专利名称：氨转运蛋白基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及氨转运蛋白(Ammonia transporter)基因及其用途，特别涉及氨同化作用良好的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料以及所述酒精饮料的制造方法等。更具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的氨转运蛋白Mep3的基因MEP3，特别涉及通过控制啤酒酵母的特征基因nonScMEP3或基因ScMEP3的表达量从而控制氨同化能力的酵母，以及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。
背景技术：
已知氨、氨基酸是酵母增殖所必需的氮源，在酿造过程中原料中含有的氨、氨基酸也作为酵母增殖的氮源而被同化。
一般认为氨基酸是酒精饮料的重要呈味成分，是影响产品质量的重要因素。因此，结合目标酒精饮料的质量对氨基酸的量进行控制对于新型酒精饮料的开发很重要。例如，通过增加酒精饮料的氨基酸含量能够使酒味香醇。
但是，如上所述，在发酵过程中氨基酸与氨被酵母作为氮源同化，因此，控制发酵结束时的氨基酸的含量极其困难。
酵母要将细胞外的氨基酸、氨作为氮源利用时必须将氨基酸、氨转运到菌体内，并且已证明酵母细胞膜内存在的氨转运蛋白、氨基酸转运蛋白参与这种氨基酸、氨的转运。
已知酵母的氨转运蛋白有底物亲和性不同的3种转运蛋白(Mep1，Mep2，Mep3)(Mol Cell Biol 174282-93，1997)，氨基酸转运蛋白有底物特异性低的Cap1、底物特异性不同的大量的其它氨基酸转运蛋白(精氨酸转运蛋白Can1、脯氨酸转运蛋白Put4等)(Curr Genet36317-28，1999)。
到目前为止，为了控制酒精饮料中氨基酸含量，已报导有使用其中参与氨基酸转运的基因(gap1，shr3，can1，put4，uga4)发生突变的酵母变种的例子(日本国特开2001-321159号公报)。
发明内容
在上述状况下，在酒精饮料制造过程中为了控制氨基酸的含量，期望有氨基酸的同化得到控制的酵母。但是，为了控制酒精饮料中残存的氨基酸量，必须控制氨基酸以外的其它氮源的同化。因此，期望有氨的同化得到控制，从而氨基酸的同化得到控制的酵母。
本发明人为了解决上述课题进行了积极研究，结果从啤酒酵母中成功鉴定、分离出编码氨转运蛋白的基因，并且已经制备出了用所得基因(用于表达)转化的酵母，同时确认了该酵母会促进氨同化，从而完成了本发明。
本发明涉及啤酒酵母中存在的氨转运蛋白基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达受到调控的转化酵母、使用该基因表达受到调控的酵母制造酒精饮料的方法等。具体来说，本发明提供下述所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入该载体的转化酵母、使用该转化酵母制造酒精饮料的方法等。
(1)多核苷酸，其选自由下述(a)～(f)组成的群组(a)多核苷酸，其含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2的氨基酸序列；(c)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(d)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(e)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下，与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质；以及(f)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下，与具有与编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其选自下述(g)～(i)组成的群组(g)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2的氨基酸序列或具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(h)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；以及(i)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号1的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸。
(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。
(6)蛋白质，其为由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
(7)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)所述的载体，其包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其连接在该启动子的正义方向或反义方向；以及(z)涉及RNA分子的转录终止和多聚腺苷化作用，并在酵母内起作用的信号。
(8)载体，其含有下述(j)～(l)中任一项多核苷酸，(j)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号4的氨基酸序列或具有在序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(k)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；以及
(l)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号3的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
(9)多核苷酸，其选自下述(m)～(q)组成的群组(m)多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；(n)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；(o)多核苷酸，其编码RNA，该RNA对上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割的活性；(p)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；以及，(q)多核苷酸，其编码具有与下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列的RNA；多核苷酸，其编码通过RNAi效应抑制下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA；多核苷酸，其编码对下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割活性的RNA；或多核苷酸，其编码通过共抑制效应抑制下述(q1)、(q2)、或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA；(q1)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号4的氨基酸序列或具有在序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；以及(q3)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号3的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
(10)载体，其含有上述(9)所述的多核苷酸。
(11)酵母，其为导入了上述(7)、(7a)、(8)或(10)所述的载体的酵母。
(12)如上述(11)所述的酵母，其中，通过导入上述(7)、(7a)或(8)所述的载体，氨同化能力增强。
(13)酵母，其为通过下述(A)、(B)或(C)方式使选自上述(5)所述的多核苷酸(DNA)和下述(q1)～(q3)的多核苷酸的表达受到抑制的酵母(A)通过导入上述(10)所述的载体；(B)通过破坏下述多核苷酸(DNA)的基因，即，上述(5)所述的多核苷酸(DNA)；(q1)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号4的氨基酸序列或具有在序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；或(q3)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号3的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质；或(C)通过使启动子突变或通过重组启动子。
(14)如上述(12)所述的酵母，其中，通过增加上述(6)所述的蛋白质的表达量，氨同化能力得到增强。
(15)酒精饮料的制造方法，其使用上述(11)～(14)中任一项所述的酵母。
(16)如上述(15)所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是麦芽饮料。
(17)如上述(15)所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是葡萄酒。
(18)酒精饮料，其为采用上述(15)～(17)中任一项所述的方法制造的酒精饮料。
(19)评价被检酵母的氨同化能力的方法，其包括使用根据具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的碱基序列设计的引物或探针。
(19a)利用上述(19)所述的方法，选择氨同化能力得到增强的酵母的方法。
(19b)利用上述(19a)所述的方法选择的酵母制造酒精饮料(如啤酒)的方法。
(20)评价被检酵母的氨同化能力的方法，其包括培养被检酵母；测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的表达量。
(20a)选择氨同化能力增强或降低的酵母的方法，其包括利用上述(20)所述的方法评价被检酵母，选择编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的表达量高或低的酵母。
(20b)利用上述(20a)所述方法选择的酵母制造酒精饮料(如啤酒)的方法。
(21)酵母的选择方法，其包括培养被检酵母；对上述(6)所述的蛋白质进行定量或测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的表达量；以及选择其中所述蛋白质的生成量或所述基因表达量与目标氨同化能力相应的被检酵母。
(21a)酵母的选择方法，其包括培养被检酵母；测定氨同化能力或氨转运蛋白活性；选择具有目标氨同化能力的被检酵母。
(22)如上述(21)所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和被检酵母；测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量；以及选择基因表达高于或低于标准酵母的被检酵母。
(23)如上述(21)所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和被检酵母；对各酵母中的上述(6)所述的蛋白质进行定量；以及选择蛋白质的量多于或低于标准酵母的被检酵母。
(24)酒精饮料的制造方法，其包括使用上述(11)～(14)任一所述的酵母或使用根据上述(21)～(23)所述的方法所选择的酵母中的任一种酵母，进行制造酒精饮料的发酵，以及调节氨及氨基酸的含量。
根据本发明的使用转化酵母的酒精饮料的制造方法，氨同化得到控制、氨基酸同化得到控制，所以能够控制酒中氨基酸含量，可以制造味道得到调节的酒精饮料。
图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示在660nm处的光密度值(OD660)。
图2表示啤酒酿造试验中浸出物(糖)消耗量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示表观浸出物浓度(W/W％)。
图3表示啤酒酿造试验中的酵母中nonScMEP3基因的表达行为，横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号强度。
图4表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示在660nm处的光密度值(OD660)。
图5表示啤酒酿造试验中浸出物(糖)消耗量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示表观浸出物浓度(W/W％)。
图6表示啤酒酿造试验中氨浓度的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示氨浓度(mg/L)。
图7表示啤酒酿造试验中游离氨基氮(FAN)浓度的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示游离氨基氮(FAN)的浓度(mg/100ml)。
图8表示啤酒酿造试验中的酵母中ScMEP3基因的表达行为，横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号强度。
图9表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示在660nm处的光密度值(OD660)。
图10表示啤酒酿造试验中浸出物(糖)消耗量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示表观浸出物浓度(W/W％)。
图11表示啤酒酿造试验中氨浓度的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示氨浓度(mg/L)。
图12表示啤酒酿造试验中游离氨基氮(FAN)浓度的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示游离氨基氮(FAN)的浓度(mg/100ml)。
具体实施例方式
本发明人认为，增大酵母的氨转运蛋白的活性，可以进一步高效同化氨。本发明人在这种构思基础上反复研究，根据日本国特开2004-283169公开的方法中解读的啤酒酵母基因组的信息，分离、鉴定出啤酒酵母特有的编码氨转运蛋白的non-ScMEP3基因。该基因的碱基序列用序列号1表示，此外由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列用序列号2表示。
进而，本发明人分离、鉴定出了ScMEP3基因，其碱基序列用序列号3表示，由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列用序列号4表示。
1.本发明的多核苷酸首先，本发明提供(a)多核苷酸，其含有具有序列号1或序列号3的碱基序列的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有编码具有序列号2或序列号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作为本发明对象的多核苷酸，并不限定于编码上述来源于啤酒酵母的氨转运蛋白的多核苷酸，而且还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为具有同等功能的蛋白质，其包括例如(c)蛋白质，其具有在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性。
此类蛋白质包括具有在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或1个氨基酸残基后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性的蛋白质。上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸残基的个数，一般优选小的数目。并且此类蛋白质还包括(d)蛋白质，其具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上的同一性的氨基酸序列、且具有氨转运蛋白活性。上述同源性的数值一般优选大的数值。
氨转运蛋白的活性，例如可根据Mol Cell Biol 174282-93，1997上记载的方法进行测定。
本发明还包括(e)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该含有的多核苷酸在严格条件下，与具有与序列号1或序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质；以及(f)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该含有的多核苷酸在严格条件下，与具有与编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
这里所述的“严格条件下进行杂交的多核苷酸”，是指将具有与序列号1或序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸的全部或一部分、或将编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、southern杂交法等得到的多核苷酸，例如DNA。杂交方法可以利用如Molecular Cloning 3rd Ed.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons 1987-1997等所述的方法。
本文所述的“严格条件”，可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，如为5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严格条件”，如为5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严格条件”，如为5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件中，认为温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸(例如DNA)。当然，一般认为影响杂交的严格度的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素，本领域技术人员可通过适当选择这些要素实现相似的严格度。
使用市售的试剂盒进行杂交时，如可以使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)。这种情况下，可按照试剂盒中附带的说明书，与标记探针过夜温育后，在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的首次洗涤缓冲液将膜洗涤后，由此检测被杂交的多核苷酸(如DNA)。
除此之外，可被杂交的多核苷酸还包括，，与编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸，上述同一性是通过例如FASTA、BLAST等同源性搜索软件，利用默认参数所计算得。
氨基酸序列、碱基序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873，1993)来确定。以BLAST算法为基础的称为BLASTN、BLASTX的程序也已开发出来(Altschul SF，etalJ Mol Biol 215403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统设定默认参数值。
本发明的多核苷酸还包括下述多核苷酸，即，(m)多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；(n)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；(o)多核苷酸，其编码RNA，该RNA对上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割的活性；(p)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；以及(q)多核苷酸，其编码具有与下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列的RNA；多核苷酸，其编码通过RNAi效应抑制下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA；多核苷酸，其编码对下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割活性的RNA；或多核苷酸，其编码通过共抑制效应抑制下述(q1)、(q2)、或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA，其中，(q1)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号4的氨基酸序列或具有在序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；以及(q3)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号3的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。将这些多核苷酸整合到载体内，进而在导入该载体的转化细胞内能够抑制上述(a)～(l)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，这些多核苷酸能够期望在抑制上述多核苷酸(DNA)表达时优选使用。
本文中所述的“编码具有与DNA的转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷酸”，指的是反义DNA。反义技术是公知的抑制特定内源基因表达的方法，在各种文献中都有记载(如参照平岛及井上新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会编，东京化学同人)pp.319-347，1993等)(平島および井上新生化学実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発現(日本生化学会编，東京化学同人)pp.319-347，1993)。反义DNA的序列，优选为与内源基因的全部或其中的一部分互补的序列，但只要能够有效抑制基因表达，不完全互补也可以。被转录的RNA，优选其与靶基因的转录产物有90％或以上的互补性，更优选有95％或以上的互补性。反义DNA的长度至少为15个碱基以上，优选为100个碱基以上，更优选为500个碱基以上。
本文中所述的“编码通过RNAi效应抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，指的是通过RNA interference(RNAi)来抑制内源基因表达的多核苷酸。“RNAi”是指将具有与靶基因序列相同或类似的序列的双链RNA导入细胞内，导入的外源基因及内源靶基因的表达均被抑制的现象。这里使用的RNA，例如可以为21～25碱基长的产生RNA干扰的双链RNA，如dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(short hairpin RNA)。此类RNA可以通过脂质体等输送系统局部输送到所需的部位，并且使用可生成上述双链RNA的载体使其局部表达。这种双链RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制备方法、使用方法等，在多种文献中是公知的(参照日本国特表2002-516062号公报；US2002/086356A；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000April；Nature，4076802，319-20，2002Sep.21；Genes&Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，999，6047-6052，2002Apr.30；NatureBiotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002May；Nucleic Acids Res.，3010，e46，2002May15等)。
本文中所述的“编码对DNA转录产物具有特异切割活性的RNA的多核苷酸”，一般是指核酶(Ribozyme)。核酶是指具有催化活性的RNA分子，其通过切割靶DNA的转录产物来阻断其基因功能。关于核酶的设计可以参照各种公知文献(如参照FEBS Lett.228228，1988；FEBS Lett.239285，1988；Nucl.Acids.Res.177059，1989；Nature323349，1986；Nucl.Acids.Res.196751，1991；Protein Eng3733，1990；Nucl.Acids Res.193875，1991；Nucl.Acids Res.195125，1991；Biochem Biophys Res Commun1861271，1992等)。此外，“编码通过共抑制效应抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是指通过“共抑制”来阻断靶DNA功能的核苷酸。
本文中所述的“共抑制”，是指通过转化作用在细胞中导入具有与内源靶基因相同或类似序列的基因，导入的外源基因和内源靶基因的表达均被抑制的现象。具有共抑制效应的多核苷酸的设计也可以参照各种公知文献(例如参照Smyth DRCurr.Biol.7R793，1997；Martienssen RCurr.Biol.6810，1996等)。
2.本发明的蛋白质本发明还提供由上述(a)～(e)中任一种多核苷酸所编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质包括具有在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
此类蛋白质包括具有在序列号2或序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性的蛋白质。此外，此类蛋白质还包括具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
此类蛋白质可通过使用《Molecular Cloning3》、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，106487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，796409(1982)”、“Gene，34315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，134431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)”等记载的定点诱变法获得。
本发明所述的在蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或以上的氨基酸残基，是指在同一序列中的任意1个或多个氨基酸序列中的位置上缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸残基，并且缺失、取代、插入及添加中的2种以上可同时发生。
下面列举可互相取代的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相取代，所述组如下所示。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造，并且也可以利用Advanced ChemTech公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instal lment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、Shimazu公司等制造的肽合成仪进行化学合成。
3.本发明的载体及导入该载体的转化酵母本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(q)中所述的任一多核苷酸(DNA)。并且，构成的本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒包括的组成要素为(x)在酵母细胞内可转录的启动子，(y)上述(a)～(q)任一项所述的多核苷酸(DNA)，其与该启动子以正义方向或反义方向连接，以及(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用，并在酵母内起作用的信号。在本发明中，在下述酒精饮料(例如啤酒)的酿造过程中，要使上述本发明的蛋白质进行高表达时，将上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以正义方向导入至该启动子，以促进这些多核苷酸(DNA)的表达。此外，在下述酒精饮料(例如啤酒)的酿造过程中，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，将上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以反义方向导入至该启动子，以抑制这些多核苷酸(DNA)的表达。此外，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，也可将上述(m)～(q)中任一项所述的多核苷酸导入其能够表达的载体内。此外，在本发明中，通过破坏作为靶基因的上述基因(DNA)，可以抑制上述多核苷酸(DNA)的表达或上述蛋白质的表达。基因破坏可通过下述方式进行，即，通过在与靶基因的基因产物表达相关的区域如编码区或启动子区添加或缺失一个或多个碱基，或使上述区域整体缺失来进行。上述基因破坏的方法可参照公知文献(例如参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods in Enzymology，101，202(1983)、日本国特开平6-253826号公报等)。
此外，在本发明中，通过使启动子突变或通过同源重组对启动子进行基因重组，能够控制靶基因的表达量。这种突变的导入方法在Nucleic Acids Res.29，4238-4250(2001)上有记载，此外，通过改变启动子来控制基因表达的方法如在Appl Environ Microbiol.，72，5266-5273(2006)上有记载。
导入酵母时使用的载体可以是多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如作为YEp型载体，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)；作为YCp型载体，已知有YCp50(M.D.Rose et al.，Gene，60237，1987)；作为YIp型载体，已知有YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，761035，1979)，且容易获得。
用于调节酵母中的基因表达的启动子/终止子，只要在酿造用酵母中起作用的同时不受发酵液中的成分影响，可以任意组合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因均已克隆，如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细记载，通过已知的方法能够容易地获得。
因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，因而转化时使用的选择性标记可利用如氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)或浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(Junji Inokoshi et al.，Biochemistry，64，660，1992；Hussainet al.，gene，101，149，1991)。
上述构建的载体被导入宿主酵母内。作为宿主酵母可以为可在酿造中使用的任何酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等酿造用酵母等，具体可以为如酵母属(Saccharomyces)等酵母。在本发明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母W34/70(Saccharomyces pastorianus W34/70)等、Saccharomycescarlsbergensis NCYC453或NCYC456等、或Saccharomyces cerevisiaeNBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且还可使用威士忌酵母如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等，葡萄酒酵母如日本协会的葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等，清酒酵母如日本协会的酵母清酒用7号、清酒用9号等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。
酵母的转化方法可利用一般使用的公知方法，如电穿孔法“Meth.Enzym.，194182(1990)”、原生质球法(Spheroplast)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology，153163(1983)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeast genetics”和2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual”等中所述的方法，但并不限于这些方法。
更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基(GeneticEngineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)等)中培养至OD600nm值为1～6。将该培养酵母离心分离并收集，洗净，用浓度约为1M～2M的碱性金属离子，优选锂离子进行预处理。上述细胞在约30℃下，静置约60分钟后，与要导入的DNA(约1μg～20μg)同时在约30℃下，再静置约60分钟。添加聚乙二醇，优选添加约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。约30℃下静置约30分钟后，将上述细胞在约42℃下加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基将上述细胞悬浮液洗净，加入到规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，在约30℃下静置约60分钟。然后，将其接种于含有作为选择性标记使用的抗生素或其类似物的标准琼脂培养基上，获得转化体。
一般的克隆技术可参照《Molecular Cloning》第三版、“Methods in YeastGenet ics，A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本发明的酒精饮料制造方法以及根据该方法得到的酒精饮料将上述本发明的载体导入适于酿造目标酒精饮料的酵母中，通过使用该酵母，能够制造氨含量得到控制、氨基酸含量得到控制的酒精饮料。此外，同样也可以使用根据下述本发明的酵母的评价方法选择出的酵母。目标酒精饮料可以为啤酒、发泡酒(happoushu)等啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于这些。此外在本发明中，如果需要的话，通过使用靶基因的表达受到抑制的酿造用酵母，也能够制造所期望的氨含量升高的酒精饮料。即，使用导入上述本发明载体的酵母、上述本发明多核苷酸(DNA)的表达受到抑制的酵母或根据下述本发明的酵母评价方法选择的酵母，进行制造酒精饮料的发酵，通过调节(增加或减少)氨的生成量，能够制造所期望的氨含量得到调节(增加或减少)的酒精饮料。
制造上述酒精饮料时，除使用本发明得到的酿造酵母代替亲株之外，可利用公知的方法。由于原料、制造设备、制造管理控制等可与以往的方法完全相同，所以不会增加酒精饮料的制造成本。即，根据本发明，能够使用已有的设备进行制造而不增加成本。
5.本发明的酵母的评价方法本发明涉及评价方法，该评价方法使用根据具有序列号1或3的碱基序列的氨转运蛋白基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的氨同化能力。上述评价方法的一般方法是公知的，例如在WO01/040514号公报、日本国特开平8-205900号公报等中有记载。下面，对该评价方法进行简单说明。
首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可采用Hereford法或乙酸钾法等任何一种公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，130(1990))。使用根据氨转运蛋白基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异序列。可采用公知的方法设计引物或探针。
基因或特异序列的检测可采用公知的方法实施。例如，用含有特异序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有与其碱基序列互补的碱基序列的一部分或全部多核苷酸作为一个引物，而用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有与其碱基序列互补的碱基序列的一部分或全部多核苷酸作为另一个引物，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增产物的有无、扩增产物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选15bp～25bp。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300bp～2000bp为宜。
PCR法的反应条件无特别限定，如可采用变性温度90℃～95℃，退火温度40℃～60℃，延伸温度60℃～75℃，循环数10次以上等条件。得到的反应生成物可通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，测定扩增产物的分子量。通过该方法，根据扩增产物的分子量包含特定DNA分子的大小，预测、评价该酵母的氨同化能力。并且，通过分析扩增产物的碱基序列，可以更准确地预测、评价上述能力。
在本发明中，也可通过培养被检酵母，测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的表达量，评价被检酵母的氨同化能力。此外，编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的表达量的测定，可通过培养被检酵母，对编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的转录产物mRNA或蛋白质进行定量来进行。mRNA或蛋白质的定量可采用公知的方法进行。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons 1994-2003)。此外，通过测定培养被检酵母时得到的发酵液中的氨浓度，也可预测该被检酵母中上述基因的表达量。
培养被检酵母，通过测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的表达量，选择基因表达量与目标氨转运蛋白活性相应的酵母，借此能够选择出适于酿造所期望酒精饮料的酵母。此外，也可以通过培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中上述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母中上述基因的表达量，从而选择所期望的酵母。具体来说，例如培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量，通过选择与标准酵母相比该基因为高表达或低表达的被检酵母，能够选择出适于酿造所期望酒精饮料的酵母。
培养被检酵母，通过选择氨转运蛋白活性高或低的酵母，能够选择出适于酿造所期望酒精饮料的被检酵母。
所述情况下，作为被检酵母或标准酵母，可以使用如导入上述本发明载体的酵母、本发明的多核苷酸(DNA)的表达受到控制的酵母、实施突变处理的酵母或发生自然突变的酵母等。氨转运蛋白活性可以根据如Mol Cell Biol174282-93，1997所述方法进行测定。对于突变处理，例如可以使用紫外线照射、放射线照射等物理方法，以及如EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等任何方法(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)(大嶋泰治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一)。
能够作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可以为可在酿造中使用的任意酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等酿造用酵母等。具体可以为酵母属(Saccharomyces)等酵母(例如Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae及Saccharomyces carlsbergensis)，在本发明中可以使用啤酒酵母，如Saccharomyces pastorianus W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等、Saccharomycescerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且也可以使用葡萄酒酵母如日本协会的葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等，清酒酵母如日本协会酵母清酒用7号、清酒用9号等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母也可以从上述酵母中任意组合选择。
实施例以下根据实施例对本发明详细描述，但本发明不限于以下实施例。
实施例1氨转运蛋白(nonScMEP3)的克隆使用日本国特开2004-283169所述的比较数据库进行检索，结果发现啤酒酵母中特有的氨转运蛋白基因nonScMEP3(序列号1)。根据获得的碱基序列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物nonScMEP3_F(序列号5)/nonScMEP3_R(序列号6)，通过以基因组解读株Saccharomyces pastorianusWeihenstepan34/70株(简称“W34/70株”)的染色体DNA为模板的PCR，取得包括nonScMEP3的全长基因的DNA片段。
将上述得到的nonScMEP3基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，2141215，1981)分析并确定nonScMEP3基因的碱基序列。
实施例2啤酒酿造中nonScMEP3基因表达分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行试酿造，从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列进行分析。
麦芽汁浸出物浓度12.69％麦芽汁体积 70L麦芽汁中溶解氧浓度 8.6ppm发酵温度15℃酵母添加量 12.8×106cells/mL对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样，制备的mRNA用生物素进行标记，使其与日本国特开2004-283169所述的啤酒酵母DNA微阵列进行杂交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检测，nonScMEP3基因的表达模式如图3所示。根据该结果确认在通常的啤酒发酵中nonScMEP3基因进行表达。
实施例3nonScMEP3高表达株的构建将实施例1所述的nonScMEP3/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶解，制备包括蛋白质编码区全长的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理的pYCGPYNot上，由此构建nonScMEP3高表达载体nonScMEP3/DYCGPYNot。pYCGPYNot为YCp型酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行高表达。酵母的选择性标记包括氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418r，大肠菌的选择性标记包括氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用上述方法制作的高表达载体，采用日本国特开平07-303475所述的方法，对Saccharomyces pasteurianus Weihenstepan34/70株进行转化。采用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。
实施例4啤酒酿造试验中氨及氨基酸同化量的测定使用亲株及实施例3得到的nonScMEP3高表达株的发酵试验在下述条件下进行。
麦芽汁浸出物浓度12％麦芽汁体积 1L麦芽汁中溶解氧浓度 约8ppm发酵温度15℃恒定酵母添加量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁对发酵液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图4)、浸出物消耗量(图5)、氨浓度(图6)、游离氨基氮(FAN)浓度(图7)的经时变化。如图6所示，与亲株相比，nonScMEP3高表达株的氨同化得到促进，而游离氨基氮(FAN)的同化受到抑制(如图7所示)。其结果如表1所示，对于nonScMEP3高表达株，发酵结束后啤酒中的总氨基酸量增加，氨量减少。
实施例5氨转运蛋白(ScMEP3)的克隆使用日本国特开2004-283169所述的比较数据库进行检索，结果发现啤酒酵母中特有的氨转运蛋白基因ScMEP3(序列号3)。根据获得的碱基序列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物ScMEP3_F(序列号7)/ScMEP3_R(序列号8)，通过以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstepan34/70的染色体DNA为模板的PCR，获得包括ScMEP3的全长基因的DNA片段。
将上述方法得到的ScMEP3基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，2141215，1981)分析并确定ScMEP3基因的碱基序列。
实施例6啤酒酿造中ScMEP3基因表达分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行试酿造，从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列进行分析。
麦芽汁浸出物浓度12.69％麦芽汁体积 70L麦芽汁中溶解氧浓度 8.6ppm发酵温度15℃酵母添加量 12.8×106cells/mL对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样，制备的mRNA用生物素进行标记，使其与日本国特开2004-283169所述的啤酒酵母DNA微阵列进行杂交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检测，ScMEP3基因的表达模式如图8所示。根据该结果确认在通常的啤酒发酵中ScMEP3基因进行表达。
实施例7ScMEP3高表达株的构建将实施例1所述的ScMEP3/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶解，制备包括蛋白质编码区全长的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理的pYCGPYNot上，从而构建出ScMEP3高表达载体ScMEP3/pYCGPYNot。pYCGPYNot为YCp型酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行高表达。酵母的选择性标记包括氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418r，大肠菌的选择性标记包括氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用上述方法制作的高表达载体，采用日本国特开平07-303475所述的方法，对Saccharomyces pastorianus Weihenstepan 34/70株进行转化。采用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。
实施例8啤酒酿造试验中氨及氨基酸同化量的测定使用亲株及实施例7得到的ScMEP3高表达株的发酵试验在下述条件下进行。
麦芽汁浸出物浓度12％麦芽汁体积 1L麦芽汁中溶解氧浓度 约8ppm发酵温度15℃(恒定)酵母添加量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁对发酵液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图9)、浸出物消耗量(图10)、氨浓度(图11)、游离氨基氮(FAN)(图12)的经时变化。如图11所示，与亲株相比，ScMEP3高表达株的氨同化得到促进，游离氨基氮(FAN)的同化受到抑制(如图12所示)。其结果如表2所示，对于ScMEP3高表达株，发酵结束后啤酒中的总氨基酸量增加，氨量减少。
实施例9nonScMEP3基因或ScMEP3基因的破坏按照文献(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，通过以含有药物抗性标记的质粒(pFA6a(G418r)，pAG25(nat1)，pAG32(hph))为模板的PCR，制备用于破坏基因的片段。
使用上述方法制备的用于破坏基因的片段，对W34/70株或孢子克隆株W34/70-2进行转化，采用日本国特开平07-303475所述的转化方法，选择性试剂的浓度分别为氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L、Nourseothricin50mg/L。
实施例10啤酒酿造试验中氨及氨基酸同化量的测定使用亲株及实施例9得到的nonScMEP3破坏株或ScMEP3破坏株的发酵试验在下述条件下进行。
麦芽汁浸出物浓度12％麦芽汁体积 1L麦芽汁中溶解氧浓度 约7ppm发酵温度12℃(恒定)酵母添加量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁与实施例8相同，对发酵液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量、氨浓度、游离氨基氮(FAN)浓度的经时变化。
根据本发明的酒精饮料制造方法，可增大酵母的氨同化能力，所以可以制造氨基酸的同化受到抑制、氨基酸含量多的酒精饮料。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式会社(Suntory Limited)<120氨转运蛋白基因及其用途(Ammonia transporter gene and use thereof)<130>G06-0089CN<150>JP2006-049100<151>2006-02-24<160>8<170>PatentIn version3.3<210>1<211>1470<212>DNA<213>酵母属(Saccharomyces sp.)<400>1atggctcgtc aagacggaca tttatggaca gaaacatatg atagttccac ggttgctttc 60atgattttag gggcagccct ggtcttcttc atggtgccag ggttaggttt tctttattcc120ggtttggcaa gaagaaaatc cgccctggct ttgatttggg tggtgatgat ggctaccttg180gtgggtatat tacaatggta tttttggggc tactcactag cgttctccaa gactgcacca240aataataaat ttatcgggaa tttggattct ttcgggttta gaaacgttta tggtaaaatc300tcagatgact ctacatatcc agaattgatt tatgcagttt tccagatgat gttcatgtgt360gtggcattga gtattatagc cggtgccact gcggaaagag gtaagctttt cccacatatg420gttttcctct ttgtttttgc cactttggtt tattgcccta tcacttattg ggtttgggct480cccggtgggt gggccttcca atggggggtt ttagattggg ctggtggtgg aaatattgag540attttgagcg ccgtggccgg tttcatttat tcctatttct taggaagaag aaaagaaaat600ctcttaatca attttagacc acataacgtc tccatggtta ctttgggtac ttgtgttctc660tggttcggtt ggttgctttt caatgcagca agctcattgt cgccaaatat gagatctgtc720tatgcctttt tcaacacaaa tattagcgcg accacaggtg gaatgacatg gtgtctatta780gattatcgtt cagaaaaaaa atggtctact gtcggactgt gttcaggtat tatttgcggt840ttggttgcgg ccactccaag ctccggctgt atcactctct atggctcctt aattcaaggt900atagtggccg gcgttgtctg taatttcgcc acgaaaataa agtattatct gaaagtagac960gattccctgg atttactggc agagcatggt attgccggta tagtgggtct gattttcaat 1020gcgctatttg cggctgattg ggttattggg atggacggta ccaccgagca tagaggtggc 1080tggttaactc ataactggaa acaaatgtac atccaaatcg catacatcgc tgctgtggcc 1140ggatattgta ctgttgttac agcgtttatc tgctttgtgt taggtaaaat ccctggtatg 1200
aacctaagag tcacggagga agctgaagct ttgggtttgg acgaagatca aatcggcgag 1260ttcgcttacg attacgtgga agttagaagg gattactatc aatggggcgt ggacactgat 1320gccctccata ccacttgtaa tggcggaaaa gctgcgcctg agacaaattc tactgaagac 1380agccaaaact cttcactatc ttcagccacc gtaagtggcc aaaatgaaaa aactaaccat 1440cttaaaccac agcactcaaa agaagcatag1470<210>2<211>489<212>PRT<213>酵母属(Saccharomyces sp.)<400>2Met Ala Arg Gln Asp Gly His Leu Trp Thr Glu Thr Tyr Asp Ser Ser1 5 10 15Thr Val Ala Phe Met Ile Leu Gly Ala Ala Leu Val Phe Phe Met Val20 25 30Pro Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Arg Lys Ser Ala35 40 45Leu Ala Leu Ile Trp Val Val Met Met Ala Thr Leu Val Gly Ile Leu50 55 60Gln Trp Tyr Phe Trp Gly Tyr Ser Leu Ala Phe Ser Lys Thr Ala Pro65 70 75 80Asn Asn Lys Phe Ile Gly Asn Leu Asp Ser Phe Gly Phe Arg Asn Val85 90 95Tyr Gly Lys Ile Ser Asp Asp Ser Thr Tyr Pro Glu Leu Ile Tyr Ala100 105 110Val Phe Gln Met Met Phe Met Cys Val Ala Leu Ser Ile Ile Ala Gly115 120 125Ala Thr Ala Glu Arg Gly Lys Leu Phe Pro His Met Val Phe Leu Phe130 135 140Val Phe Ala Thr Leu Val Tyr Cys Pro Ile Thr Tyr Trp Val Trp Ala145 150 155 160Pro Gly Gly Trp Ala Phe Gln Trp Gly Val Leu Asp Trp Ala Gly Gly165 170 175Gly Asn Ile Glu Ile Leu Ser Ala Val Ala Gly Phe Ile Tyr Ser Tyr180 185 190Phe Leu Gly Arg Arg Lys Glu Asn Leu Leu Ile Asn Phe Arg Pro His195 200 205Asn Val Ser Met Val Thr Leu Gly Thr Cys Val Leu Trp Phe Gly Trp210 215 220Leu Leu Phe Asn Ala Ala Ser Ser Leu Ser Pro Asn Met Arg Ser Val225 230 235 240Tyr Ala Phe Phe Asn Thr Asn Ile Ser Ala Thr Thr Gly Gly Met Thr245 250 255
Trp Cys Leu Leu Asp Tyr Arg Ser Glu Lys Lys Trp Ser Thr Val Gly260 265 270Leu Cys Ser Gly Ile Ile Cys Gly Leu Val Ala Ala Thr Pro Ser Ser275 280 285Gly Cys Ile Thr Leu Tyr Gly Ser Leu Ile Gln Gly Ile Val Ala Gly290 295 300Val Val Cys Asn Phe Ala Thr Lys Ile Lys Tyr Tyr Leu Lys Val Asp305 310 315 320Asp Ser Leu Asp Leu Leu Ala Glu His Gly Ile Ala Gly Ile Val Gly325 330 335Leu Ile Phe Asn Ala Leu Phe Ala Ala Asp Trp Val Ile Gly Met Asp340 345 350Gly Thr Thr Glu His Arg Gly Gly Trp Leu Thr His Asn Trp Lys Gln355 360 365Met Tyr Ile Gln Ile Ala Tyr Ile Ala Ala Val Ala Gly Tyr Cys Thr370 375 380Val Val Thr Ala Phe Ile Cys Phe Val Leu Gly Lys Ile Pro Gly Met385 390 395 400Asn Leu Arg Val Thr Glu Glu Ala Glu Ala Leu Gly Leu Asp Glu Asp405 410 415Gln Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Arg Asp Tyr420 425 430Tyr Gln Trp Gly Val Asp Thr Asp Ala Leu His Thr Thr Cys Asn Gly435 440 445Gly Lys Ala Ala Pro Glu Thr Asn Ser Thr Glu Asp Ser Gln Asn Ser450 455 460Ser Leu Ser Ser Ala Thr Val Ser Gly Gln Asn Glu Lys Thr Asn His465 470 475 480Leu Lys Pro Gln His Ser Lys Glu Ala485<210>3<211>1470<212>DNA<213>酵母属(Saccharomyces sp.)<400>3atggctcggg gtgacggaca tctatggaca gagacatatg atagttccac agtcgttttt 60atgattttag gtgccgccct ggttttcttc atggtaccgg ggctgggctt tctttattcc120ggtttagcaa gaagaaaatc tgctctggct ttgatttggg tagtgataat ggctacctta180gtaggtatac tgcaatggta tttttggggc tattctttag cattctctaa gactgcgacg240aacaacaaat ttatcggcaa cttggattca tttgggttta gaaacgtcta tggcaaaatt300tcggatgatt ccacgtatcc tgaactgatt tatgccattt tccaaatgat gttcatgtgt360gtcgcattga gtattatagc tggtgccact gcggaaagag gtaagctttt tccacatatg420gtttttcttt ttgtttttgc gactttggtt tactgtccca tcacttattg gatttgggcc480
ccaggtggtt gggcctacca atggggggta ttagactggg ctggcggtgg gaatgttgaa540atcctaagtg ctgtggctgg tttcgtttat tcttattttc taggaagaag aaaagaaaac600ctcctgatca actttagacc acataatgtt tccatggtga ctttgggtac ttctatactt660tggtttggtt ggttgctttt caatgctgca agctcactgt caccaaatat gaggtccgta720tatgcgttca tgaacacttg tctcagcgcc accacgggtg gaatgacgtg gtgtttatta780gattatcgat ctgaaaaaaa atggtccact gttgggttat gctccggcat tatctgtggt840ttagttgctg ccacgcctag ctcgggttgt attactctat atggctcttt gatccaaggt900ataatagcgg gtgttgtttg taattttgca acaaaaataa agtattattt aaaagtggat960gattccttag atctattagc tgaacacggt atcgccggtg tggtgggatt gatttttaac 1020gctctatttg cagctgattg ggttattgga atggacggca caacaaagca taagggtggt 1080tggttgacgc ataactggaa acaaatgtat attcaaattg cctatatcgg tgcctctgcc 1140ggctattgtg ctgtggtcac ggccatcatt tgcttcgtat taggtaaaat tccgggtgtc 1200catctaagag tcactgagga agccgaagca ttggggttgg atgaagatca aataggcgaa 1260ttcgcttacg attacgtgga ggttaggaga gattattacc agtggggtgt agatacagat 1320gcacttcata ctacatgcaa tggcgctaat tctgcgtctg agacaaatcc tactgaggac 1380agccaaaact cctcattgtc atcagctaca gtaagcagcc aaaacgaaaa aagtaataat 1440cctaaattgc atcacgcaaa agaagcatga1470<210>4<211>489<212>PRT<213>酵母属(Saccharomyces sp.)<400>4Met Ala Arg Gly Asp Gly His Leu Trp Thr Glu Thr Tyr Asp Ser Ser1 5 10 15Thr Val Val Phe Met Ile Leu Gly Ala Ala Leu Val Phe Phe Met Val20 25 30Pro Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Arg Lys Ser Ala35 40 45Leu Ala Leu Ile Trp Val Val Ile Met Ala Thr Leu Val Gly Ile Leu50 55 60Gln Trp Tyr Phe Trp Gly Tyr Ser Leu Ala Phe Ser Lys Thr Ala Thr65 70 75 80Asn Asn Lys Phe Ile Gly Asn Leu Asp Ser Phe Gly Phe Arg Asn Val85 90 95Tyr Gly Lys Ile Ser Asp Asp Ser Thr Tyr Pro Glu Leu Ile Tyr Ala100 105 110Ile Phe Gln Met Met Phe Met Cys Val Ala Leu Ser Ile Ile Ala Gly115 120 125Ala Thr Ala Glu Arg Gly Lys Leu Phe Pro His Met Val Phe Leu Phe130 135 140Val Phe Ala Thr Leu Val Tyr Cys Pro Ile Thr Tyr Trp Ile Trp Ala145 150 155 160
Pro Gly Gly Trp Ala Tyr Gln Trp Gly Val Leu Asp Trp Ala Gly Gly165 170 175Gly Asn Val Glu Ile Leu Ser Ala Val Ala Gly Phe Val Tyr Ser Tyr180 185 190Phe Leu Gly Arg Arg Lys Glu Asn Leu Leu Ile Asn Phe Arg Pro His195 200 205Asn Val Ser Met Val Thr Leu Gly Thr Ser Ile Leu Trp Phe Gly Trp210 215 220Leu Leu Phe Asn Ala Ala Ser Ser Leu Ser Pro Asn Met Arg Ser Val225 230 235 240Tyr Ala Phe Met Asn Thr Cys Leu Ser Ala Thr Thr Gly Gly Met Thr245 250 255Trp Cys Leu Leu Asp Tyr Arg Ser Glu Lys Lys Trp Ser Thr Val Gly260 265 270Leu Cys Ser Gly Ile Ile Cys Gly Leu Val Ala Ala Thr Pro Ser Ser275 280 285Gly Cys Ile Thr Leu Tyr Gly Ser Leu Ile Gln Gly Ile Ile Ala Gly290 295 300Val Val Cys Asn Phe Ala Thr Lys Ile Lys Tyr Tyr Leu Lys Val Asp305 310 315 320Asp Ser Leu Asp Leu Leu Ala Glu His Gly Ile Ala Gly Val Val Gly325 330 335Leu Ile Phe Asn Ala Leu Phe Ala Ala Asp Trp Val Ile Gly Met Asp340 345 350Gly Thr Thr Lys His Lys Gly Gly Trp Leu Thr His Asn Trp Lys Gln355 360 365Met Tyr Ile Gln Ile Ala Tyr Ile Gly Ala Ser Ala Gly Tyr Cys Ala370 375 380Val Val Thr Ala Ile Ile Cys Phe Val Leu Gly Lys Ile Pro Gly Val385 390 395 400His Leu Arg Val Thr Glu Glu Ala Glu Ala Leu Gly Leu Asp Glu Asp405 410 415Gln Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Arg Asp Tyr420 425 430Tyr Gln Trp Gly Val Asp Thr Asp Ala Leu His Thr Thr Cys Asn Gly435 440 445Ala Asn Ser Ala Ser Glu Thr Asn Pro Thr Glu Asp Ser Gln Asn Ser450 455 460Ser Leu Ser Ser Ala Thr Val Ser Ser Gln Asn Glu Lys Ser Asn Asn465 470 475 480Pro Lys Leu His His Ala Lys Glu Ala485<210>5<211>40
<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>5gagctcatag cggccatggc tcgtcaagac ggacatttat 40<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>6ggatcctatg cggccgcgaa atgctgaata taaagtataa aa 42<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>7gagctcatag cggccatggc tcggggtgac ggacatctat 40<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>8ggatcctatg cggccgcaat ataaaattaa aaagttcaga aa 4权利要求
1.多核苷酸，其选自下述(a)～(f)组成的群组(a)多核苷酸，其含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2的氨基酸序列；(c)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(d)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(e)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下，与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质；以及(f)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下，与具有与编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其选自下述(g)～(i)组成的群组(g)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2的氨基酸序列或具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(h)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；以及(i)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号1的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其含有编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。
5.如权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。
6.蛋白质，其为由权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
7.载体，其含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。
8.载体，其含有下述(j)～(l)中任一项所述的多核苷酸，(j)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号4的氨基酸序列或具有在序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(k)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；以及(l)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号3的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
9.多核苷酸，其选自下述(m)～(q)组成的群组(m)多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；(n)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表达；(o)多核苷酸，其编码RNA，该RNA对权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割活性；(p)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表达；以及，(q)多核苷酸，其编码具有与下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列的RNA；多核苷酸，其编码通过RNAi效应抑制下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA；多核苷酸，其编码对下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割活性的RNA；或多核苷酸，其编码通过共抑制效应抑制下述(q1)、(q2)、或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA；(q1)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号4的氨基酸序列或具有在序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；以及(q3)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号3的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质。
10.载体，其含有权利要求9所述的多核苷酸。
11.酵母，其为导入了权利要求7、8或10所述的载体的酵母。
12.如权利要求11所述的酵母，其中，通过导入权利要求7或8所述的载体，氨同化能力增强。
13.酵母，其为通过下述(A)、(B)或(C)方式使选自上述(5)所述的多核苷酸(DNA)和下述(q1)～(q3)的多核苷酸的表达受到抑制的酵母(A)通过导入权利要求10所述的载体；(B)通过破坏下述多核苷酸(DNA)的基因，即，权利要求5所述的多核苷酸(DNA)；(q1)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号4的氨基酸序列或具有在序列号4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨转运蛋白活性；或(q3)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号3的碱基序列的多核苷酸进行杂交或与具有与序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质；或(C)通过使启动子突变或通过重组启动子。
14.如权利要求12所述的酵母，其中，通过增加权利要求6所述的蛋白质的表达量，氨同化能力得到增强。
15.酒精饮料的制造方法，其使用权利要求11～14中任一项所述的酵母。
16.如权利要求15所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是麦芽饮料。
17.如权利要求15所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是葡萄酒。
18.酒精饮料，其为采用权利要求15～17任一项所述的方法制造的酒精饮料。
19.评价被检酵母的氨同化能力的方法，其包括使用根据具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的碱基序列设计的引物或探针。
20.评价被检酵母的氨同化能力的方法，其包括培养被检酵母；测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的表达量。
21.酵母的选择方法，其包括培养被检酵母；对权利要求6所述的蛋白质进行定量或测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因的表达量；以及选择其中所述蛋白质的生成量或所述基因的表达量与目标氨同化能力相应的被检酵母。
22.如权利要求21所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和被检酵母；测定具有序列号1或序列号3的碱基序列、且编码具有氨转运蛋白活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量；以及选择基因表达高于或低于标准酵母的被检酵母。
23.如权利要求21所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和被检酵母；对各酵母中的权利要求6所述的蛋白质进行定量；以及选择蛋白质的量多于或少于标准酵母的被检酵母。
24.酒精饮料的制造方法，其包括使用权利要求11～14所述的任一酵母和根据权利要求21～23所述的方法选择的酵母中的任一种酵母，进行用于制造酒精饮料的发酵，以及调节氨及氨基酸的含量。
全文摘要
本发明涉及氨转运蛋白基因及其用途，特别涉及氨同化能力强的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料、其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的氨转运蛋白Mep3的基因MEP3，特别涉及通过控制啤酒酵母的特征基因nonScMEP3、或基因ScMEP3的表达量从而控制氨同化能力的酵母、使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。
文档编号C07K14/37GK101024835SQ20061016883
公开日2007年8月29日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年2月24日
发明者中尾嘉宏, 儿玉由纪子, 下永朋子 申请人:三得利株式会社