人心钠素基因、其强效突变型与人脑钠素基因在治疗相关疾病中的应用的制作方法

专利名称：人心钠素基因、其强效突变型与人脑钠素基因在治疗相关疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及强效突变型人心钠素基因，包含所述基因的表达型重组体及所述基因在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。本发明还涉及由所述基因编码的强效突变型人心钠素多肽。本发明还涉及所述强效突变型人心钠素基因或野生型人心钠素基因单独或与人脑钠素基因复合治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压的应用。
心钠素是一种主要由心房肌细胞合成和分泌的多肽类激素，脑钠素则主要由心室肌细胞合成和分泌。利用心钠素和/或脑钠素多肽所做的研究表明，它们均具有强烈的抑制肾素-血管紧张素(RAS)系统、利尿、利钠、舒张血管和参与水电平衡调节等广泛的生理作用。虽然体内外实验均已证实心钠素多肽和脑钠素多肽具有上述广泛的生理作用，人们也希望利用它们来治疗某些疾病如肾病综合征、慢性心功能不全和高血压，但现实情况却是，人们无法克服其半衰期短的缺陷。静脉滴注似乎可以弥补此不足，可长时期灌注也不现实。因此，有关心钠素和脑钠素的基础研究和临床应用都是不能令人满意的。
另一方面，因为心钠素和脑钠素具有抑制RAS系统、利尿、利钠、舒张血管和调节电解质平衡等广泛的生理作用，所以，用心钠素和/或脑钠素基因作为功能基因的基因疗法来治疗或辅助治疗肾病综合征和慢性心功能不全还是极有可能的。但是目前的基因治疗方案大多是根据单基因遗传病基因治疗的策略(补偿、抑制或活化等)来制定的。比如，抑制癌基因或激活抗癌基因的表达、补偿明显缺乏的某种功能分子等等。可以看出，这些方案对于疾病遗传基础的针对性和对其遗传背景知识的依赖性都是非常强的。然而，对于多基因疾病来说，当前还无法了解或彻底揭示其遗传本质。再者，就是在已经肯定了它们的相关基因或致病基因的情况下，也难以采用上述策略来一一对应地来同时纠正多个缺陷基因的功能。由此看来，“缺什么补什么”的原则是不适于多基因疾病的基因治疗的，至少目前是如此。还有，据估计，在6000多种遗传性疾病中，单基因疾病只占30％，而多基因疾病却占70％。多基因疾病的发病率高、危害严重、损失巨大并且难以治愈的特点又要求人们不断寻求新的治疗手段。有鉴于此，本发明人提出了表型基因治疗的策略。这是一种在不了解疾病的遗传背景的情况下，直接针对其表型(症状)而进行的基因治疗。就是利用基因治疗的原理和方法将某种或几种可以产生消除病征、恢复正常生理表型的物质的基因(在本发明中是心钠素基因和脑钠素基因)导入患者体内，并在其中持续、稳定地表达，从而实现治疗或治愈患者本身疾病的目的。这就象是将微型药厂建在了体内，可以连续不断地为患者提供药物分子。也就是说，与传统治疗手段相比，表型基因治疗只是在药物形式和给药方式上有所改变，即直接使用DNA药物。如能将此设想变为现实，将为许多发病率高、危害严重而现时又难以治疗的多基因疾病的治疗开辟一条新路。
因此，本发明的一个目的在于提供一种强效突变型人心钠素基因，其编码的强效突变型人心钠素相比于野生型人心钠素具有延长的半衰期。
本发明的另一目的在于提供包含所述强效突变型人心钠素基因、野生型人心钠素基因或人脑钠素基因的表达型重组体。
本发明的再一目的在于提供所述强效突变型人心钠素基因或野生型人心钠素基因单独或与人脑钠素基因复合在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。
根据本发明的一个方面，提供了一种强效突变型人心钠素的重组DNA(mhANP)及包含所述DNA的表达型重组体。所述强效突变型人心钠素的重组DNA(mhANP)的核苷酸序列如SEQ ID No3所示，其是将野生型人心钠素28肽(hANP28)编码区的第8和第12个氨基酸的密码子TTC/Phe8和ATG/Met12分别突变成mhANP中对应的TCC/Ser8和ATA/Ile12的结果，以下简称该重组DNA为mhANP。mhANP所编码的活性多肽mhANP28的氨基酸序列如SEQ IDNo4所示。
本发明的基因mhANP可以根据本领域公知的技术引入各种表达载体以构建表达型重组体，从而表达所述强效突变型人心钠素多肽mhANP28。这些表达重组体也可用于治疗肾病综合征、慢性心功能不全、高血压等疾病。这样的表达型重组体的例子包括pLHY24、pYF1等(详见实施例)。
本发明的另一方面涉及强效突变型人心钠素基因或野生型心钠素基因在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。
本发明的再一方面涉及强效突变型人心钠素基因或野生型人心钠素基因与人脑钠素基因复合在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。
在本发明的这一治疗应用方面，利用了一种具有少尿特征的肾病综合征动物模型，即由阿霉素(adriamycin，ADR)诱导的大鼠肾病综合症(NS)模型。以大鼠NS模型作为心钠素基因体细胞基因治疗的对象，主要是为了探讨在肾功能出现障碍的情况下，心钠素基因以及心钠素和脑钠素基因经体细胞转移后的长期利尿、利钠作用和肾保护功能，为治疗肾病综合征提供参考。在本发明的一个实施方案中，经肌肉将mhANP的真核细胞表达重组体pLHY24的裸露DNA导入这种具有少尿特征的模型动物体内，最后观测到了持续和明显的利尿作用，对受损肾脏也有明显的保护作用，而且没有发现明显的毒副作用(见实施例)。
另外，本发明利用了一种机械损伤所致的心力衰竭模型动物，即心瓣膜损伤法获得的大鼠心衰模型，并采用基因治疗的直接体内法，经肌肉将mhANP和hBNP的表达型重组体pLHY24和pLT28的裸露DNA导入心力衰竭模型动物体内，最后观测到了缺血心脏心电图的明显改善、心肌增生受到抑制和能量代谢显著改善等变化，说明利钠多肽基因如心钠素和脑钠素在体内的持续表达对心力衰竭具有良好的治疗作用。
本发明还利用了自发性高血压大鼠(SHR)模型测试了本发明的mhANP多肽对降低动物血压或抑制动物血压升高的作用。
如上所述，本发明的提供的是一种表型基因治疗的策略，与传统的治疗手段相比，表型基因治疗所用药物在形式上有了根本性的改变，不再是某种基因的最终表达产物，而是编码这种表达产物的基因本身，即所谓的基因药物或DNA药物。所以，本发明具有重要的理论意义和现实意义。
在本发明中，例如，为了获得肯定的结果，首先用5mg/kg体重的剂量，采用基因治疗中基因转移的直接体内法，将hANP和mhANP的真核细胞表达型重组体pLHY19和pLHY24以裸露DNA的形式分别导入没有任何遗传背景的NS模型动物体内，最后，观测到了持续和明显的利尿作用。对导入DNA药物后第5天、第10天和第15天的尿量/体重比的增长量(分别与治疗前的值相比)的分析表明，mhANP在第5天和第10天的利尿作用强度分别是hANP的1.60倍(2.75/1.72)和2.04倍(6.89/3.37)。该结果说明，通过将野生型的hANP改造成突变型的mhANP，我们达到了预期的突变增效的目的，获得了强效突变型的人心钠素基因mhANP。
以下将参照序列表、附图和实施例详细描述本发明，其中SEQ ID NO1是野生型人心钠素基因hANP的核苷酸序列，其中的黑体字示活性多肽hANP28的编码区序列。
SEQ ID NO2是hANP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中的黑体字示活性多肽hANP28的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是mhANP的核苷酸序列，其中的黑体字示活性多肽mhANP28的编码区序列，黑斜体并且有下划线者是mhANP28特有的突变密码子。
SEQ ID NO4是mhANP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中的黑体字示活性多肽mhANP28的氨基酸序列，黑斜体并且有下划线者为活性多肽mhANP28特有的氨基酸。
SEQ ID NO5是野生型人脑钠素基因hBNP的核苷酸序列，包括3外显子，2个内含子。其中的大写字母示外显子，小写字母示内含子。
SEQ ID NO6是hBNP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中的黑体字表示活性多肽hBNP32的氨基酸序列。


图1示出了重组体pLT17的构建过程。
图2示出了重组体pLT18和pLT19的构建过程。
图3示出了重组体pLHY19的构建过程。
图4示出了重组体pLHY24的构建过程。
图5示出了重组体pYF1的构建过程。
图6示出了重组体pYB1的构建过程。
图7示出了重组体pLT25的构建过程。
图8示出了重组体pLT28的构建过程。
图9示出了重组体pYF2的构建过程。
图10示出了静脉注射阿霉素对大鼠体重的影响(实施例4)。
图11示出了静脉注射阿霉素对大鼠尿量的影响(实施例4)。
图12示出了静脉注射阿霉素对大鼠尿尿蛋白的影响(实施例4)。
图13示出了突变对心钠素基因利尿作用的影响(实施例4)。
图14示出了心钠素基因突变对动物“尿量/体重比的增长量”的影响(实施例4)。
图15示出了静脉注射阿霉素对大鼠体重的影响(实施例5)。
图16示出了静脉注射阿霉素对大鼠尿量的影响(实施例5)。
图17示出了静脉注射阿霉素对大鼠尿尿蛋白的影响(实施例5)。
图18示出了逆转录病毒载体介导mhANP和hBNP基因转移对动物尿量的影响(实施例5)。
图19示出了逆转录病毒载体介导mhANP和hBNP基因转移对动物尿蛋白的影响(实施例5)。
图20示出了普通质粒载体介导mhANP和hBNP基因转移对模型动物尿量的影响(实施例6)。
图21示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因两周后对慢性心功能不全动物心脏重量的影响(实施例7)。
图22示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因两周后对慢性心功能不全动物心脏指数的影响(实施例7)。
图23示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物心率的影响(实施例7)。
图24示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物能量代谢物质ATP的影响(实施例7)。
图25示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物能量代谢物质Pcr的影响(实施例7)。
图26示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物能量代谢物质LA的影响(实施例7)。
图27示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物血压的影响(实施例7)。
图28示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物体重的影响(实施例7)。
图29示出了肌肉注射mhANP基因对慢性心功能不全动物心电图的影响(实施例7)。
图30示出了mhANP基因经胶原法转移对SHR大鼠血压的影响(实施例8)。
图31示出了mhANP基因经胶原法转移对SHR大鼠尿量的影响(实施例8)。
实施例1 人心钠素基因的突变改造为提高心钠素基因产物的生理活性和延长其半衰期，用定点突变法对其基因进行了改造。1.编码hANP28第8和12位氨基酸的密码子的突变改造为延长心钠素的半衰期和提高其生理活性，对野生型人心钠素基因中成熟28肽hANP28编码区的第8和第12位密码子进行突变改造。将TTC/Phe8和ATG/Met12分别突变成TCC/Ser8和ATA/Ile12，从而获得突变型的人心钠素基因mhANP。为达此目的，设计、合成和选择使用了下列PCR引物(引物T3和T7为通用引物)，其序列如下T3 5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3，T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3，Pm15’-GCTGCTCCTGCAGGGGGCAGGATAGACAGGATTGG-3，Pm25’-CTGCCCCCTGCAGGAGCAGCTGGATCTCCG-3，对于Pm1来说，除了要将hANP28编码区第12位氨基酸Met的密码子ATG改为Ile的密码子ATA外，还在其5′端的CG之间加入了四个碱基TGCA，以引进一个PstI酶切位点。对于Pm2来说，除了要将第8位氨基酸的密码子由TTC/AAG8改成TCC/AGG8外，也在其旁边引进了PstI酶切位点。引物T3和Pm2的PCR扩增产物长450bp，Pm1和T7的扩增产物长120bp。1.1.对hANP28第8位氨基酸密码子的突变改造以重组体pLHY9(克隆有野生型hANP cDNA的pBluescript II SK载体，本发明人早期构建)中的hANP cDNA为模板，首先利用引物T3和Pm2(其中含有1个PstI位点和hANP28第8位氨基酸的突变密码子TTC/Phe8→TCC/Ser8)进行PCR，以完成对hANP28第8位氨基酸密码子的突变改造。PCR反应参数为100ul反应体系，引物各25pmol，dNTP 20nmol，水浴中煮沸10分钟，立即置冰浴中5分钟，加pfu DNA聚合酶2单位，石蜡油50ul，混匀后直接进入循环94℃35秒、54℃60秒、72℃60秒，共30个循环，72℃延伸PCR产物10分钟。抽提、纯化引物T3和Pm2的PCR扩增产物，用BamHI和PstI双酶切后，用低融点琼脂糖凝胶电泳法回收PCR产物中的400bp片段，与同样经BamHI和PstI处理过的质粒载体相连，从而获重组体pLT17(见图1)。2.2.对hANP28第12位氨基酸密码子的突变改造以重组体pLHY9(见上述)的hANP cDNA为模板，用引物T7和Pml(其中含有1个PstI位点和hANP28第12位氨基酸的突变密码子ATG/Met12→ATA/Ile12)进行PCR，以完成对hANP28第12位氨基酸密码子的突变改造。PCR反应参数同前。抽提、纯化引物T3和Pm2的PCR扩增产物，用PstI和KpnI双酶切后再抽提、纯化之，直接与同样经BamHI和PstI处理过的质粒载体相连，获重组体pLT18(见图2)。
由重组体pLT18中hANP cDNA的序列分析结果知道，在BamHI至KpnI之间的序列中，除了我们特意加的PstI位点中间的4个碱基外，其它序列已与预计的突变改型hANP(hmANP)cDNA一致。用PstI酶切、T4 DNA聚合酶削平PstI酶切后产生的突出的3’端后自身连接的办法正好可以除去这4个额外的碱基。所以，用PstI切割重组体pLT18，在dNTP存在的条件下用T4 DNA聚合酶削平，自身连接获重组体pLT19(见图2)。实施例2 hANP和mhANP真核细胞表达型重组体的构建为实现在真核细胞中表达心钠素的目的和研究突变对心钠素多肽的生理活性及其半衰期的影响，用逆转录病毒载体构建了hANP和mhANP的表达型重组体pLHY19和pLHY24，用普通质粒载体构建了mhANP的表达型重组体pYF1。1.含hANP的重组体pLHY19的构建构建pLHY19时用到的pLHY17是一过渡质粒，它是将人巨细胞病毒CMV的启动子(CMV)、兔β-珠蛋白基因的第二内含子(intron)和野生型人心钠素基因(hANP)共同组成的表达元件组合克隆进普通质粒载体pBluescript II SK+/-中的结果。构建该过渡质粒的目的在于便于将这一表达元件组合整体克隆进逆转录病毒载体pLNCX。
pLNCX全长6620bp，主要由Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)的长末端重复序列(5’LTR和3’LTR)、其5’LTR启动子控制的便于真核细胞筛选的抗性基因Neor、大肠杆菌素复制起点(ColE1)、便于原核细胞筛选的抗性基因Ampr和供外源基因插入的多克隆位点等组成。
构建pLHY19的目的是为了便于野生型人心钠素基因hANP在真核细胞中表达。构建的方法是用XbaI切重组质粒pLHY17，在dNTP存在的条件下，用Klenow补平，再用HindIII切割，回收由人巨细胞病毒的启动子CMV、兔β-珠蛋白基因的第二内含子(intron)和野生型人心钠素基因hANP共同组成的表达元件组合(1870bp的片断)，然后与经BamHI、Klenow和HindIII处理过的逆转录病毒载体pLNCX相连，从而获重组体pLHY19(见图3)。2.含mhANP的重组体pLHY24的构建构建pLHY24时所用到的pLHY23也是一过渡质粒，它是将CMV的启动子、兔β-珠蛋白基因的第二内含子和突变型人心钠素基因mhANP共同组成的表达元件组合克隆进质粒载体pBluescript IISK+/-中的结果。构建该过渡质粒的目的是为了将这一表达元件组合整体克隆进逆转录病毒载体pLNCX。
构建pLHY24的目的是为了突变型人心钠素基因mhANP在真核细胞中的表达。其方法是用XbaI切重组质粒pLHY23，在dNTP存在的条件下，用Klenow补平，再用HindIII切割，回收1870bp的片断，然后与同样经XbaI、Klenow和HindIII处理过的逆转录病毒载体pLNCX相连，从而获重组体pLHY24(见图4)。3.含mhANP的重组体pYF1的构建构建pYF1所用质粒载体pcDNA3.1(-)Myc-His A是Invitrogen公司的产品。在该载体中，除一般质粒都具有的抗性基因Ampr、复制起点ColE1和供目的基因插入的多克隆位点外，还有控制目的基因表达的启动子CMV、牛生长激素(BGH)poly(A)信号BGHpA、SV40启动子、由SV40启动子控制的抗性基因Neor和SV40的poly(A)信号。
构建pYF1的目的在于用普通质粒来介导突变型人心钠素基因mhANP在真核细胞中的表达。其方法是用SalI和HindIII双酶切重组质粒pLHY23，回收由兔β-珠蛋白基因第二内含子(Intron)和mhANP cDNA构成的1120bp片断，与经XhoI和HindIII处理过的质粒载体pcDNA3.1(-)Myc-His A相连，从而获重组体pYF1(见图5)。实施例3 hBNP真核细胞表达型重组体pLT28和pYF2的构建1.重组体pYB1的构建为获得编码人脑钠素的基因组DNA hBNP，设计了两个PCR引物P1和P2，在P1和P2中分别引入了EcoRI和ClaI识别切割位点，其序列如下P15’-CGCGAA TTCACC ATG GAT CCC CAG ACA GCA CC-3’P25’-CGCATC GATTTA ATG CCG CCT CAG CAC-3’PCR反应参数为100ul反应体系，以100ng人基因组DNA作模板，引物各25pmol，dNTP 20nmol，水浴中煮沸10分钟，立即置冰浴中5分钟，加pfu DNA聚合酶2单位，石蜡油50ul，混匀后直接进入循环94℃30秒、56℃36秒、72℃90秒，共30个循环，72℃延伸PCR产物10分钟。抽提、纯化引物PCR产物，用EcoRI和ClaI分别切之，用低融点琼脂糖凝胶电泳法回收1.2kb PCR产物，再抽提、纯化一次，与同样经EcoRI和ClaI处理过的质粒载体pBluescript II SK相连，从而获重组体pYB1(见图6)。2.重组体pLT25的构建pLHY16也是一过渡质粒，它是将CMV的启动子、兔β-珠蛋白基因的第二内含子组成的表达元件组合克隆进质粒载体pBluescript II SK+/-中的结果。构建该过渡质粒的目的是为了便于将有关目的基因克隆到这一表达元件组合的下游，进而便于将它们整体克隆进有关的表达载体中。
构建pLT25的目的是为了野生型人脑钠素基因hBNP在真核细胞中表达。其方法是用EcoRI切质粒pYB1，在dNTP存在的条件下用Klenow补平，再用KpnI切割，回收1.2kb的片断，然后与经BamHI、Klenow和KpnI处理过的质粒pLHY16相连，获重组体pLT25(见图7)。3.hBNP的逆转录病毒表达重组体pLT28的构建用SalI切割pLT25，回收1.84kb的DNA片断，然后与经SalI和XhoI处理过的质粒pLHY24相连，获重组体pLT28(见图8)。4.hBNP的普通质粒型表达重组体pYF2的构建过程用EcoRI切重组体pYB1，在dNTP存在的条件下用Klenow补平，再用XhoI切割，回收1.2kb的hBNP片断，与经BamHI、Klenow和XhoI处理过的质粒pYF1相连，获重组体pYF2(见图9)。实施例4 心钠素基因突变对心钠素多肽生物活性的影响1.hANP和mhANP表达重组体pLHY19和pLHY24质粒DNA的制备1.1用碱裂解法大量制备质粒DNA1.2用PEG沉淀法纯化质粒DNA具体步骤见分子克隆实验手册。2.大鼠肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)动物模型的制备5周龄雄性Wistar大鼠购回后适应环境1-2周，编号、称体重、随机分组。腹腔注射2％戊巴比妥钠(45mg/kg体重)麻醉，待麻醉药物生效后于温水中浸泡鼠尾，使血管扩张。将水擦干，用75％酒精棉球擦拭鼠尾。按5.0mg/kg体重的剂量经尾静脉缓慢注入溶于生理盐水的阿霉素(adriamycin，ADR，2mg/ml)。每周定时称量体重、收集尿液和测定尿蛋白浓度等指标。3.代谢笼法收集尿样定时按5ml生理盐水/100g体重的剂量给大鼠灌胃，置代谢笼中(1只/笼)，禁食、禁水6小时并收集尿样。准确测定尿液体积，3000rpm离心5分钟，以去除颗粒性杂质，用于测定尿蛋白浓度等指标。4.裸露DNA的肌肉注射将经纯化的重组体pLHY24和LT28的裸露DNA溶于生理盐水中，使成1mg/ml的溶液。用腹腔注射戊巴比妥钠(25mg/kg体重)的方法麻醉具少尿特征的肾病综合征模型动物，按2.5mg/kg体重的剂量在其双后肢肌肉(3处/肢)分别注入约占总量1/6的DNA溶液，缓慢推入溶液，迅速拔针，并在注射部位略加按摩。5.尿蛋白的定性、定量分析5.1定性分析取尿样1ml，加20％硫柳酸(20％磺基水杨酸∶95％酒精＝2∶1)1～2滴，混匀后以混浊程度初步判断蛋白含量。如结果为(-)～(+)，定量分析时，尿样不稀释，如结果为++、+++和++++，尿样需分别稀释4、6和8倍。5.2定量分析试剂25％牛血清白蛋白(25mg牛血清白蛋白，5ml 10％叠氮钠，加去离子水至100ml)，12.5％三氯醋酸(AcCl3)。
方法标准对照标准管4ml牛血清白蛋白+1ml AcCl3对照管4ml生理盐水+1ml AcCl3
样品管a.不稀释时标准管4ml尿样+1ml AcCl3对照管4ml尿样+1ml去离子水b.稀释4倍时标准管1ml尿样+3ml去离子水+1ml AcCl3对照管1ml尿样+4ml去离子水c.稀释6倍时标准管1ml尿样+5ml去离子水+1ml AcCl3对照管1ml尿样+6ml去离子水d.稀释8倍时标准管1ml尿样+7ml去离子水+1ml AcCl3对照管1ml尿样+8ml去离子水测定条件72-1分光光度计，波长420nm，用对照管调零和调100。
计算公式样品OD值/标准OD值×25×稀释倍数＝尿蛋白浓度(mg％)6.统计学处理对尿量/体重比和尿蛋白浓度等实验数据进行统计学处理。7.结果为获得肯定结果，首先使用了较高剂量的基因药物。hANP和mhANP的表达型重组体pLHY19和pLHY24裸露DNA的剂量均为5mg/kg体重。采用直接体内法，经后肢肌肉将其分别注入NS模型动物体内，其结果如下7.1大鼠NS动物模型的制备按7.5mg/kg体重的剂量经尾静脉缓慢注入溶于生理盐水的ADR后，每周定时观测体重、尿量和尿蛋白浓度等指标。经统计学分析，发现注射ADR后，大鼠体重的增长速度明显降低，尿量明显减少，尿蛋白浓度明显增加。结果见图10、11和12。7.1.2心钠素基因突变前后利尿活性的比较ADR诱导的大鼠NS动物模型具有少尿的特征。通过肌肉注射法将hANP和mhANP基因的表达型重组体pLHY19和pLHY24分别导入动物体内后，与注射空载体的非治疗组的动物相比，治疗组动物的尿量明显增加，到第10和第15天时，mhANP组的尿量已恢复到正常组的水平。hANP和mhANP利尿作用的有效期分别为2周和3周(结果见图13)。
经对导入DNA药物后动物“尿量/体重比的增长量”(分别与治疗前的值相比)的分析，发现mhANP在第5、10和15天的利尿作用强度分别是hANP的1.60倍(2.75/1.72)、2.04倍(6.89/3.37)和1.91倍(10.05/5.26)。心钠素基因突变对模型动物“尿量/体重比的增长量”的影响见图14。
以上结果说明，通过对hANP基因的定点突变，达到了预期的增强生物活性和延长有效作用时间的目的，亦即我们获得了强效突变型的人心钠素基因mhANP。实施例5 mhANP基因的逆转录病毒表达型重组体经体细胞转移治疗肾病综合征1.方法除有特别说明外，试验方法同前。
在本实施例中所用的mhANP基因的逆转录病毒表达型重组体为pLHY24。为增强本策略的实用性和探讨治疗的最佳方案，把基因药物的剂量降到了2.5mg/kg体重，还专门为重组体pLHY24设1个“0.25mg/kg体重”组。
本实施例所用的mhANP基因的表达型重组体是pLHY24。构建它们所用的载体是在国内外获广泛应用的逆转录病毒载体pLNCX。至今未见逆转录病毒载体因为重组而恢复复制能力的报道、也未见其因为随机插入而导致肿瘤的报道的事实说明，逆转录病毒载体的安全性是非常高的。2.结果2.1NS动物模型的制备所用ADR的剂量为5mg/kg体重。具有少尿特征的NS模型动物的体重、尿量和尿蛋白浓度等指标的变化情况见图15、16和17。2.2肌肉注射mhANP基因对NS动物尿量的影响ADR诱导的NS动物具有少尿的特征。通过肌肉注射法将mhANP基因的表达型重组体导入其体内后，与注射空载体的非治疗组的动物相比，治疗组动物的尿量明显增加，有的已达到或超过了正常组的水平。这种基因导入方法的利尿作用有效期为2-3周。结果见图18。2.3肌肉注射mhANP和hBNP基因对NS动物尿蛋白的影响在导入mhANP基因后的三周内，与非治疗组动物相比，治疗组动物的尿蛋白有降低的趋势。结果见图19。2.4尿钠和尿钾与非治疗组的模型动物相比，治疗组动物的尿钠和尿钾浓度无明显变化。2.5组织学改变mhANP基因经体细胞转移，可以减轻ADR所致NS动物组织器官的损伤程度和促进其恢复。对肾脏来说，mhANP基因的导入，可减轻肾小管上皮的变性坏死和促进其恢复再生，减少肾曲管和集合管内的蛋白管型，减少炎症细胞的浸润。同样，mhANP基因导入后，模型动物的心脏损伤也有恢复趋势。比如心肌颗粒性变减轻，间质中炎性细胞浸润减少，心肌细胞排列较整齐，无明显肌凝集现象等。实施例6 mhANP的普通质粒表达型重组体经体细胞转移治疗肾病综合征1.方法除有特别说明外，试验方法同前。
在本实施例中所用的mhANP基因的表达型重组体为pYF1。为进一步增强本策略的实用性和探讨治疗的最佳方案，把基因药物的剂量降到了0.25mg/kg体重。
本实施例所用的mhANP基因的表达型重组体是pYF1。构建它们所用的载体是获广泛应用的普通质粒载体pcDNA3.1(-)Myc-HisA。2.结果2.1NS动物模型的制备制备NS动物模型的方法同前。2.2肌肉注射mhANP基因对NS动物尿量的影响将mhANP基因的普通质粒表达型重组体pYF1的裸露DNA导入其体内的方法同前，剂量为0.25mg/kg体重。非治疗组动物则注射等容积、等质量的空载体pcDNA3.1(-)Myc-His A。对肌肉注射mhANP基因后第3、6和9天的尿量/体重比进行分析，发现治疗组动物的尿量明显增加。mhANP基因组的有效期为9天。结果见图20。2.3肌肉注射mhANP和hBNP基因对NS动物尿蛋白的影响在导入mhANP和hBNP基因后的9天内，动物尿蛋白浓度未见明显降低。2.4尿钠和尿钾在导入mhANP和hBNP基因后的9天内，动物尿钠和尿钾浓度无明显变化。实施例7 强效突变型人心钠素和脑钠素基因经体细胞转移治疗慢性心功能不全1.mhANP和hBNP表达重组体pLHY24和LT28质粒DNA的制备1.1碱裂解法大量制备质粒DNA1.2PEG沉淀法纯化质粒DNA具体步骤详见分子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社)。2.慢性心功能不全动物模型的构建采用机械性心瓣膜损伤法构建心力衰竭动物模型。腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉动物，分离右颈总动脉，缓慢插入前端剪成斜面的心导管，心导管的另一端连接压力换能器(YP100型)，由LMS-2B型二道生理记录仪记录血压。将心导管缓慢插入，根据血压波形判断心导管前端的位置。当导管通过主动脉瓣进入心室，记录心室内压波，再轻拉导管使其退出心室，出现动脉血压波。推拉导管，使其反复进出心室，以破坏主动脉瓣。大鼠主动脉瓣受损后，心脏因为动脉血回流，心脏排空不全，前负荷增加，术后4-6周，动物会出现心肌缺血性心电图，心肌因为明显的代偿性增生而肥大，心脏重量和心脏指数(心脏重量/体重)增加，心肌内的能量物质如ATP(三磷酸腺苷)、Pcr(磷酸肌酐)含量减少，而能量代谢废物LA(乳酸)的含量则明显增加。Sham组(假手术组)动物是指经同样手术但心瓣膜未受损伤的动物。对于这种动物的处理，除其心瓣膜未受损伤外，其它则与采用机械性心瓣膜损伤法构建心力衰竭动物模型时的完全一样。3.裸露DNA的肌肉注射将经纯化的mhANP和BNP基因的重组体pLHY24和LT28的裸露DNA溶于生理盐水中，使成1mg/ml的溶液。用腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg体重)的方法麻醉模型动物。按5mg/kg体重的剂量在其后双肢肌肉(3处/肢)分别注入约占总量1/6的DNA溶液。缓慢推入溶液，迅速拔针，并在注射部位略加按摩。对照组(非治疗组)和假手术组动物注射等容积的生理盐水。4.治疗结果4.1肌肉注射mhANP和BNP基因对模型动物心脏重量的影响大鼠主动脉瓣受伤后，心脏因动脉血回流而排空不全，前负荷增加，饲养6周后，心脏表现出明显的代偿性增生，心肌肥大，心脏重量和心脏指数(心脏重/体重)增加。对照组(非治疗组)动物平均心脏重量比假手术组增加50％以上。心衰形成后(术后4周)，给治疗组动物经肌肉注射mhANP和hBNP的表达重组体pLHY24和pLT28的裸露DNA(5mg/kg体重)一次，两周后可见心脏的缺血情况缓解，心重和心脏指数均显著降低(p＜0.01)。肌肉注射mhANP和hBNP基因两周后对模型动物心重和心脏指数的影响分别见图21和22。4.2肌肉注射mhANP和hBNP基因对模型动物心率的影响对照组大鼠主动脉瓣受损2周后，心率有所加快，假手术组未见明显变化。大鼠主动脉瓣受损4周后，经肌肉注射mhANP和hBNP的表达型重组体pLHY24和pLT28的裸露DNA(5mg/kg体重)一次，多数动物心电图的缺血性变化都有所改善。缺血动物心率有所加快，个别动物出现心率失常，假手术组心率变化不明显(图23)。4.3肌肉注射mhANP和hBNP基因对动物心肌能量代谢的影响心力衰竭动物心肌内的能量物质如ATP、Pcr含量降低，而能量代谢废物LA的含量则明显增加。表明心力衰竭的心脏在前负荷增加、自身代偿的同时，能量代谢也发生了的变化。肌肉注射mhANP和hBNP的表达型重组体pLHY24和pLT28两周后，心脏的能量代谢状况获明显改善，能量储备增多，乳酸蓄积减少(图24、25和26)。4.4肌肉注射mhANP和hBNP基因对模型动物血压的影响已有大量文献报到，心钠素和脑钠素多肽均有排钠、利尿和降压等多方面的作用，但心力衰竭动物肌肉注射mhANP和hBNP基因后，其血压未见明显变化。心力衰竭动物治疗后的血压较术前略有降低，脉压差增加(图27)。图27中SAP示收缩压，DAP示舒张压。4.5肌肉注射mhANP和hBNP基因对模型动物体重的影响实验期间，动物体重正常增长，各组之间未见明显差异(图28)。4.6肌肉注射mhANP和hBNP基因对模型动物心电图的影响大鼠主动脉瓣受损2周后，心率有所加快，心电图可见缺血性变化。假手术组动物的心电图未见明显变化。在大鼠主动脉瓣受损4周后，经肌肉注射mhANP和hBNP基因表达型重组体，治疗组多数动物的心电图缺血性变化都有所改善。图29示出了给动物肌肉注射mhANP基因后治疗组和非治疗组(注射等量生理盐水)动物心电图的变化情况。实施例8 mhANP基因对SHR大鼠血压的抑制作用1.mhANP真核细胞表达型重组体pLHY24质粒DNA的制备1.1常规的碱裂解法大量制备质粒DNA1.2常规的PEG沉淀法纯化质粒DNA2.脂质体介导的基因转移采用脂质体介导的基因转移方法来将质粒pLHY24转染进逆转录病毒包装细胞系PA317细胞中。具体过程是消化、收集并计数细胞，以能铺满φ35mm的六孔板皿底30～35％的密度接种PA317细胞(约5×104/皿)，加2ml完全培养基，于37℃、5％CO2条件下培养24小时左右，具体时间以细胞密度不超过60～65％为宜以。在12×75mm灭菌管中制备溶液A2ug超螺旋质粒DNA+100ul最适培养液(OPTI-MEM I Reduced Serum Medium)，轻轻吹吸7～8次以充分混匀，溶液B将10ul Lipofectamine Regent试剂于100ul最适培养液中充分混匀，室温下静置15分钟，将溶液A和B轻轻混匀，室温下静置45分钟以形成DNA-脂质体复合物，再加入800ul最适培养液并混匀。在45分钟的期限到来之前用2ml生理盐水洗涤培养皿中的细胞1次，弃尽洗涤液，立即加入溶液A和B的混合物(1ml/孔)。37℃、5％CO2条件下培养3～5小时后，每孔添加1ml含30％小牛血清的D-MEM继续培养。转染进行24小时后换正常培养液。转染48～72小时后(具体时间视细胞密度而定，以其不超过95％为宜)，以能铺满培养瓶30～40％的密度传代，加正常培养基于37℃、5％CO2条件下培养。3.PA317细胞抗性克隆的筛选和扩增3.1G418初始筛选浓度的确定不同的细胞对G418的敏感性有区别，应预先确定适当的初始筛选浓度。将PA317细胞接种于六孔板中，待细胞长至50～60％，按一定的浓度梯度每孔加G418，3～4天换液一次，观测10天左右。选择培养3～4天后细胞开始死亡、6～7天后全部死亡的G418浓度作为初始筛选浓度。3.2转染细胞G418抗性克隆的筛选和扩增待上述转染细胞完全展开后，换加含初始筛选浓度G418的D-MEM进行筛选培养，同时设定不转染的对照组，3天换1次液。转染组约10～14天即可形成G418抗性细胞克隆。扩增抗性细胞克隆。4.G418抗性细胞基因组DNA的提取消化、收集培养的细胞，PBS洗2次，将细胞重悬于0.5ml TE中(5×10细胞/ml)，加5ml细胞裂解液(0.5％SDS；0.1mol/L EDTA，pH8.0；10mmol/L Tris-Cl，PH8.0；20ug/ml RNase)，转移至50ml锥形瓶中，轻轻混匀，37℃温育1小时。加蛋白酶K至终浓度为100ug/ml，用一玻棒温和将酶混入粘滞溶液中。将裂解细胞的悬液置50℃水浴3小时，并不时摇动该粘滞溶液。将溶液冷至室温，并移入离心管中，加等体积经0.5mol/L Tris-Cl(pH8.0)平衡的酚，缓慢来回颠倒离心管10分钟，室温5000rpm 15分钟，用大口径移液管或枪头移上清置另一离心管，再用酚重复抽提2次，用氯仿抽提1次。上清中加2倍体积95％乙醇，1/10体积3M NaAc沉淀，稍加转动即见丝状基因组DNA出现，用Tip头将丝状DNA移至1.5ml Eppendorf管中，用70％乙醇洗1次，晾干后溶于1ml TE(PH8.0)中，-20℃保存。5.复制缺陷型病毒颗粒的收集及其滴度测定待24孔板中的PA317细胞长到80-100％时，换不含G418的培养液，继续培养24小时，收集病毒上清，用0.45μml滤膜过滤除去细胞及杂质，取出一部分，用放免法(RIA)测定目的基因表达产物mhANP28的表达水平，另一部分于-70℃保存，用于病毒滴度测定和/或感染细胞。
采用快速法测定复制缺陷型病毒颗粒的滴度。将1×105NIH3T3细胞接种于6孔板中，置37℃、5％CO2条件下培养，24小时后，弃培养液，每孔加新鲜培养液1ml及病毒上清100ul，加polybrene至终浓度8ug/ml，继续培养24小时后，按1∶6的比例传代，视细胞的生长情况于24-48小时后用含G418的培养液进行筛选培养。10-14天后形成抗G418的细胞克隆。挑几个抗性细胞克隆进行扩增培养，分别冻存备用。6.SHR大鼠新生鼠皮肤成纤维细胞的原代培养将新生SHR乳鼠(出生后24小时内)整体浸泡于70％的乙醇中，5分钟后移入另一杯70％乙醇中，再浸泡5分钟。剪取背部皮肤，将剪下的皮肤组织块置70％乙醇中浸泡10分钟。尽可能去除脂肪组织，将皮片剪成0.5cm2左右大小，用含青霉素、链霉素各400u/ml和400μg/ml的生理盐水漂洗2次，5分钟/次。取出皮片并尽可能去除液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎。用弯头吸管将“泥状”组织点种于培养瓶壁，加少许D-MEM培养液(小牛血清15％，青、链霉素各100u和100μg/ml)，培养液的量以能将整个瓶壁湿润为限。将培养瓶倒置于37℃、5％CO2条件下10-30分钟，以便“泥状”组织能较牢固地贴附于瓶壁。轻缓地倒转培养瓶，以使点种的“泥状”组织与培养液接触。如果培养液的量不足，可用弯头滴管将培养液缓缓置于目标组织块的周围。置于37℃培养。一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次。由于第一次所加培养液极少，故第一次换液时不用弃旧液，即仅为加液。少量旧培养液继续留于培养瓶中，可避免加新培养液后细胞的生长环境变化太大。待不同组织块周围的细胞连接成片时传代弃旧培养液，生理盐水清洗长有细胞的瓶壁一次，加0.025％EDTA 0.5ml左右，转动培养瓶以便与细胞均匀接触，再加几滴0.25％的胰酶，混匀后再转动培养瓶以消化细胞，待1/2左右的细胞变园后，加适量培养液(15％小牛血清)终止消化，轻轻吹散细胞，视细胞多少而移于1～几个新培养瓶中继续培养。7.体外感染SHR新生鼠的皮肤成纤维细胞将SHR新生鼠的皮肤成纤维细胞以5×105接种于250ml培养瓶中，于37℃、5％CO2条件下培养，待铺满瓶底70％左右时加入目的基因表达水平和病毒滴度均较高的病毒悬液，同时加入polybrene至终浓度6ug/ml，继续培养24小时后，以1∶5传代于250ml培养瓶中，视细胞的生长情况于24至48小时后加入G418进行筛选培养。8.mhANP高表达细胞系的筛选用G418筛选出Neor阳性细胞克隆，用PCR法检测基因mhANP在Neor阳性细胞克隆中的整合情况，用RIA测定基因mhANP表达产物的分泌水平，选出并扩大培养mhANP高表达的遗传工程细胞。9.大鼠尾胶原的制备-20℃冻存的大鼠(300～500克)尾3根，70％乙醇中浸泡30分钟，抽取尾腱(如不易抽出，可先剪成小段)，尽可能剪碎，用0.02M冰醋酸400ml于4℃浸泡48小时，4℃5000rpm离心1.5小时，移上清于另一管中，4℃，15000rpm离心2小时，吸集上清，加0.1MNaOH(6∶1，V/V)中和冰醋酸后胶原蛋白即沉淀，室温2000rpm离心10分钟，弃上清，用等体积新配制的0.02M冰醋酸再溶解胶原蛋白沉淀，4℃保存备用。10.胶原移植物的制备首先将基因组中整合了外源基因mhANP并能高表达和分泌mhANP多肽的遗传工程细胞悬浮于培养液中(1.5×106细胞/ml)，然后按大鼠尾胶原(2mg/kg体重)∶5×D-MEM∶小牛血清∶细胞悬液＝3.0∶1.0∶0.5∶0.5的比例制备胶原移植物。11.表达分泌mhANP28的遗传工程细胞对SHR大鼠的移植实验让购回的4周龄(平均重66克)SHR适应新环境1周，然后进行编号、称量和随机分组等工作。用腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg体重)的方法麻醉动物，皮下注射胶原移植物。按5ml/只SHR的量分四点注入SHR背部两侧的皮下。移植前后每周均定期进行体重称量、血压测定、尿样收集(测定尿量、尿中电解质浓度)和眼眶取血(测定其中电解质和ANP浓度)。1 2.代谢笼法收集尿样按5ml生理盐水/100g体重的剂量灌胃，置代谢笼中(1只/笼)，禁食、禁水6小时并收集尿样。准确测定尿液体积，3000rpm离心5分钟，以去除颗粒性杂质，用于钾、钠等电解质浓度的测定。13.采集血样从眼眶取血，分成两份。一份不加抗凝剂，凝固后分离血清，用于血中钾、钠等电解质浓度的测定。另一份则预先加入20ul的EDTA和10ul抑肽酶，分离血浆，用于ANP浓度的测定。如不能及时测定，则低温冰冻保存。14.测量血压用鼠尾夹法测量血压。每只SHR每次精确测量三次，取其平均值。注动物的预热时间应大于15分钟，以使其尾部血管充分膨胀。15.治疗结果15.1mhANP基因转移对SHR大鼠血压的影响在植入了胶原移植物后，虽然所有治疗组动物的血压与对照组的一样，会随动物年龄的增大在逐渐升高，但是，在移植后的7周内始终低于对照组。与非治疗组相比，从移植后的第1周开始，治疗组动物血压的增长速率就明显降低，显效期为7周。治疗组与非治疗组动物之间血压差最大者出现于第2周，达34mmHg(124.04±22.41和158.83±5.94，p＜0.001)。结果见图30。15.2mhANP基因转移对SHR大鼠尿量的影响从治疗开始后的第二周起，治疗组动物的尿量就明显大于非治疗组，显效期可维持2周。与非治疗组相比，治疗组动物治疗后的尿液增长量可达前者的2.3(2.44/1.03)-3.2(2.44/0.83)倍。结果见图31。15.3对其它生理指标的影响经检测，在移植后的整个实验过程中，除上文所述血压和尿量外，mhANP基因经间接体内法导入体内并表达的结果对SHR大鼠血液和尿液中的钾、钠等电解质浓度没有明显影响，其血浆ANP水平也无明显变化。
序列表SEQ ID NO1(hANP的核苷酸序列)ATG AGC TCC TTC TCC ACC ACT CAA GCT AGC TTC CTC CTTTTA CTG GCA TTC CAG CTC CTA GGT CAG ACC AGA GCT AATCCC ATG TAC AAT GCC GTG TCC AAC GCA GAC CTG ATG GATTTC AAG AAT TTG CTG GAC CAT TTG GAA GAA AAG ATG CCTTTA GAA GAT GAG GTC GTG CCC CCA CAA GTG CTC AGT GAGCCG AAT GAA GAA GCG GGG GCT GCT CTC AGC CCC CTC CCTGAG GTG CCT CCC TGG ACC GGG GAA GTC AGC CCA GCCCAG AGA GAT GGA GGT GCC CTC GGG CGG GGC CCC TGGGAC TCC TCT GAT CGA TCT GCC CTC CTA AAA AGC AAG CTGAGG GCG CTG CTC ACT GCC CCT CGG AGC CTG CGG AGATCC AGC TGC TTC GGG GGC AGG ATG GAC AGG ATT GGAGCC CAG AGC GGA CTG GGC TGT AAC AGC TTC CGG TACTGASEQ ID NO2(hANP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中最后28个黑斜体字示hANP28的氨基酸序列)Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Gln Ala Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala PheGln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser AsnAla Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu LysMet Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu Pro AsnGlu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp ThrGly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly ProTrp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala LeuLeu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly ArgMet Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe ArgTyrSEQ ID NO3(mhANP的核苷酸序列)ATG AGC TCC TTC TCC ACC ACT CAA GCT AGC TTC CTC CTTTTA CTG GCA TTC CAG CTC CTA GGT CAG ACC AGA GCT AATCCC ATG TAC AAT GCC GTG TCC AAC GCA GAC CTG ATG GATTTC AAG AAT TTG CTG GAC CAT TTG GAA GAA AAG ATG CCTTTA GAA GAT GAG GTC GTG CCC CCA CAA GTG CTC AGT GAGCCG AAT GAA GAA GCG GGG GCT GCT CTC AGC CCC CTC CCTGAG GTG CCT CCC TGG ACC GGG GAA GTC AGC CCA GCCCAG AGA GAT GGA GGT GCC CTC GGG CGG GGC CCC TGGGAC TCC TCT GAT 0CGA TCT GCC CTC CTA AAA AGC AAG CTGAGG GCG CTG CTC ACT GCC CCT CGG AGC CTG CGG AGATCC AGC TGCTCCGGG GGC AGGATAGAC AGG ATT GGAGCC CAG AGC GGA CTG GGC TGT AAC AGC TTC CGG TACTGASEQ ID NO4(mhANP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中最后28个黑体三连字示mhANP28的氨基酸序列)Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Gln Ala Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala PheGln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser AsnAla Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu LysMet Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu Pro AsnGlu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp ThrGly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly ProTrp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala LeuLeu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser CysSerGly Gly ArgIleAsp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg TyrSEQ ID NO5(hBNP的核苷酸序列，其中大写字母示外显子，小写字母示内含子)ATGGATCCCCAGACAGCACCTTCCCGGGCGCTCCTGCTCCTGCTCTTCTTGCATCTGGCTTTCCTGGGAGGTCGTTCCCACCCGCTGGGCAGCCCCGGTTCAGCCTCGGACTTGGAAACGTCCGGGTTACAGgtgagagcggagggcagctcagggggattggacagcagcaatgaaagggtcctcacctgctgtcccaagaggccctcatctttcctttggaattagtgataaaggaatcagaaaatggagagactgggtgccctgaccctgtacccaaggcagtcggttcacttgggtgccatgaagggctggtgagccaggggtgggtccctgaggcttggacgcccccattcattgcagGAGCAGCGCAACCATTTGCAGGGCAAACTGTCGGAGCTGCAGGTGGAGCAGACATCCCTGGAGCCCCTCCAGGAGAGCCCCCGTCCCACAGGTGTCTGGAAGTCCCGGGAGGTAGCCACCGAGGGCATCCGTGGGCACCGCAAAATGGTCCTCTACACCCTGCGGGCACCACGAAGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCCTGGGCTGCAAAGgtaagcaccccctgccaccccggccgccttcccccattccagtgtgtgacactgttagagtcactttggggtttgttgtctctgggaaccacactctttgagaaaaggtcacctggacatcgcttcctcttgttaacagccttcagggccaaggggtgcctttgtggaattagtaaatgtgggcttatttcattaccatgcccacaataccttctccccacctcctacttcttatcaaaggggcagaatctcctttgggggtctgtttatcatttggcagccccccagtggtgcagaaagagaaccaaacatttcctcctggtttcctctaaactgtctatagtctcaaaggcagagagcaggatcaccagagcaatgataatccccaatttacagatgaggaaactgaggctcagagagttgcattaagcctcaaacgtctgatgactaacagggtggtgggtggcacacgatgaggtaagctcagcccctgcctccatctcccaccctaaccatcatcaccctctctctttccctgacagTGCTGAGGCGGCATTAASEQ ID NO6(hBNP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中的黑体字示hBNP32的氨基酸序列)Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe LeuHis Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro Gly SerAla Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu GlnGly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu GlnGlu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr GluGly lle Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro ArgSer Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met AspArg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Lau Arg Arg His
权利要求
1.编码强效突变型人心钠素的多核苷酸，其具有SEQ ID NO3的序列。
2.强效突变型人心钠素多肽，其具有SEQ ID NO4的氨基酸序列。
3.包含权利要求1的多核苷酸的表达型重组体。
4.包含野生型人心钠素基因的表达型重组体，其中野生型心钠素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
5.包含人脑钠素基因的表达型重组体，其中人脑钠素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
6.如权利要求3-5任一项所述的表达型重组体，其是基于逆转录病毒、腺病毒或腺病毒相关病毒的病毒载体或含有真核细胞表达元件的普通质粒载体的表达型重组体。
7.如权利要求6的表达型重组体，其为pLHY24，图谱见图5。
8.如权利要求6所述的表达型重组体，其为pYF1，图谱见图6。
9.如权利要求6所述的表达型重组体，其为pLHY19，图谱见图1。
10.如权利要求6所述的表达型重组体，其为pLT28，图谱见图9。
11.如权利要求6所述的表达型重组体，其为pYF2，图谱见图10。
12.包含权利要求3-11任一项的表达型重组体的治疗肾病综合征的基因治疗药物。
13.包含权利要求3-11任一项的表达型重组体的治疗慢性心功能不全的基因治疗药物。
14.包含权利要求3-11任一项的表达型重组体的治疗高血压的基因治疗药物。
15.包含权利要求3、7或8的编码强效突变型人心钠素的表达型重组体和权利要求5、10或11的编码人脑钠素的表达型重组体的复合治疗肾病综合征的基因治疗药物。
16.包含权利要求3、7或8的编码强效突变型人心钠素的表达型重组体和权利要求5、10或11的编码人脑钠素的表达型重组体的复合治疗慢性心功能不全的基因治疗药物。
17.包含权利要求3、7或8的编码强效突变型人心钠素的表达型重组体和权利要求5、10或11的编码人脑钠素的表达型重组体的复合治疗高血压的基因治疗药物。
18.包含权利要求4或9的编码野生型人心钠素的表达型重组体和权利要求5、10或11的编码人脑钠素的表达型重组体的复合治疗肾病综合征的基因治疗药物。
19.包含权利要求4或9的编码野生型人心钠素的表达型重组体和权利要求5、10或11的编码人脑钠素的表达型重组体的复合治疗慢性心功能不全的基因治疗药物。
20.包含权利要求4或9的编码野生型人心钠素的表达型重组体和权利要求5、10或11的编码人脑钠素的表达型重组体的复合治疗高血压的基因治疗药物。
全文摘要
本发明涉及强效突变型人心钠素基因，包含所述基因的表达型重组体及所述基因在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。由所述基因编码的强效突变型人心钠素多肽也是本发明的一个方面。另外，本发明还涉及所述强效突变型人心钠素基因、野生型人心钠素基因、人脑钠素基因单独或复合治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压的应用。
文档编号C07K14/435GK1390936SQ0111873
公开日2003年1月15日 申请日期2001年6月8日 优先权日2001年6月8日
发明者卢圣栋, 李涛, 梁红雁, 杜冠华, 阎峰 申请人:中国医学科学院基础医学研究所