专利名称：：抗人颗粒酶m的单克隆抗体和杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及抗人颗粒酶M的单克隆抗体M0428，它是由小鼠杂交瘤细胞株M0428产生的。
背景技术：
：颗粒酶(Gzm)调节的靶细胞杀伤是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的主要效应途径。在人当中存在5种颗粒酶，分别是颗粒酶A、B、K、H和M。尽管颗粒酶A和B诱导的细胞死亡途径已经基本阐明，然而其它孤儿颗粒酶(K、H和M)在CTL调节的靶细胞杀伤中的作用远未阐明。人GzmM基因位于染色体19pl3.3，约1.6kb，包含5个外显子和4个内含子。GzmM与一组嗜中性弹性蛋白酶共定位于19号染色体上，与AZU1-PRTN3-ELA2基因簇相隔320kb(Birdetal.,2005，详见后附参考文献列表)。人GzmM为含有232个氨基酸残基的蛋白酶，非糖基化分子量预计为27kDa。预测GzmM有3N糖基化位点，分别为46NGSH、177NNSR、183NGSL，糖基化后的分子量约为32kDa。人与大鼠的Met-ase66%氨基酸同源，其三联催化位点、8个Cys残基和一些形成底物结合口袋的氨基酸都是保守的(Smythetal.，1993)，而GzmM与其他Gzm氨基酸同源性不到40%(Sattaretal.，2003)。GzmM的6个Cys与其他颗粒酶一样形成3对二硫键，另外2个则没有形成二硫键。尽管GzmB、GzmA和GzmM的晶体结构己经解析(Hink-Schauereta.，2003)，GzmM的结构尚未见报道。与其他四种Gzm不同，人GzmM在活化的CTL细胞中没有表达。与GzmA和PFP—样，它组成型高表达于自然杀伤细胞(NK)和外周大淋巴细胞(LGL)，在CD3+CD56+T细胞和Y5T细胞中有少量表达，而GzmB在新分离的NK中几乎检测不到(Hink-Schaueretal.,2002)。GzmM独特的酶活性、基因定位及特定的表达谱提示它有不同的杀伤作用，可能在先天免疫中发挥重要作用。KHYG，一种强细胞毒性的NK细胞系，可能通PFP/GzmM途径引起肿瘤细胞凋亡(Sucketal.,2005)。到目前为止，GzmM介导细胞凋亡的机理尚不清楚。Symth等对GzmM在细胞凋亡中的作用进行了初步研究(Kellyetal.，1996)，发现在穿孔素的协助下，GzmM很快破坏细胞膜的完整性并引起DNA的破坏，此过程早于GzmB介导的细胞死亡。电镜观察发现GzmM能够引起染色体浓縮，细胞核萎縮变小，内质网肿胀，胞质电子密度增加并有大液泡出现。GzmM切ICAD释放CAD的活性，并切割DNA修复酶PARP加速了核的破坏。GzmM引起的细胞凋亡激活了caspase3，产生17kDa的酶活形式(Luetal.，2006)。最近的研究发现，GzmM能够有效的水解GzmM的抑制剂P19(proteaseinhibitor9)。而某些肿瘤细胞通过高表达PI9抑制GzmB的活性，从而逃避CTL对其杀伤作用(Mahrusetal.,2004)。这提示，GzmM能够抑制PI9,使得CTL细胞通过GzmB途径杀伤肿瘤细胞。参与细胞毒性抑制作用的丝氨酸蛋白酶抑制齐USPI-CI(serineproteaseinhibitorinvolvedincytotoxicityinhibition)能够不可逆的与纯化的GzmM结合，并且能保护细胞免受穿孔素/GzmM介导的细胞死亡。颗粒酶M单抗的潜在用途包括1.检测组织和细胞或其裂解液中颗粒酶M的含量，可用于肿瘤和自身免疫性疾病的临床监测；2.偶联靶向分子，可用于导向药物的开发。例如，可以将待导向的药物与颗粒酶M单抗缀合，而颗粒酶M单抗能够特异识别颗粒酶M，从而将药物导向颗粒酶M相关的细胞(如表达颗粒酶M的细胞)，从而发挥作用。然而，到目前为止，由于GzmM的研究较新，其晶体结构尚未解析，致使一直未有获得人颗粒酶M的单抗的报道。
发明内容本发明的目的是提供抗人颗粒酶M的单克隆抗体，更具体地一种抗人颗粒酶M的单克隆抗体M0428。本发明提供了一种抗人颗粒酶M的单克隆抗体M0428，其特征在于，它是由小鼠杂交瘤细胞株M0428产生的。以重组人颗粒酶M免疫Balb/C小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备的一株能稳定分泌特异性抗人颗粒酶单克隆抗体的细胞株M0428。M0428单抗与重组人颗粒酶M及表达人天然颗粒酶M的细胞呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶M的细胞无交叉反应。本发明提供抗人颗粒酶M的单克隆抗体。更具体地，本发明提供以下各项1)一种抗人颗粒酶M的单克隆抗体M0428，它由小鼠杂交瘤细胞株M0428(CGMCCNo.2580)产生。2)—种产生抗人颗粒酶M单克隆抗体M0428的杂交瘤细胞，其特征在于，它是保藏号为CGMCCNo.2580的小鼠杂交瘤细胞株M0428。3)以上1)所述的单克隆抗体M0428在制备免疫抑制剂中的应用。所述免疫抑制剂可以含有其它辅剂或佐剂，其制备是本领域技术人员所公知的技术。4)以上l)所述的单克隆抗体M0428在制备导向药物中的应用。5)用于检测颗粒酶M的含量的试剂盒，其包含以上1)所述的单克隆抗体M0428。试剂盒的制备可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。6)根据以上5)的试剂盒，其中所述颗粒酶M的含量可用于肿瘤或自身免疫性疾病的临床监测。7)根据以上5)或6)的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测NK细胞、PBMC或外周大淋巴细胞的颗粒酶M的含量。8)—种检测细胞的颗粒酶M的含量的方法，该方法包括(1)将以上1)所述的单克隆抗体M0428与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。在一个实施方案中，所述分离的细胞是从人体分离的。细胞裂解液的制备可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。9)根据以上8)的方法，其中所述阳性反应是通过免疫荧光检测进行判断的。免疫荧光检测可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。图1表示M0428单抗，按常规方法对重组人颗粒酶M(泳道1)、NK92细胞裂解液(泳道2)、PBMC裂解液(泳道3)、K562细胞裂解液(泳道4)进行Westernblot。具体实施例方式CTL细胞和NK细胞在抗病毒及细胞内细菌感染、器官移植排斥和抗肿瘤应答中具有重要意义。Gzm是丝氨酸蛋白酶家族的成员，存在于活化的CTL和NK细胞中，是其发挥细胞毒作用的主要效应分子。NK和CTL细胞通过直接释放细胞毒性颗粒杀伤耙细胞的机理已成为近年来分子免疫学及肿瘤生物学研究的热点。大量的实验小组GzmA和GzmB进行了广泛而深入的研究，但是GzmA基因敲除小鼠、GzmB基因敲除小鼠以及GzmA和GzmB基因双敲除的小鼠尽管存在某些免疫缺陷，这三类小鼠的CTL仍然能够裂解耙细胞。这提示我们其它孤儿Gzm在CTL及NK细胞的杀伤过程中也发挥重要作用。GzmM引起一种不同于GzmA及GzmB的新的细胞死亡；GzmM诱导的细胞死亡不依赖caspase的活化及线粒体的破坏；PI染色DNA含量GzmM不引起DNA片段化(Kellyetal.，1996)。Caspae广谱抑制剂Z-VAD(100pm)等的研究显示高浓度的Z-VAD(200nm)也不能抑制GzmM诱导的细胞死亡；GzmM诱导的细胞死亡不激活caspase，也不引起磷脂酰丝氨酸跨膜外翻。Caspse是多种GzmB的作用下裂解为两个亚单位并形成有活性的异四聚体形式(Adrainetal.,2005)。尽管多种caspase均为GzmB的底物，在GzmB/PFP处理的细胞中，caspase3和7很快被切割(Yangetal.，1998)。尽管我们用的转导试剂Gzm与GzmM的浓度不同，但GzmM(l|im)/PJ与GzmM(83nM)/PFP诱导了相似的细胞凋亡率。本发明包括一种特异性的抗人颗粒酶M单克隆抗体M0428，它是由小鼠杂交瘤细胞株M0428产生的。以重组人颗粒酶M免疫Balb/C小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备的一株能稳定分泌特异性抗人颗粒酶单克隆抗体的细胞株M0428。本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人颗粒酶M单克隆抗体杂交瘤细胞株M0428，该杂交瘤细胞株于2008年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2580。本发明中的抗人颗粒酶M单克隆抗体M0428的实验表明，M0428单抗与重组人颗粒酶M及表达人天然颗粒酶M的细胞呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶M的细胞无交叉反应。本发明中的抗人颗粒酶M单克隆抗体M0428具有以下的特点和性能(1)与重组人颗粒酶M呈强阳性反应；(2)与人NK肿瘤细胞系NK92呈强阳性反应；(3)与人外周血单核细胞PBMC呈强阳性反应；(4)与人白血病细胞K562呈阴性反应。实施例lM0428单抗的制备和纯化(1)杂交瘤的制备以重组人颗粒酶M(制备参见LuH.，HouQ,,Zhao,T.，Zhang,H.,ZhangQ.,WuL.,Fan,Z.GranzymeMdirectlycleavesICADtounleashcaspase-activatedDNaseleadingtoDNAfragmentation.77zeo//附m丽ofogy.2006,177:1171-1178)免疫Balb/C小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹腔注射，每只小鼠每次50微克重组人颗粒酶M。2周后对小鼠进行再次免疫，注射量和方法不变。待小鼠血清效价达到要求，即效价达到1:200以上，之后准备进行细胞融合，融合前三天对小鼠进行冲击免疫。在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(ATCCCRL-1772)。将以上获得的致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合(《实用免疫学》，杨廷彬主编，长春出版社，1994年12月出版)，用HAT培养基(购于Irwitrogen公司，HAT系次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基)进行选择性培养(以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞)。接着，用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清以重组人颗粒酶M包被96孔板，4。C过夜。用含0.05%tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加待检上清lOOpl，37t:孵育lh。用含0.05%tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加酶标二抗(抗小鼠IgG-HRP)(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37'C孵育lh。洗涤3次，加底物显色剂四甲基联苯胺(TMB)(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)50^，室温静置5分钟，加终止液(2mol/L的硫酸)5(^1。结果用BIORAD680型酶标仪测定，检测波长为450nm值，OD值高于阴性对照2倍以上者可视为阳性。然后，将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养(有限稀释法，以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞)。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存保种。本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人颗粒酶M单克隆抗体杂交瘤细胞株M0428，该杂交瘤细胞株于2008年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2580。(2)M0428单抗的制备和纯化将上述杂交瘤细胞M0428接种至Balb/C小鼠腹腔，制备腹水，再从腹水中提取单抗。单抗M0428的纯化采用ProteinG亲和层析法。首先制备ProteinG亲和层析柱(购于"GE"公司)，用PBS(磷酸盐缓冲液)平衡柱子后，取含M0428单抗的腹水过柱，然后用PBS洗柱子，至OD值接近于零，以0.2M的甘氨酸-HC1溶液(pH2.8)洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，洗脱液经透析浓縮后-2(TC冻存。实施例2M0428单抗的鉴定将在实施例1中制备和纯化的M0428单抗，按常规方法对重组人颗粒酶M、人NK肿瘤细胞系NK92细胞(ATCC:CRL-2407)的裂解液、人外周血单核细胞PBMC(制备参考《实用免疫学》，杨廷彬主编，长春出版社，1994年12月出版)的裂解液、人白血病细胞K562细胞(ATCC:CCL-243)的裂解液进行westernblotting,结果如图1所示。结果表明，M0428单抗与重组人颗粒酶M及表达人天然颗粒酶M的细胞(NK92和PBMC)呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶的细胞(K562)无交叉反应。在实施例1中制备的M0428单抗，按常规方法对NK92细胞(ATCC:CRL-2407)、PBMC(制备参考《实用免疫学》，杨廷彬主编，长春出版社，1994年12月出版)、和K562细胞(ATCC:CCL-243)进行免疫荧光反应。结果表明，M0428单抗与表达人天然颗粒酶M的细胞(NK92和PBMC)呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶的细胞(K562)无交叉反应。用M0428单抗按常规方法对NK92、PBMC和K562细胞进行免疫荧光检测。结果如表l所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>—"表示无反应，"+"表示有反应。尽管本发明的具体实施例已经描述如上，但是可以知道本发明可以进行除了上述说明以外的实践。本发明的保护范围不受说明书的限制。参考文献BirdCH,SunJ,UngK，KarambalisD,WhisstockJC,TrapaniJA,BirdPI.CationicsitesongranzymeBcontributetocytotoxicitybypromotingitsuptakeintotargetcells.MolCellBiol.2005Sep;25(17):7854-67.SmythMJ,SayersTJ,WiltroutT，PowersJC,TrapaniJA.Met-ase:cloninganddistinctchromosomallocationofaserineproteasepreferentiallyexpressedinhumannaturalkillercells.JImmunol.1993Decl;151(ll):6195-205SattarR,AliSA,AbbasiA.Bioinformaticsofgranzymes:sequencecomparisonandstructuralstudiesongranzymefamilybyhomologymodeling.BiochemBiophysResCommun.2003Sep5;308(4):726-35.Hink-SchauerC,Est6banez-PerpiME,KurschusFC，BodeW,JenneDE.Crystalstructureoftheapoptosis-inducinghumangranzymeAdimer.NatStructBiol.2003M;10(7):535-40.Hink-SchauerC,Est6banez-Perp跑E,WilharmE,Fuentes-PriorP,KlinkertW,BodeW,JenneDE.The2.2-Acrystalstructureofhumanpro-granzymeKrevealsarigidzymogenwithunusualfeatures.JBiolChem.2002Dec27;277(52):50923陽33.Epub2002Oct15.SuckG,BranchDR,SmythMJ,MillerRG,VergidisJ,FahimS,KeatingA.KHYG-1,amodelforthestudyofenhancednaturalkillercellcytotoxicity.ExpHematol.2005Oct;33(10):1160-71KellyJM,O'ConnorMD,HulettMD,ThiaKY,SmythMJ.CloningandexpressionoftherecombinantmousenaturalkillercellgranzymeMet-ase-1.Immu加genetics.19%;44(5):340-50.Lu，H.,Hou,Q.,Zhao,T,,Zhang,H.,Zhang,Q.,Wu,L.,andFan,Z.'GranzymeMdirectlycleavesinhibitorofcaspase-activatedDNase(CAD)tounleashCADleadingtoDNAfragmentation.JImmunol2006.177，1171-1178.MahrusS,KisielW,CraikCS.GranzymeMisaregulatoryproteasethatinactivatesproteinaseinhibitor9,anendogenousinhibitorofgranzymeB.JBiolChem.2004Dec24;279(52):54275-82.Epub2004Oct19.KellyJM,O'ConnorMD,HulettMD,ThiaKY,SmythMJ.CloningandexpressionoftherecombinantmousenaturalkillercellgranzymeMet-ase-1.Immunogenetics.1996;44(5):340-50.AdrainC,MurphyBM,MartinSJ.MolecularorderingofthecaspaseactivationcascadeinitiatedbythecytotoxicTlymphocyte/naturalkiller(CTL/NK)proteasegranzymeB.JBiolChem.2005Feb11;280(6):4663-73,Epub2004Nov29.Yang,A.,Kaghad,M.,Wang,Y"Gillett,E.,Fleming,M.D"Dotsch,V"Andrews,N.C.，Caput,D.,andMcKeon,F.p63,ap53homologat3q27-29,encodesmultipleproductswithtransactivating,death-inducing,anddominant-negativeactivities.Molecularcell1998.2,305-316.权利要求1.抗人颗粒酶M的单克隆抗体。2.权利要求1所述的单克隆抗体，其为M0428，它由小鼠杂交瘤细胞株M0428(CGMCCNo.2580)产生。3.—种产生抗人颗粒酶M单克隆抗体M0428的杂交瘤细胞，其特征在于，它是保藏号为CGMCCNo.2580的小鼠杂交瘤细胞株M0428。4.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备免疫抑制剂中的应用。5.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备导向药物中的应用。6.用于检测颗粒酶M的含量的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述颗粒酶M的含量可用于肿瘤或自身免疫性疾病的临床监测。8.根据权利要求6或7的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测NK细胞、PBMC或外周大淋巴细胞的颗粒酶M的含量。9.一种检测细胞的颗粒酶M的含量的方法，该方法包括(1)将权利要求1或2所述的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。10.根据权利要求9的方法，其中所述阳性反应是通过免疫荧光检测进行判断的。全文摘要本发明提供了一种产生抗人颗粒酶M单克隆抗体的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体，特别是M0428，该单克隆抗体与重组人颗粒酶M及表达人天然颗粒酶M的细胞呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶M的细胞无交叉反应。本发明还提供了包含单克隆抗体M0428的试剂盒和使用单克隆抗体M0428检测颗粒酶M的含量的方法。文档编号C07K16/40GK101633696SQ20081011707公开日2010年1月27日申请日期2008年7月23日优先权日2008年7月23日发明者强侯,刘圣武,吴连锋,唐海东,张红莲,翀李,丽王,王德朋,范祖森申请人:中国科学院生物物理研究所