专利名称：针对奶牛y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用的制作方法
针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用 本发明涉及一种通过分离奶牛的X、 Y精子进行奶牛性别控制的方法，特别涉及一种通 过针对奶牛Y精子特异性单克隆抗体的制备，分离奶牛X、 Y精子，从而实现奶牛性别控制 的方法。
背景技术：
奶牛为单胎动物，与其他畜种相比，繁殖力低，而在自然条件下，奶牛产雌雄比例接近 1-1。饲养奶牛主要的目的是产奶，所以每一位饲养者都希望母牛产雌性牛犊，以增加经济 效益。通过性别控制技术提高母牛比例，可以提高良种奶牛的繁殖效率，从而增加良种奶牛 数量，提高奶牛生产水平。可以说，实现奶牛性别控制是奶牛养殖者多年的愿望。使奶牛多 生母犊，可快速增加良种奶牛数量的同时，也提高了牛群的质量，促进我国奶牛业向质量型 的方向发展。此外，我国目前90%左右的奶牛集中在农户和集体养殖场饲养，通过奶牛性别 控制实现多生雌性牛犊，可明显提高其经济效益。
性别控制技术已有数千年的研究历史，相继诞生了许多方法，目前，常见的牛性别控制 方法有早期胚胎性别鉴定法和流式细胞仪X、 Y精子分离法两种。
早期胚胎性别鉴定法是在胚胎移植时，对移植前胚胎进行性别鉴定，人为地选择某一性 别的胚胎移植给受体，如经典的核型分析，现代的聚合酶链反应法(PCR)、 DNA探针法等， 但这些方法只能应用于胚胎移植，且移植胚胎成活率低，还会造成胚胎浪费，从成本角度考 虑，此法不适合规模化养殖。
流式细胞仪精子分离法是根据X、 Y精子在DNA含量上的差异来分离精子，这种性别 控制方法准确率较高，但存在分离速度慢、技术成本过高、有些分离步骤会对精子产生损害 等缺点，不适宜大规模推广使用。
免疫法分离精子是根据在精子的整个进化过程中保留着H-Y抗原，并且，只有Y精子才 能表达H-Y抗原，因而，利用精子质膜上存在的H-Y抗原与H-Y特异性单克隆抗体结合， 通过免疫分离方法分离X精子和Y精子。
公开专利200610023640.X基于H-Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法，该专利 公开的免疫磁珠筛选奶牛X精子方法是利用基因重组方法表达蛋白，将融合蛋白免疫圈养鸡， 获得多克隆抗H-Y抗原的鸡IgY抗体并用纳米级磁珠标记。
本发明用奶牛精原细胞免疫筛选，制备出针对Y精子特异性强的配对单克隆抗体，采用 直接输入法、免疫磁珠技术、离心法、免疫亲和层析柱法将奶牛X、 Y精子分离，从而实现奶 牛性别控制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了针对奶牛Y精子特异性强、效价高的配 对单克隆抗体的制备方法，并通过免疫分离手段进行精子分离。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的
针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，采用奶牛精原细胞直接免疫
Balb/c小鼠诱导出抗体，通过配对筛选，获得针对H—Y抗原的不同决定簇的效价高、特异 性强的配对单抗I、 II ，经检测两株抗体对X精子均无结合力，基于免疫学原理，抗体I、 抗体II分别与Y精子特异性结合后，形成抗原-抗体复合物，再采用一定免疫精子分离法将奶 牛X、 Y精子分离。
采用高剂量60ug/ml的睾丸组织匀浆免疫小鼠，获得针对Y精子表面H-Y抗原不同决定 簇的两种单克隆抗体I、 II。
免疫精子分离法可以是直接输入法、免疫磁珠技术、离心法、免疫亲和层析柱法。 直接输入法是将抗体I、抗体II以一定比例混入奶牛鲜精中，输精时直接将此混合精液 输入母牛体内，由于Y精子与抗体形成抗体I-Y-抗体II复合物，Y精子活动受限，增加X精
子受孕几率。
免疫磁珠技术是将抗体I 、抗体II分别与磁性粒子相连，形成免疫磁珠I 、免疫磁珠II ， 以l: 1比例加入奶牛鲜精中充分摇匀反应，磁珠标记的抗体I、抗体II可共同与H—Y抗原 连接，给予外加磁场，未被吸附的精子即为X精子，从而得以分离。
离心法是将抗体I、抗体II分别与磁性粒子相连，形成免疫磁珠I、免疫磁珠II，以l: 1比例在奶牛鲜精中充分摇匀反应，磁珠标记的抗体I、抗体II可共同与H—Y抗原连接，经 过离心，Y精子随沉降物被固定，X精子存在上清液中，从而得以分离。
免疫亲和层析柱法是将抗H-Y抗体I或抗体II与特殊分子混合制成固相吸附剂放置在层 析柱中，当奶牛新鲜精子通过层析柱时，与吸附剂具有亲和力的Y精子就会被吸附而滞留在 层析柱中，与吸附剂无亲和力的X精子由于不被吸附，直接流出，从而将奶牛X、 Y精子分 离。
由于采用上述技术方案，本发明提供的用奶牛精原细胞免疫筛选出配对的针对奶牛Y精 子特异性单克隆抗体可通过多种方式分离奶牛精子，具有高效、安全、成本低廉的优点，适 合大规模用于奶牛雌性优种繁育且具有较高经济效益。具体实施例
通过以下具体实施方式
对本发明进一步说明。 实施例一
抗h—y抗原的配对单克隆抗体的制备
1) 采用高剂量60ug/ml的睾丸组织匀桨免疫小鼠，用SP20细胞融合建立瘤株进行筛选，取 瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。
2) 提取小鼠腹水纯化筛选，获得能同时与H—Y抗原结合的两种单克隆抗体I、 II。 实施例二
将过量的抗体I、抗体II混入奶牛鲜精中，输精时直接将此混合精液输入母牛体内，由 于Y精子与抗体形成抗体I-Y-抗体II复合物，Y精子活动受限，增加X精子受孕几率。 实施例三
免疫磁珠技术是将抗体I 、抗体II分别与磁性粒子相连，形成免疫磁珠I 、免疫磁珠II，
以l: 1比例加入奶牛鲜精中充分摇匀反应，磁珠标记的抗体I、抗体II可共同与H—Y抗原
连接，给予外加磁场，未被吸附的精子即为x精子，从而得以分离。 实施例四
离心法是将抗体I、抗体II分别与磁性粒子相连，形成免疫磁珠I、免疫磁珠II，以l: 1比例在奶牛鲜精中充分摇匀反应，磁珠标记的抗体I、抗体II可共同与H—Y抗原连接，经 过离心，Y精子随沉降物被固定，X精子存在上清液中，从而得以分离。 实施例五
免疫亲和层析柱法是将抗h-y抗体i或抗体n与特殊分子混合制成固相吸附剂放置在层
析柱中，将奶牛新鲜精子通过层析柱，与吸附剂具有亲和力的y精子就会被吸附而滞留在层 析柱中，与吸附剂无亲和力的x精子由于不被吸附，直接流出，从而将奶牛x、 y精子分离。
权利要求
1.针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，其特征在于是采用奶牛精原细胞直接免疫Balb/c小鼠诱导出抗体，通过配对筛选，获得针对H-Y抗原的不同决定簇的效价高、特异性强的配对单抗I、II，经检测两株抗体对X精子均无结合力，基于免疫学原理，抗体I、抗体II分别与Y精子特异性结合后，形成抗原-抗体复合物，再采用一定免疫精子分离法将奶牛X、Y精子分离。
2. 根据权利要求1所述的针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，其特征 在于采用高剂量60ug/ml的睾丸组织匀浆免疫小鼠，获得针对Y精子表面H-Y抗原不同决 定簇的两种单克隆抗体I、 II 。
3. 根据权利要求1所述的针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，其特征 在于所述的免疫精子分离法可以是直接输入法、免疫磁珠技术、离心法、免疫亲和层析柱 法。
4. 根据权利要求1或3所述的针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，其 特征在于直接输入法是将抗体I 、抗体II以一定比例混入奶牛鲜精中，输精时直接将此混 合精液输入母牛体内，由于Y精子与抗体形成抗体I-Y-抗体II复合物，Y精子活动受限， 增加X精子受孕几率。 .
5. 根据权利要求1或3所述的针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，其 特征在于免疫磁珠技术是将抗体I 、抗体II分别与磁性粒子相连，形成免疫磁珠I 、免疫 磁珠II，以l: 1比例加入奶牛鲜精中充分摇匀反应，磁珠标记的抗体I、抗体II可共同 与H—Y抗原连接，给予外加磁场，未被吸附的精子即为X精子，从而得以分离。
6. 根据权利要求1或3所述的针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，其 特征在于离心法是将抗体I 、抗体II分别与磁性粒子相连，形成免疫磁珠I 、免疫磁珠II ， 以1: 1比例在奶牛鲜精中充分摇匀反应，磁珠标记的抗体I 、抗体II可共同与H—Y抗原 连接，经过离心，Y精子随沉降物被固定，X精子存在上清液中，从而得以分离。
7. 根据权利要求1或3所述的针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，其 特征在于免疫亲和层析柱法是将抗H-Y抗体I或抗体II与特殊分子混合制成固相吸附剂 放置在层析柱中，当奶牛新鲜精子通过层析柱时，与吸附剂具有亲和力的Y精子就会被 吸附而滞留在层析柱中，与吸附剂无亲和力的X精子由于不被吸附，直接流出，从而将 奶牛X、 Y精子分离。
全文摘要
针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体的制备及其应用，采用奶牛精原细胞直接免疫Balb/c小鼠，融合后建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于小鼠腹腔使其产生腹水，提取小鼠腹水纯化筛选，获得针对奶牛Y精子特异的配对单克隆抗体，该配对单抗分别针对H-Y抗原的不同抗原决定簇。获得的配对单抗效价高、特异性强，经检测对X精子无结合力，基于免疫学原理，抗H-Y抗体可与Y精子特异性结合，形成抗原-抗体复合物，可直接再采用直接输入法、免疫磁珠技术、离心法、免疫亲和层析柱法将奶牛X、Y精子分离，从而实现奶牛性别控制。本发明具有高效、安全、成本低廉的优点，适合大规模优种雌性繁育且具有较高经济效益。
文档编号C07K16/18GK101591394SQ20081011336
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者万积成 申请人:万积成