专利名称：基因重组成纤维细胞生长因子－8a多肽及其制备方法
技术领域：
本发明公开了一种基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽(rFGF8a)及其制备方法。
根据人类基因组研究(HumanGenomeProject)的成果，我们知道人成纤维细胞生长因子家族一共含有21个成员。已经发现的成纤维细胞生长因子至少包括19个成员。各成员之间在氨基酸序列、分子结构以及生物功能等方面有所异同。成纤维细胞生长因子多有促进伤口愈合的功能，但也存在促使细胞异常增生的可能性。例如有的成纤维细胞生长因子可促进小血管增生，虽然这一功能本身促进了伤口愈合，但也存在着恶变的潜在危险。成纤维细胞生长因子能够导致细胞异常增殖的根本原因在于其分子结构上含有相应的功能区域(亚分子单位)。成纤维细胞生长因子虽然可以在哺乳动物细胞培养系统表达，但其生长成本高昂。
本发明的目的在于提供一种基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽(rFGF8a)及通过基因重组技术生产该多肽的方法，从而开发出一种成本较低、无副作用的基因重组成纤维细胞生长因子。
本发明在亚分子水平对成纤维细胞生长因子-8基因进行重新组合，从根本上避免了上述副作用的产生。本发明用来表达多肽的基因编号是基因重组成纤维细胞生长因子-8a(rfgf8a)。通过药理研究发现rFGF8a主要是通过促进细胞分化来体现其多方面的生理和药理作用。本发明通过筛选，采用合适的宿主，显著降低了生产成本。
本发明中的基因重组成纤维细胞生长因子-8a的碱基序列基本特征是序列为fgf-8基因各转录(transcription)产物所共有的，而fgf-8基因可以从有关数据库(如GeneBank)检索到。
一种基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽，该多肽具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明的基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的制备方法，包括下列步骤1) 基因重组应用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)技术在90～60℃条件下反应2.0～2.5小时获得fgf8 cDNA，再将其与克隆质粒连接，然后用选择限制性内切酶在35～40℃切下cDNA片断并用连接酶将其嵌入表达载体内；2) 将重组表达载体导入宿主将重组表达载体与宿主小心混匀并放置冰上25～30分钟，进行热处理后再放回冰上放置1～3分钟，加入0.8～1.0ml的LB培养液在35～40℃摇荡0.5～1.5小时，取一定量铺于琼脂平板上，15～25分钟后反置于35～40℃温室培养隔夜；3)基因表达将已经转化了的宿主先在35～40℃以及45～55μg/ml卡那霉素的条件下培养至OD600为0.5时加以0.5～1.5mM IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)并在30～35℃条件下诱导表达1.5～2.5小时；4)提取活性多肽诱导表达后，将细菌离心沉淀再悬浮在缓冲溶液中，用超声波破碎细菌后离心沉淀取其上清液，采用高压液相技术纯化。
本发明的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤1)中的温度控制条件为90℃ 40秒、60℃ 1分钟、72℃ 2分钟，共35个循环。
本发明的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤1)中采用的克隆质粒为pGEM-T，选用NdeI和SacI为选择限制性内切酶，连接酶为Ligase，载体为pET28。
本发明的另一特征在于步骤2)中所述的宿主为大肠杆菌，大肠杆菌的的基因型为F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcmΔ(srl-recA)306Tn10(DE3)。
本发明的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其又一特征在于步骤2)中所述的热处理为在40℃的水浴中放置25～30秒。
本发明的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤4)中所述的缓冲溶液为8M尿素，0.1M磷酸二氢钠和0.01M Tris，pH8.0。
本发明的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤4)中所述的高压液相技术纯化的步骤及所用缓冲溶液如下洗涤，8M尿素，0.1M磷酸二氢钠和0.01MTris，pH6.3；重折叠，1M尿素，0.5M氯化钠，20％甘油和0.05MTris，pH7.5；洗脱，0.05M磷酸二氢钠，0.3M氯化钠和0.25M imidazole，pH8.0。
本发明已发现的生物活性如下1.上调细胞间隙连接蛋白Cx43的表达。正常细胞需要与其它细胞保持结构和功能两方面的联系才能发挥其正常的生理作用。Cx43是一种组成细胞间隙连接通道的重要蛋白质。Cx43的高表达可以抑制恶变的趋势。实验证明rFGF8a具有明显提高Cx43表达水平的作用(图4)。皮肤的组织结构分为上面的表皮和下面的真皮。皮肤的血液供应特点是真皮含有血管而上皮不含血管。皮肤上皮由五层细胞组成。细胞之间的联系(包括营养输入和代谢产物排出)需要细胞间隙连接通道来维持。如图4所示，在系统中加入rFGF8a之后，通过免疫组化检测显示Cx43表达水平(A)明显高于对照组(B)。正是因为rFGF8a明显提高了Cx43表达水平，明显加强了细胞间隙连接蛋白(Cx43)的功能，从而加强了上皮与真皮之间的联系，因此改善了上皮营养，活化了上皮功能。
2.促进伤口愈合伤口愈合是一个十分复杂的综合过程，涉及病理生理学和病理解剖学的一系列变化。其中一个很重要的过程是创缘的上皮细胞向心移行并覆盖伤口。这一环节需要细胞间隙连接通道来保证生物信息在各细胞间的传递和协调。rFGF8a从分子水平主动调控细胞功能以及细胞与细胞之间的相互联系，加强细胞连接和促进创缘细胞向心迁移，显著缩短愈合时间。由于缩短了愈合时间，减少了斑痕疙瘩形成机会。提高伤口愈合质量对于整形外科尤为重要。同一动物左右前肢用活检冲制作大小和深度一样的创口，其直径为3mm，直接把本发明的rFGF8a溶液(1毫克/毫升)施用在左前肢的伤口上，连续三天，每天一次，每次3微升，不另加敷料，右前肢施用同量生理盐水作为对照。四天后测量伤口的长短径，取其平均值，其数据列于表1，施用和未施用本发明rFGF8a的同一动物左右前肢伤口如图5所示。
表1同一动物左右前肢活检冲制伤口长短径平均值(mm)
由表1和图5可见，加本发明rFGF8a的左前肢的伤口愈合程度明显优于对照组(P＜0.01)。
3.促进软骨分化。软骨细胞的形成需要间质细胞集结和分化两个过程。细胞集结形成之后，如果用药物阻断细胞间隙连接通道则软骨分化延迟甚至停滞。本实验是由微集块培养法(Micromass Culture)改良而成。取孵化第三天的鸡胚胎，无菌操作条件下，切下前肢芽远端三分之一，去除外胚层，经0.1％ trypsin和0.1％conllagenase双酶溶液在37℃下消化10分钟。加入胎牛血清以终止酶消化。消散开的细胞以1×107 cells/ml的密度培养(37℃，5％CO2)。选择DMEM(Dulbecco’s modified Eagles’s medium，Life Technologies产品)为培养液。加入rFGF8a以促进软骨分化。rFGF8a的终末浓度为20-100ng/ml。细胞培养48小时后经25％多聚甲醛固定后用1％ Alcian blue(Sigma)染色3小时。这一步骤使软骨成份Sulfated Proteoglycans染成蓝色。再用70％乙醇洗去未着色的剩余染料。在低倍显微镜下观察照相。为了定量分析软骨成份则用0.5ml 4M胍(guanidine HCl)pH5.8将软骨成份中的蓝色提取出来。用分光光度计在OD＝600nm的条件下测其浓度(如表2所示)。软骨成份含量与所提取的蓝色浓度成正比。
表2OD＝600nm条件下的蓝色浓度
实验表明rFGF8a具有显著的促进软骨细胞分化的作用(图6)是与其增加细胞连接通道数量以及提高功能有着直接的关系。如表2所示，施用本发明的rFGF8a48小时后(A)再用Alcianblue染色显示新生软骨团数量和由软骨细胞产生的软骨成分含量都比对照组(B)明显增多(P＜0.01)。
4.活化成骨细胞，促进骨痂形成在正常骨组织里成骨细胞和破骨细胞的数目和功能处在动态平衡的过程中。骨折之后成骨细胞的数目增多功能加强以促进骨痂形成。用鼠成骨细胞加以rFGF8a培养24-48小时可见DNA同位素掺入明显增加。
本发明的优点是制备出的rFGF8a多肽成本低，具有多种生物活性，即上调细胞连接蛋白(Connexin 43)表达，活化上皮功能，加速伤口愈合，以及促进软骨分化等，且无副作用。
下面结合附图
和实施例对本发明作进一步详细的说明。
2.重组表达载体导入大肠杆菌选用大肠杆菌E.ColiBl21(美国Novagen公司商品)作为宿主细胞(其基因型为F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcmΔ(srl-recA)306Tn10(DE3))。将重组表达载体(3ng)与感受态大肠杆菌(100ul)小心混匀并放置冰上30分钟。之后进行热处理(42℃水浴30秒)再放回冰上放置2分钟。加入0.9mlLB培养液(含葡萄糖20mM)，37℃摇荡1小时。取200ul铺于琼脂(含50μg/ml卡那霉素)平板上，20分钟后，反置于37℃温室培养隔夜。选择阳性菌落并接种于30mlLB培养液(含50μg/ml卡那霉素)，37℃隔夜。其中3ml用来提取重组表达载体。通过酶切验证正确后，将其余菌液与甘油(终浓度为15％)混匀并分装保存在-70℃备用。重组表达载体酶切图谱如图2所示。本文所用限制性内切酶均为美国Life Technologies公司的产品。
酶切条件600ng待切DNA，内切酶的反应浓度为1∶10稀释，所用的十倍浓度缓冲液也是美国Life Technologies公司的产品。酶切温度37℃消化时间90分钟。pET28的分子量是5.3Kb，所插入的fgf-8片断是0.6Kb.所以重组后的达质粒是5.9Kb。
ApalpET28本身和所插入的fgf-8片断各有一个Apal切点。环状的质粒在两个切点切开后，形成两个片断，分别为4.3Kb和1.6Kb。
NdeI是插入点。刚好切下0.6Kb的产物，证明0.6 Kb的fgf-8片断已被插入。
SstI相当于把环状质粒切成线状，其分子量是5.9Kb，等于pET28(5.3Kb)加上插入的fgf-8片断(0.6Kb)。
Uncut未经酶切，质粒依旧环状，在电泳条件下，其运动速度不与分子量成正比而出现多条带的结果。
3.基因表达将已转化了的大肠杆菌先在37℃以及50μg/ml卡那霉素的条件下培养至OD600为0.5时加以1mM IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)并在32℃温度诱导表达2小时。
4.提取活性多肽诱导表达后，将细菌离心沉淀再悬浮在缓冲溶液(8M尿素，0.1M磷酸二氢钠和0.01MTris，pH8.0)中。用超声波破碎细菌后离心沉淀(Eppendort5402离心机，14,000rpm，4℃，30分钟)取其上清液。采用高压液相技术纯化rFGF8a多肽。所用缓冲溶液如下洗涤，8M尿素，0.1M磷酸二氢钠和0.01M Tris，pH6.3；重折叠，1M尿素，0.5M氯化钠，20％甘油和0.05MTris，pH7.5；洗脱0.05M磷酸二氢钠，0.3M氯化钠和0.25M imidazole，pH8.0。表达产物如图3所示。透析后测定蛋白浓度。纯化了的rFGF8a保存在溶液(0.5M氯化钠，5％甘油和0.05M Tris，pH7.5)之中。所测的rFGF8a的分子量为26KD，而本发明先用的大肠杆菌E.ColiBl21是已知的菌株，不会产生如此高产量的该分子量的多肽，该分子量的多肽是由于E.ColiBl21转染了表达载体，加上采用卡那霉素的选择和IPTG的诱导而产生的。
序列表(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A) 长度203个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 拓扑结构球形(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.11 Mgsshhhhhh ssglvprgsh mqhvreqslv tdqlsrrlir tyqlysrtsg khvqvlankr inamaedgdp71 faklivetdt fgsrvrvrga etglyicmnk kgkliaksng kgkdcvfteI vlennytalq nakyegwyma141 ftrkgrprkg sktrqhqrev hfmkrlprgh htteqslrfe flnyppftrs lrgsqrtwap epr
权利要求
1.一种基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽，该多肽具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的制备方法，包括下列步骤1)基因重组应用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)技术在60～90℃条件下反应2.0～2.5小时获得fgf8 cDNA，再将其与克隆质粒连接，然后用选择限制性内切酶在35～40℃切下cDNA片断并用连接酶将其嵌入表达载体内；2)将重组表达载体导入宿主将重组表达载体与宿主小心混匀并放置冰上25～30分钟，进行热处理后再放回冰上放置1～3分钟，加入0.8～1.0ml的LB培养液在35～40℃摇荡0.5～1.5小时，取一定量铺于琼脂平板上，15～25分钟后反置于35～40℃温室培养隔夜；3)基因表达将已经转化了的宿主先在35～40℃以及45～55μg/ml卡那霉素的条件下培养至OD600为0.5时加以0.5～1.5mM IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)并在30～35℃条件下诱导表达1.5～2.5小时；4)提取活性多肽诱导表达后，将细菌离心沉淀再悬浮在缓冲溶液中，用超声波破碎细菌后离心沉淀取其上清液，采用高压液相技术纯化。
3.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤1)中的RT-PCR反应温度控制条件为90℃ 40秒、60℃ 1分钟、72℃ 2分钟，共35个循环。
4.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤1)中采用的克隆质粒为pGEM-T。
5.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤1)中选用NdeI和SacI为选择限制性内切酶。
6.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤1)中所述的连接酶为Ligase。
7.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤1)中所述的载体为pET28。
8.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤2)中所述的宿主为大肠杆菌。
9.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤2)中所述的热处理为在40℃的水浴中放置25～30秒。
10.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤4)中所述的缓冲溶液为8M尿素，0.1M磷酸二氢钠和0.01MTris，pH8.0。
11.根据权利要求2所述的制备基因重组成纤维细胞生长因子-8a多肽的方法，其特征在于步骤4)中所述的高压液相技术纯化的步骤及所用缓冲溶液如下洗涤，8M尿素，0.1M磷酸二氢钠和0.01M Tris，pH6.3；重折叠，1M尿素，0.5M氯化钠，20％甘油和0.05M Tris，pH7.5；洗脱，0.05M磷酸二氢钠，0.3M氯化钠和0.25M imidazole，pH8.0。
全文摘要
本发明公开了一种基因重组成纤维细胞生长因子－8a多肽(rFGF8a)及其制备方法。本发明在亚分子水平对成纤维细胞生长因子－8基因进行重新组合,消除了因其促进细胞增生而导致恶变的潜在危险。这种多肽具有上调细胞连接蛋白(Connexin 43)表达,活化上皮功能,加速伤口愈合,以及促进软骨分化等生物活性。
文档编号C07K14/435GK1373141SQ01109400
公开日2002年10月9日 申请日期2001年3月7日 优先权日2001年3月7日
发明者林俊生 申请人:林俊生