+ ·清除率的计
算公式如下
权利要求
1.一种多肽，为如下I)-3)中任意一种 1)序列表中序列I所不的多妝； 2)序列表中序列2所的多妝； 3)序列表中序列3所示的多肽。
2.根据权利要求I所述的多肽，其特征在于所述多肽为具有抗氧化活性的多肽。
3.一种多肽溶液，为将权利要求I或2所述多肽溶于醇溶液或酸性溶液中得到的溶液。
4.权利要求I或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液在如下I)-3)中任一所述中的应用 1)制备抗氧化活性产品； 2)制备清除自由基广品； 3)制备抑制脂质过氧化产品。
5.权利要求I或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液在作为抗氧化剂中的应用。
6.权利要求I或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液作为动物营养补充剂中的应用。
7.权利要求I或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液作为食品营养补充剂中的应用。
8.权利要求I或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液在制备化妆品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗氧化活性合成肽及其用途。本发明提供的多肽，为如下1)-3)中任一一种1)由序列表中序列1所示的多肽；2)由序列表中序列2所示的多肽；3)由序列表中序列3所示的多肽。本发明的实验证明，本发明合成3条多肽，其具有抗氧化活性，由于该抗氧化肽具有分子量小，活性高，易于人工合成，成本低等特点，可以广泛的用于食品、化妆品、医药等行业的大规模生产；具体可作为抗氧化剂用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。
文档编号A61Q19/00GK102898504SQ20121040744
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者李博, 刘珊珊, 李耀旺 申请人:中国农业大学