专利名称：一种海洋青鳉鱼特异性组织的均一化cDNA文库及制备方法
技术领域：
本发明涉及cDNA文库领域，具体涉及一种海洋青鏘鱼特异性组织的均一化CDNA 文库及制备方法。
背景技术：
海洋青鏘鱼(Oryzias Melastigma)在中国、朝鲜、日本及印度等海域普遍存在，成 年个体长约3. 5-4厘米，生活周期大约为2-3个月，基因组较小，只有斑马鱼基因组的一半， 约为800Mb，性格温和、产卵率高、易于观察、海水消耗低，对海水环境压力较能耐受，且肝、 生殖组织等对缺氧引起的环境压力变化比较敏感，因此很适宜作为模式生物用于科学研 究，尤其适用于海洋环境质量评估和海洋生态毒理学等方面的实验研究。但海洋青鏘鱼的 遗传信息获得还很不完整，检索国内外专业的cDNA文库构建公司，未见到相关的产品；检 索美国国立图书馆的遗传数据库，可获得的基因信息不足30条。对海洋青鏘鱼基因信息的 有限所知严重阻碍了其作为模式生物的研究与应用，因而获得覆盖面广、质量较高的cDNA 文库是十分迫切的。cDNA文库的构建是分子生物学领域的一项重要技术，但以常规方法构建的cDNA 文库面临的最大问题是高通量分析过程中重复的拷贝所占比例太高，其重要的原因就在于 高等真核生物的细胞中基因的表达水平差异很大。从基因的转录水平看，细胞中高丰度基 因可能仅有10-20个，但却富含几千个拷贝，占细胞mRNA含量20%以上；中等丰度的几百 个基因，富含几百个拷贝，约占细胞mRNA含量的40-60% ；而低丰度表达的几千个稀有基 因，在单个细胞中仅存在着1-15个拷贝，占mRNA含量的20-40%。因此对于cDNA文库而言， 高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选和鉴定带来不必要的浪费是难免的，如日本水稻 基因组计划(RGP) 1991年启动的EST测序中，为获得足够多的基因信息，动用了多达15个 独立的cDNA文库，测序超过29000个cDNA克隆，才获得近1万条非重复序列。随着分子生物学技术的长期发展，自1990年以来出现了各种均一化cDNA文库 (equalized cDNA library, normalized cDNA library)的构建方法，试图在文库测序前 降低代表高丰度转录本的克隆，增加中低丰度转录本出现的频次，以有利于低丰度表达 基因的发现。其中Zhulidov和Bogdanova等提出的利用一种特殊的双链特异性核酸酶 (duplex-specific nuclease,DSN)进行 cDNA均一化的方法[Zhulidov PA,Bogdanova EA, Shcheglov AS, Vagner LL, Khaspekov GL, Kozhemyako VB, Matz MV, Meleshkevitch E, Moroz LL, Lukyanov SA, Shagin DA. Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex-specific nuclease. NucleicAcids Res. 2004,32(3) :e37]，与其它的 cDNA 均一化 方法比较，可以有效地均一化含有全长序列的cDNA样本，并且可以减少物理性分离程序， 节省操作时间，因而十分适合基因信息量所知有限的生物进行高效的文库构建。这种新型的cDNA均一化方法，利用DNA变性后可以再重新杂交的二级反应动力学 原理，并主要应用了一种提取自堪察加半岛螃蟹(Paralithodescamtschaticus)的双链特异性核酸酶参与反应。其均一化策略具体包括cDNA变性后重组、代表高丰度转录本的双 链成分的降解以及均一化的单链DNA成分的PCR扩增。方法的关键是cDNA在变性及重组 后，利用双链特异性核酸酶的特性一一在复杂的核酸复合物中，其裂解双链成分的能力要 远强于裂解单链DNA或RNA的能力，无论核酸序列长短，都可以高效的除去双链成分，包括 DNA-DNA和DNA-RNA杂合体。这种酶发挥活性的温度范围较广，在55_65°C间具有最佳活性； 而且其降解单链DNA成分仅在高温时才发生，这可以避免二级结构形成或接合序列引起的 非特异性杂交等情况所致的转录本丢失。应用这种均一化方法，理论上讲，如果样本中存在10000-20000种mRNA，高丰度基 因的代表水平在均一化后可以降低1-2个数量级，中等丰度基因的代表水平可以降低几倍 或维持不变，而代表低丰度的稀有基因浓度可以增加3倍。理想化的均一化文库中各基因 的代表水平应该是0.01%。而且使用这种方法，cDNA序列长度保持不变，可以有效地用于富含全长cDNA的样 本。此外，这种均一化方法对于单链cDNA和双链扩增的cDNA同样有效。当能够获得 足够的polyA+RNA样本时，以polyA+RNA为模板反转录形成cDNA第一链，均一化步骤主要 针对cDNA-RNA杂合体；当样本来源稀少，只能获得有限的总RNA含量而不方便分离提取 polyA+RNA时，可以先通过反转录获得双链cDNA，然后再进行均一化反应，这种方法同样有 助于低丰度表达基因的发现。根据上述技术描述，建立海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库，能够克服基 因转录水平上的巨大差异，有利于大量筛选、发现和研究海洋青鏘鱼基因的表达并进行序 列分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库，为大量 发现和研究海洋青鏘鱼的表达基因奠定基础，同时为深入研究海洋青鏘鱼特异性组织的表 达标志物提供依据。本发明的另一目的是提供一种制备海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库的 方法。本发明的思路是这样的从海洋青鏘鱼的一种或几种特异性组织中提取总RNA， 利用SMART方法合成cDNA双链，cDNA变性后重新杂交，经双链特异性核酸酶降解双链cDNA 后完成cDNA的均一化过程，均一化后的单链cDNA成分经PCR扩增并插入载体，即得海洋青 鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库。本发明一方面公开了一种海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库。本发明另一方面提供了制备海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库的方法， 包括如下步骤a)提取海洋青鏘鱼特异性组织的总RNA，b)合成cDNA多核苷酸产物，c) cDNA变性后再重新杂交，d)双链成分的选择性降解，
e)均一化后cDNA成分的PCR扩增，f)扩增产物插入载体。可以用本领域普通技术人员所熟知的技术提取海洋青鏘鱼特异性组织的总RNA， 例如按照Invitrogen公司的Trizol试剂提取总RNA。可以用本领域普通技术人员所熟知的技术，以Oligo d(T)为引物反转录合成 cDNA的第一链。优选地，在合成cDNA第一链时引入SEQ ID No. 1序列和SEQID No. 2序 列。可以用本领域普通技术人员所熟知的PCR技术扩增cDNA多核苷酸产物，优选地，采用 LD-PCR方法合成并扩增cDNA多核苷酸产物，更优选地，LD-PCR引物为SEQ IDNo. 2和SEQ IDNo. 3 序列。可以用本领域普通技术人员所熟知的技术进行双链cDNA的变性并再重新杂交。可以用本领域普通技术人员所熟知的技术进行选择性地降解cDNA双链成分，优 选地，采用双链特异性核酸酶，更优选地，采用一种提取自堪察加半岛螃蟹的双链特异性核 酸酶DSN。可以用本领域普通技术人员所熟知的技术PCR扩增均一化后的核苷酸成分。可以用本领域普通技术人员所熟知的技术将cDNA多核苷酸产物插入载体，并用 载体转化宿主细胞。因而含有cDNA文库基因的载体和含有该载体的转化体也在主张保护范围内。制备海洋青鏘鱼特异性组织均一化cDNA文库的方法，还包括转化宿主细胞的步 骤，有多种方法可以使均一化的cDNA文库转化宿主细胞，优选地采用电脉冲方法。制备海洋青鏘鱼特异性组织均一化cDNA文库的方法，合成的cDNA多核苷酸产物 可以经过纯化，提取200bp-5kb的组分插入载体，优选地提取500bp-3000bp的组分插入载 体。以下结合实施例说明本发明的有益技术效果。对比人类细胞的基因数目大约有30000-40000个左右，本发明所构建的海洋青鏘 鱼的文库容量为1X106，基本能够达到获得大量海洋青鏘鱼表达基因的要求。该海洋青鏘 鱼的特异性组织的均一化CDNA文库建立后，即可通过测序和比对筛选分离出海洋青鏘鱼 特有的表达基因，而一旦发现有价值的基因，就可以方便地对其进一步分析研究。如本发明实施例一构建的海洋青鏘鱼肝脏组织的均一化cDNA文库中，由于采用 了双链cDNA的DSN-均一化以及LD-PCR技术，可以保证一些低丰度表达的稀有cDNA片段被 扩增，因而扩增的片段具有很高的代表性，这有利于文库的筛选和鉴定。如实施例三所述， 随机挑选的cDNA文库的20个克隆鉴定结果，插入片段大小范围约为500bp-3kb，且多集中 在lkb-2kb左右，图7。插入片段的测序结果与基因库(GenBank)进行比对分析，其中1个 克隆与基因序列gb|EF392364. 1|99%—致。
图1为海洋青鏘鱼肝脏组织总RNA样品的琼脂糖凝胶电泳结果；图2为来源自海洋青鏘鱼肝脏组织的cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；图3为来源自海洋青鏘鱼肝脏组织的cDNA均一化后的脂糖凝胶电泳结果；
0036]图4为海洋青鏘鱼性腺组织的总RNA 1 %琼脂糖凝胶电泳结果；
图5为来源自海洋青鏘鱼性腺组织的cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；图6为来源自海洋青鏘鱼性腺组织的cDNA均一化后的琼脂糖凝胶电泳结果；图7为海洋青鏘鱼肝脏组织的均一化cDNA文库插入片段鉴定结果；图8为海洋青鏘鱼肝脏组织的均一化cDNA文库的克隆12在基因库中比对结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例详细说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例一海洋青鏘鱼肝脏组织的均一化cDNA文库的构建本实施例的步骤如下1.海洋青鏘鱼的培养海洋青鏘鱼来源于台湾地区的商业性养殖场，由香港城市大学生物与化学系购买 并赠予。海洋青鏘鱼的实验室培养条件为海水的溶解氧水平5. 0-7. Omg/L，水温28士2°C， 密度设置每条鱼0. 3-0. 5L，盐浓度30mg/L，光照周期为14h照明/10h暗室，每天喂食5次， 性别比例雄性雌性=1 1.5。实验选取性成熟的、身长3. 5-4cm的成体鱼作为研究对象。2.海洋青鏘鱼肝脏组织的分离选取10条成体海洋青鏘鱼，包括5条雌性和5条雄性，迅速断头处死，以PBS缓冲 液冲洗2次，无菌操作分离肝脏组织，置于含有缓冲液的瓶皿中，缓冲液清洗2次，转移至 Eppendorf管中，2000rpm/min低速离心收集肝脏组织。3.肝脏组织的总RNA提取按照Invitrogen公司的Trizol 试剂总RNA提取操作指南，勻浆肝脏组织，从肝 脏组织中提取总RNA。总RNA样品的琼脂糖凝胶电泳如附图l，28SrRNA和18S rRNA条 带明亮清晰，5S rRNA条带较弱，说明总RNA完整性较好。M为分子量标准。4.CDNA双链的合成按照Clontech 公司 cDNA 文库构建试剂盒(SMART cDNA library constructionkit)说明书推荐的方法，用Oligo d(T)作为反转录引物，反应体系中加入 SMART-Sfi 1A寡核苷酸和⑶S-Sfi IB引物，在反转录得到cDNA第一条链的同时分别引入 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2序列。采用LD-PCR方法，再加入SMARTPCR引物，引入SEQ ID No. 3序列，扩增cDNA，循环数为18。如附图2所示为扩增后cDNA的1 %琼脂糖凝胶电泳图， 可见500bp-3000bp之间亮度不同的弥散条带，M为分子量标准。扩增后按照QIAGEN公司 的PCR产物纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)的说明书纯化PCR产物，乙醇 沉淀纯化产物，超纯水溶解DNA沉淀至50ng/ul。5. cDNA 的均一化取150ng 纯化的双链 cDNA，加入 lul 4x 杂交缓冲液(200Mm HEPES-HC1，pH 8. 0 ； 2M NaCl)，95°C变性 5min 后，68°C杂交 4h。加入 68°C预热的 3. 5ul 超纯水，lul 5x DNAse buffer (500mM Tris_HCl，pH 8. 0 ；50Mm MgC12, lOmM DTT)和0.5ul DSN酶，68°C孵育30min， 95°C 孵育 7min。6.均一化后cDNA的扩增cDNA样本以40ul超纯水稀释后，取lul稀释液，加入0. 3uM SMART PCRPrimer,按照Clontech公司Advantage 2 Polymerize说明书的方法进行扩增，反应体积为50ul，循环 数为18。如附图3所示为均一化后的cDNA的琼脂糖凝胶电泳图，可见500bp-3000bp 之间的弥散条带亮度比较均一，M为分子量标准。7.均一化cDNA文库的构建扩增的cDNA纯化后以限制性内切酶Sf i 1消化，再按照BD公司的BDCHR0MA SPIN-1000 column分离，改良的pAL17载体经限制性内切酶Sfi 1消化，在BioRad电脉冲 转化仪的作用下，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在37°C LB培养板上培养，至克隆长出。 取出冻存管，加入冻存液，收集培养板上的克隆，混勻，分装成lml，-80°C冻存。取lOOul冻 存文库，分别稀释100，1000,10000倍，取lOOul涂板于LB培养基上至克隆长出。计数长出 的克隆数(cfu)。文库大小为lX107cfu/ml。实施例二海洋青鏘鱼性腺组织的均一化cDNA文库构建选10条成体海洋青鏘鱼，包括5条雌性和5条雄性，迅速断头处死，以PBS缓冲 液冲洗2次，无菌操作分离性腺组织，置于含有缓冲液的瓶皿中，缓冲液清洗2次，转移至 Eppendorf管中，2000rpm/min低速离心收集混合的性腺组织。其他步骤同实施例一。附图4为海洋青鏘鱼性腺组织的总RNA1 %琼脂糖凝胶电泳结果，其中28SrRNA和 18S rRNA条带明亮清晰，5S rRNA条带较弱，说明总RNA完整性较好。 海洋青鏘鱼性腺组织cDNA文库LD-PCR扩增产物均一化前和均一化后的1 %琼脂 糖电泳结果见附图5和附图6，可见500bp-3kb之间的弥散条带在均一化后亮度比较一致。 上样量为每泳道5ul PCR产物，M为分子量标准。文库大小为7 X 105cfu/ml。实施例三海洋青鏘鱼肝脏组织的均一化cDNA文库的鉴定从LB培养板上随机挑选22个克隆，接种与10ml LB培养液中，37°C培养28h，收 集培养物，采用SEQ ID No.4*SEQ ID No. 5序列引物对插入片段进行扩增，扩增条件为 95°C，30秒；65°C，30秒；72°C，3分钟；30个循环。产物5ul进行1 %琼脂糖凝胶电泳，观 察插入片段大小，结果见附图7，随即挑选的22个克隆，均具有插入片段，其插入片段大小 为从500bp-3kb大小不等的片段，多集中在lkb-2kb在左右。同时测序，测序引物序列为 SEQ ID No.4和SEQ IDNo. 5，测序结果在基因库中进行比对，其中1个测序结果与基因序列 gb | EF392364. 11 99%—致，图8为基因库中比对结果。序列表
SEQ ID No. 1
aagcagtggt atcaacgcagagtggccattacggccggg
SEQ ID No. 2
aagcagtggt atcaacgcagagtggccgaggcggcccttt tttttttttt tt
SEQ ID No. 3
aagcagtggt atcaacgcagagt
SEQ ID No. 4
gtattctata gtgtcaccta
SEQ ID No. 5
gtaatacgac tcactata
权利要求
一种海洋青鳉鱼(Oryzias Melastigma)特异性组织的均一化cDNA文库。
2.根据权利要求1所述的海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库，其特征在于该文 库是从海洋青鏘鱼的特异性组织制备的。
3.根据权利要求2所述的海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库，其特征在于该文 库是从海洋青鏘鱼的性腺、肝脏、肾脏、鳃、鳞、脑、心肌、肌肉、骨骼等一种或几种特异性组 织制备的。
4.根据权利要求1至3任一所述的海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库的制备 方法，其特征在于包括如下步骤a)提取海洋青鏘鱼特异性组织的总RNA，b)合成cDNA多核苷酸产物，c)cDNA变性后再重新杂交，d)双链成分的选择性降解，e)均一化后cDNA成分的PCR扩增，f)扩增产物插入载体。
5.根据权利要求4所述的海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库的制备方法，其 特征在于，在合成cDNA第一链时引入SEQ ID No. 1序列和SEQ ID No. 2序列，在合成双链 cDNA时引入SEQ ID No. 3序列，用SMART方法PCR扩增cDNA多核苷酸产物。
6.根据权利要求4所述的海洋青鏘鱼特异性组织的均一化cDNA文库的制备方法，其特 征在于cDNA变性再重新杂交形成新的cDNA双链后，经过双链特异性核酸酶DSN消化，选择 性降解了双链cDNA成分，完成了 cDNA的均一化。
全文摘要
本发明公开了一种海洋青鳉鱼特异性组织的均一化cDNA文库及制备方法，涉及cDNA文库领域，具体涉及一种海洋青鳉鱼特异性组织的均一化cDNA文库及制备方法。该文库是从海洋青鳉鱼的一种或几种特异性组织制备的。所述的均一化cDNA文库的制备方法包括提取海洋青鳉鱼特异性组织的总RNA，合成cDNA多核苷酸产物，cDNA变性后再重新杂交，双链成分的选择性降解，均一化后cDNA成分的PCR扩增，扩增产物插入载体。本发明提供的海洋青鳉鱼特异性组织的均一化cDNA文库为大量发现和研究海洋青鳉鱼的表达基因奠定基础，同时对于深入研究海洋青鳉鱼特异性组织的表达标志物具有重要意义。
文档编号C40B50/06GK101851786SQ20091018883
公开日2010年10月6日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者张琦, 方志俊, 曾志雄, 杨梦甦, 胡绍燊, 陈瑶 申请人:香港城市大学深圳研究院