本发明涉及荧光标记领域，尤其涉及一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法。
背景技术：
二氧化钛纳米材料具有优异的光催化降解有机有害物质的性能，使其在环境污染治理方面发挥巨大的作用，也引起越来越多的科学家对其的关注。不同形貌的二氧化钛纳米材料的光催化降解效率有显著的差异，二氧化钛纳米管的光催化降解有机有毒物质的效率可以是二氧化钛纳米颗粒的几十倍之多。同时，对于二氧化钛纳米管的生物毒性的研究也是十分关键的。观察二氧化钛纳米管与细胞的相互作用是研究的主要手段，其中对二氧化钛纳米管的荧光染色是观察二氧化钛纳米管在细胞内部分布情况以及细胞对二氧化钛纳米管胞吞情况最重要的步骤，然而二氧化钛纳米管表面并没有与常见染色剂可进行标记的特性，所以解决对二氧化钛纳米管的荧光染色问题对其与细胞的相互作用等研究中是十分关键的。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法。本发明通过人血清蛋白与异硫氰酸荧光素的作用先制备合成异硫氰酸荧光素标记的人血清蛋白，然后利用二氧化钛纳米材料与蛋白质的吸附特性间接将异硫氰酸荧光素标记在二氧化钛纳米材料上，该方法不会对细胞产生显著影响，不影响实验结果的科学性。本发明的具体技术方案为：一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法，采用如下步骤：1）将异硫氰酸荧光素溶解于二甲基亚砜中配制得A溶液，避光保存，其中异硫氰酸荧光素与二甲基亚砜的用量比为(0.7~1.1)/(2~6)mol/mL。2）将人血清蛋白添加到pH为8.5~9.5的碳酸钠水溶液中，并在室温下搅拌至完全溶解，配制得B溶液,其中人血清蛋白与碳酸钠水溶液用量比为(0.1~0.5)/(16~24)mol/mL。3）将所述A溶液转移至注射器中，将所述B溶液转移至容器中，在避光条件下将2~6体积份的A溶液滴加至10~20体积份的B溶液中，配制得C溶液，接着将所述C溶液转移至透析袋中，然后将所述透析袋浸没于pH为8.5~9.5的碳酸钠水溶液中进行透析，直至透析袋中溶液由浑浊转变为清澈透明后，取出透析袋，得到异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液。4）取二氧化钛纳米管分散于水中配制成0.5~1.5mg/mL的D溶液，再将所述异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液加水稀释浓度至2~3mg/mL，得到E溶液；在避光条件下将所述D溶液与所述E溶液按体积比1：（1~1.2）的比例混合处理12~60h，然后将混合溶液经离心分离后取固体，制得绿色标记荧光的二氧化钛纳米管。本发明通过人血清蛋白与异硫氰酸荧光素的作用先制备合成异硫氰酸荧光素标记的人血清蛋白，然后利用二氧化钛纳米管与蛋白质的吸附特性间接将异硫氰酸荧光素标记在二氧化钛纳米管上，该方法不会对细胞产生显著影响，不影响实验结果的科学性。作为优选，步骤1）中异硫氰酸荧光素与二甲基亚砜的用量比为(0.8~1)/(3~5)mol/mL。作为优选，步骤2）中人血清蛋白与碳酸钠水溶液用量比为(0.2~0.4)/(18~22)mol/mL。作为优选，步骤3）中所述A溶液与所述B溶液的体积比为4:15。作为优选，步骤3）中将所述A溶液滴加至所述B溶液的滴加速度为0.1-0.15mL/sec。慢速滴加能够避免A溶液滴加到B溶液后发生团聚现象，只有在特定的慢速滴加才能使A溶液与B溶液均匀、充分地混合而不发生团聚。另一方面，慢速的滴加，也有利于人血清蛋白能够被异硫氰酸荧光素均匀地标记，避免大多数异硫氰酸荧光素标记于少量的人血清蛋白上。作为优选，在步骤3）的透析过程中，所述透析袋的截留分子量为7000-10000；所述C溶液与碳酸钠水溶液的体积比为1:(50-150)。作为优选，步骤4）中的二氧化钛纳米管经过预处理：将二氧化钛纳米管在盐酸水溶液中浸泡处理，然后经离心分离得到预处理的二氧化钛纳米管。本发明预先将二氧化钛纳米管与酸性溶液作用，减小了二氧化钛纳米管表面的zate电位，减弱了人血清蛋白与材料的电荷排斥作用，有利于材料与蛋白的结合，同时也能够使得标记物能够均匀地分布在标记对象上。作为优选，所述盐酸水溶液的浓度为1mol/L，所述二氧化钛纳米管与盐酸水溶液用量比为(4~6):(40~60)mg/mL，浸泡时间为4~8h，离心转速为16000~18000g。作为优选，步骤4）的离心分离过程具体为：将所述混合溶液在18000-22000g的转速下离心4-6min，分离出固体后，用PBS缓冲液对剩余溶液进行洗涤，然后反复进行离心、分离、洗涤，直至不再有固体分离出为止。与现有技术对比，本发明的有益效果是：1）异硫氰酸荧光素与人血清蛋白的化学键作用十分牢靠，再利用二氧化钛纳米材料对蛋白质的吸附性能，使二氧化钛纳米管标记上绿色荧光。2）本发明用人血清蛋白促使荧光剂与二氧化钛纳米管的结合，不影响细胞实验的准确性。3）使用化学药品较少，实验过程绿色环保。4）方法简便、成本低、效果好。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述。实施例1一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法，采用如下步骤：1）将0.9mol的异硫氰酸荧光素溶解于4mL的二甲基亚砜中配制得A溶液，避光保存。2）将0.5mol的人血清蛋白添加到20mL的pH为9的碳酸钠水溶液中，并在室温下搅拌至完全溶解，配制得B溶液。3）将所述A溶液转移至注射器中，将所述B溶液转移至容器中，在避光条件下将A溶液以0.13mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接着将所述C溶液转移至截留分子量为9000的透析袋中，然后将所述透析袋浸没于100倍质量的pH为9的碳酸钠水溶液中进行透析，直至透析袋中溶液由浑浊转变为清澈透明后，取出透析袋，得到异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液。4）取二氧化钛纳米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再将所述异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液加水稀释浓度至2.5mg/mL，得到E溶液。在避光条件下将所述D溶液与所述E溶液按体积比1:1.1的比例混合处理36h，然后将混合溶液在20000g的转速下离心5min，分离出固体后，用PBS缓冲液对剩余溶液进行洗涤，然后反复进行离心、分离、洗涤，直至不再有固体分离出为止。实施例2一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法，采用如下步骤：1）将0.9mol的异硫氰酸荧光素溶解于4mL的二甲基亚砜中配制得A溶液，避光保存。2）将0.5mol的人血清蛋白添加到20mL的pH为9的碳酸钠水溶液中，并在室温下搅拌至完全溶解，配制得B溶液。3）将所述A溶液转移至注射器中，将所述B溶液转移至容器中，在避光条件下将A溶液以0.13mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接着将所述C溶液转移至截留分子量为8000的透析袋中，然后将所述透析袋浸没于100倍质量的pH为9的碳酸钠水溶液中进行透析，直至透析袋中溶液由浑浊转变为清澈透明后，取出透析袋，得到异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液。4）将5mg的二氧化钛纳米管在50mL的浓度为1mol/L的盐酸水溶液中浸泡处理6h，然后在17000g的转速下离心分离得到预处理的二氧化钛纳米管。5）取预处理后的二氧化钛纳米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再将所述异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液加水稀释浓度至2.5mg/mL，得到E溶液；在避光条件下将所述D溶液与所述E溶液按体积比1:1.1的比例混合处理36h，然后将混合溶液在20000g的转速下离心5min，分离出固体后，用PBS缓冲液对剩余溶液进行洗涤，然后反复进行离心、分离、洗涤，直至不再有固体分离出为止。实施例3一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法，采用如下步骤：1）将0.7mol的异硫氰酸荧光素溶解于2mL的二甲基亚砜中配制得A溶液，避光保存。2）将0.3mol的人血清蛋白添加到16mL的pH为8.5的碳酸钠水溶液中，并在室温下搅拌至完全溶解，配制得B溶液。3）将所述A溶液转移至注射器中，将所述B溶液转移至容器中，在避光条件下将A溶液以0.1mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接着将所述C溶液转移至截留分子量为7000的透析袋中，然后将所述透析袋浸没于50倍质量的pH为8.5的碳酸钠水溶液中进行透析，直至透析袋中溶液由浑浊转变为清澈透明后，取出透析袋，得到异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液。4）取4mg二氧化钛纳米管在60mL的浓度为1mol/L的盐酸水溶液中浸泡处理4h，然后在16000g的转速下离心分离得到预处理的二氧化钛纳米管。5）取预处理后的二氧化钛纳米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再将所述异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液加水稀释浓度至2mg/mL，得到E溶液；在避光条件下将所述D溶液与所述E溶液按体积比1:1的比例混合处理12h，然后将混合溶液在18000g的转速下离心4min，分离出固体后，用PBS缓冲液对剩余溶液进行洗涤，然后反复进行离心、分离、洗涤，直至不再有固体分离出为止。实施例4一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法，采用如下步骤：1）将1.1mol的异硫氰酸荧光素溶解于6mL的二甲基亚砜中配制得A溶液，避光保存。2）将0.7mol的人血清蛋白添加到24mL的pH为9.5的碳酸钠水溶液中，并在室温下搅拌至完全溶解，配制得B溶液。3）将所述A溶液转移至注射器中，将所述B溶液转移至容器中，在避光条件下将A溶液以0.15mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接着将所述C溶液转移至截留分子量为10000的透析袋中，然后将所述透析袋浸没于150倍质量的pH为9.5的碳酸钠水溶液中进行透析，直至透析袋中溶液由浑浊转变为清澈透明后，取出透析袋，得到异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液。4）取6mg二氧化钛纳米管在40mL的浓度为1mol/L的盐酸水溶液中浸泡处理8h，然后在18000g的转速下离心分离得到预处理的二氧化钛纳米管。5）取预处理后的二氧化钛纳米管分散于水中配制成1.5mg/mL的D溶液，再将所述异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液加水稀释浓度至3mg/mL，得到E溶液；在避光条件下将所述D溶液与所述E溶液按体积比1:1.2的比例混合处理60h，然后将混合溶液在22000g的转速下离心6min，分离出固体后，用PBS缓冲液对剩余溶液进行洗涤，然后反复进行离心、分离、洗涤，直至不再有固体分离出为止。实施例5一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法，采用如下步骤：1）将0.8mol的异硫氰酸荧光素溶解于3mL的二甲基亚砜中配制得A溶液，避光保存。2）将0.4mol的人血清蛋白添加到18mL的pH为9的碳酸钠水溶液中，并在室温下搅拌至完全溶解，配制得B溶液。3）将所述A溶液转移至注射器中，将所述B溶液转移至容器中，在避光条件下将A溶液以0.12mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接着将所述C溶液转移至截留分子量为10000的透析袋中，然后将所述透析袋浸没于120倍质量的pH为9的碳酸钠水溶液中进行透析，直至透析袋中溶液由浑浊转变为清澈透明后，取出透析袋，得到异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液。4）取5mg二氧化钛纳米管在40mL的浓度为1mol/L的盐酸水溶液中浸泡处理5h，然后在17000g的转速下离心分离得到预处理的二氧化钛纳米管。5）取预处理后的二氧化钛纳米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再将所述异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液加水稀释浓度至2.5mg/mL，得到E溶液；在避光条件下将所述D溶液与所述E溶液按体积比1:1的比例混合处理24h，然后将混合溶液在21000的转速下离心5min，分离出固体后，用PBS缓冲液对剩余溶液进行洗涤，然后反复进行离心、分离、洗涤，直至不再有固体分离出为止。实施例6一种绿色荧光标记二氧化钛纳米管的方法，采用如下步骤：1）将1mol的异硫氰酸荧光素溶解于5mL的二甲基亚砜中配制得A溶液，避光保存。2）将0.6mol的人血清蛋白添加到22mL的pH为9的碳酸钠水溶液中，并在室温下搅拌至完全溶解，配制得B溶液。3）将所述A溶液转移至注射器中，将所述B溶液转移至容器中，在避光条件下将A溶液以0.14mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接着将所述C溶液转移至截留分子量为7000的透析袋中，然后将所述透析袋浸没于80倍质量的pH为9的碳酸钠水溶液中进行透析，直至透析袋中溶液由浑浊转变为清澈透明后，取出透析袋，得到异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液。4）取6mg二氧化钛纳米管在50mL的浓度为1mol/L的盐酸水溶液中浸泡处理4~8h，然后在16000g的转速下离心分离得到预处理的二氧化钛纳米管。5）取预处理后的二氧化钛纳米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再将所述异硫氰酸标记的人血清蛋白溶液加水稀释浓度至2.5mg/mL，得到E溶液；在避光条件下将所述D溶液与所述E溶液按体积比1:1.1的比例混合处理48h，然后将混合溶液在19000g的转速下离心5min，分离出固体后，用PBS缓冲液对剩余溶液进行洗涤，然后反复进行离心、分离、洗涤，直至不再有固体分离出为止。本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。