专利名称：非病毒载体及其制备方法与应用的制作方法
非病毒载体及其制备方法与应用技术领域
本发明属于高分子化学和生物医学工程领域，涉及一种非病毒载体及其制备方法 与应用。
背景技术：
肿瘤是基因病，肿瘤发生的遗传背景是癌基因或抑癌基因的异常，基因治疗是对 肿瘤细胞或正常细胞转移一个或几个正常基因，它的表达产物有利于直接或间接的杀伤肿 瘤细胞；或保护正常细胞免受化疗与放疗的严重伤害，但是传统的基因导入系统存在的问 题在于(1)缺乏靶向性，而且具有较高的细胞毒性和免疫原性，如以携带P53基因的腺病 毒治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很 快被清除，真正能够到达肿瘤组织的目的基因很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用；[2]存在安全性问题，目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插 入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。(3)转染 和表达效率低，质粒载体因为含有CpG序列，进入细胞后能够被机体沉默而不能持续高效 的表达。
非病毒载体作为肿瘤基因治疗的载体优势在于具有较高的安全性和较低的免疫 原性，并且由于肿瘤血管表皮的特殊构造，能够被动靶向肿瘤组织，目前主要应用的非病毒 载体有脂质体，多聚阳离子，树枝状高分子等，非病毒载体与DNA—般通过电荷的相互作用 形成聚阳离子复合物，由于聚阳离子复合物对细胞的毒性较大，容易形成肺部栓塞，并且与 蛋白非特异性结合，如静脉注射，不容易到达靶器官等。为减少聚阳离子的细胞毒性和增加 聚阳离子复合物的生物相溶性，可以对高分化合物进行相应的修饰，如PEG的修饰等。
由于遗传物质的变异，在一些肿瘤细胞表面高表达叶酸受体分子，叶酸受体是一 个特异的抗肿瘤药物传送靶位，在大部分来源于上皮组织的恶性肿瘤如卵巢癌，子宫内膜 癌，肾癌，乳腺癌，肺癌，结肠癌和鼻炎癌中均有高度表达，特别是妇科肿瘤，90%的卵巢癌 细胞系都有叶酸受体的高度表达，而叶酸受体在正常组织中缺失或只在极化上皮细胞的顶 点表达，所以叶酸在正常组织中通常不会积累。
因为叶酸与叶酸受体具有高亲和力，并且叶酸分子自身稳定性高，免疫原性低，与 纳米有机材料相容性好，是肿瘤靶标的理想配体。
FA-PEG-PEI纳米材料是一种理想的肿瘤靶向纳米材料。之前人们应用的 FA-PEG-PEI材料在细胞水平取得良好的效果，但是在动物体内通过系统注射时发现在质粒 浓度高的情况下形成的纳米颗粒容易发生聚沉，注射后容易导致肺部血管栓塞而致动物死 亡，由于颗粒的聚沉导致注射后不能很好的透过肿瘤血管内皮，进而不能有效靶向肿瘤器 官。叶酸配体在材料表面的丰度对材料在肿瘤部位的聚集具有一定的影响，所以选取合适 的叶酸接枝率有利于提高纳米颗粒在肿瘤部位的富集。
研究表明，外源基因表达盒与细菌质粒骨架之间的共价连接会导致外源基因的沉 默，这是造成质粒载体所携带的外源基因在体内只能瞬时表达的主要原因，也是质粒载体临床应用的主要限制因素。小环DNA(HiinicircleDNA)载体是一种自1997年发展起来的新 型的基因载体，与常用的非病毒载体质粒载体相比，小环DNA载体仅由外源基因的表达盒 构成，不含有来自细菌质粒的骨架结构。因为它仅由外源基因的表达盒构成，不含来自细菌 质粒的骨架结构，从而减少了 CpG模序甲基化所致的免疫反应，提高了安全性；而且更有效 的提高了转基因的表达和生物利用度。发明内容
本发明的目的是提供一种非病毒载体和非病毒载体及其制备方法与应用。
本发明提供的非病毒载体，是聚乙烯亚胺与式V所示化合物共混而得的纳米颗 粒。
其中，m= 145，η为小于m的正整数；式V所述化合物的相对数均分子量为20600， 分子量分布为1.73。
该非病毒载体中，所述纳米颗粒的粒径为70-90纳米；所述聚乙烯亚胺与式V所 示化合物的摩尔比为10-15 85-90 ；所述聚乙烯亚胺的分子量为25kDa ；共混的温度为 20-30°C，共混的时间为15-20分钟。
本发明提供的制备上述非病毒载体的方法，包括如下步骤将聚乙烯亚胺与式V 所示化合物进行共混，得到上述非病毒载体。
该方法中，所述聚乙烯亚胺与式V所示化合物的摩尔比为10-15 85-90;所述聚 乙烯亚胺的分子量为25kDa ；共混的温度为20-30°C，共混的时间为15-20分钟。
本发明还提供了一种药物，其中，该药物的载体是上述本发明提供的非病毒载体。
该药物包括上述本发明提供的非病毒载体和包裹在所述非病毒载体中的治疗性 的DNA ；所述药物的靶向肿瘤为叶酸受体FRa高表达的肿瘤；所述药物能被动靶向的肿瘤 为叶酸受体FRa阴性表达的肿瘤和心脏。
本发明提供的制备上述药物的方法，包括如下步骤
1)往治疗性的DNA中加入浓度为10-50克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所 述葡萄糖溶液的终浓度为5-10克/100毫升，所述治疗性的DNA的终浓度为0-50 μ g/mL,不 包括0，得到DNA稀释液；
往所述非病毒载体中加入浓度为10-60克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所 述葡萄糖溶液的终浓度为5-10克/100毫升，所述非病毒载体的终浓度为0-5μ g/ml，不包 括0，得到非病毒载体稀释液；
2)将步骤1)得到的非病毒载体稀释液与DNA稀释液等体积混勻，室温静置孵育后 浓缩，得到本发明提供的药物。
该方法的步骤1)中，任一所述葡萄糖溶液的终浓度优选为5克/100毫升，所述治 疗性的DNA的终浓度优选为20 μ g/mL ；所述非病毒载体的终浓度优选为0. 39 μ g/ml。
所述步骤2、中，孵育的时间为15-30分钟，优选15分钟；浓缩步骤是用超滤杯进 行浓缩的；所述超滤膜的截留分子量为30-90kDa。
此外，本发明提供的式V所示化合物，是按照如下流程制备得到的
οH^nH^oh(fa>HOOCO(a) + HO-N ]★ rHN-^V-VNH-0H2NW^ VVV)(式 I)HOOCO ^r-J<b) I + H2N SH
权利要求
1.式I所示化合物，
2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，包括如下步骤在惰性气氛中，将叶酸与 三乙胺混勻至完全溶解后，在避光及惰性气氛的条件下，再加入N羟基琥珀酸胺酯和N， N' - 二环己基碳二亚胺进行反应，得到权利要求1所述化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述叶酸、三乙胺的摩尔比为 2-2.5 30-40，优选2. 26 36，反应温度为25_30°C，优选，反应时间为12-16小时， 优选14小时；所述N羟基琥珀酸胺酯与叶酸的摩尔比为2-2. 5 2-2. 5，优选2. 2.26， N, N' -二环己基碳二亚胺与叶酸的摩尔比为的2-2. 5 2-2.5，优选2. 2. 4，反应时 间为45-50小时，优选48小时；反应温度为25-30°C，优选；反应介质选自无水二甲基 亚砜和无水N，N- 二甲基甲酰胺中的至少一种。
4.式II所示化合物，
5.一种制备权利要求4所述化合物的方法，包括如下步骤在避光及惰性气氛的条件 下，将权利要求1所述化合物与三乙胺、2-巯基乙胺盐酸盐进行反应，得到权利要求4所述 化合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述权利要求1所述化合物与2-巯基乙 胺盐酸盐的摩尔比为0.55-0. 60 0.60-0. 65，优选0.56 0. 62 ；所述三乙胺与2-巯基乙 胺盐酸盐的用量比为2mL-4mL 60mg-80mg ；反应温度为25_30°C，优选^°C，反应时间为 15-20小时，优选18小时；反应介质选自无水二甲基亚砜和无水N，N- 二甲基甲酰胺中的至 少一种。
7.式III所示化合物
8. 一种制备权利要求7所述化合物的方法，包括如下步骤将权利要求4所述化合物、 式IV所示化合物与三乙胺进行反应，得到权利要求7所述化合物；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述权利要求4所述化合物与式IV所示 化合物的摩尔比为0. 112-0. 118 0. 055-0. 060，优选0. 115 0. 057 ；所述三乙胺与所述 式 IV 化合物的用量比为 0. OlmL-O. 03mL 0. 055mol_0. 060mol，优选 0. 02mL 0. 057mol ； 反应温度为30-40°C，优选35°C ；反应时间为45-50小时，优选48小时；反应介质为pH值 为7. 2 7. 4的磷酸盐缓冲溶液；其中，所述磷酸盐缓冲溶液中，NaCl的浓度为137mmol/L， KCl 的浓度为 2. 7mmol/L, Na2HPO4 的浓度为 4. 3mmol/L, KH2PO4 的浓度为 1. 4mmoV。
10.式V所示化合物，
11.根据权利要求10所述的化合物，其特征在于式V所述化合物的相对数均分子量 为20600，分子量分布为1. 73。
12.—种制备权利要求10或11所述化合物的方法，包括如下步骤将权利要求7所述 化合物与式VI所示化合物进行反应，得到权利要求10或11所述化合物；NH2 NH2(式 VI)式^中，m= 145，η为小于m的正整数，式VI所示化合物的相对数均分子量为 25000Dao
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述权利要求7所述化合物与式VI所 示化合物的质量比为56-60 315-325，优选59. 6 320 ；反应介质选自二甲基亚砜和N， N-二甲基甲酰胺中的至少一种；反应的温度为30-40°C，优选35°C ；反应的时间为6_48小 时，优选48小时。
14.一种非病毒载体，是聚乙烯亚胺与权利要求10或11所述化合物共混而得的纳米颗粒。
15.根据权利要求14所述的载体，其特征在于所述纳米颗粒的粒径为70-90纳米；所述聚乙烯亚胺与权利要求10所示化合物的摩尔比为10-15 85-90;所述聚乙烯亚胺的分 子量为25kDa ；共混的温度为20-30°C，共混的时间为15-20分钟。
16.一种制备权利要求14或15所述非病毒载体的方法，包括如下步骤将聚乙烯亚胺 与权利要求10或11所述化合物进行共混，得到所述非病毒载体。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述聚乙烯亚胺与权利要求10或11 所述化合物的摩尔比为10-15 85-90 ；所述聚乙烯亚胺的分子量为25kDa ；共混的温度为 20-30 0C，共混的时间为15-20分钟。
18.—种药物，其特征在于所述药物的载体是权利要求14或15任一所述非病毒载体。
19.根据权利要求18所述的药物，其特征在于所述药物包括权利要求14或15任一 所述非病毒载体和包裹在所述非病毒载体中的治疗性的DNA。
20.根据权利要求18或19所述的药物，其特征在于所述药物的靶向肿瘤为叶酸受体 FRa高表达的肿瘤；所述药物能被动靶向的肿瘤为叶酸受体FRa阴性表达的肿瘤和心脏。
21.一种制备权利要求18-20任一所述药物的方法，包括如下步骤1)往治疗性的DNA中加入浓度为10-50克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所述葡 萄糖溶液的终浓度为5-10克/100毫升，所述治疗性的DNA的终浓度为0-50 μ g/mL,不包括 0，得到DNA稀释液;往所述权利要求14或15所述非病毒载体中加入浓度为10-60克/100毫升的葡萄糖 溶液，加水稀释至所述葡萄糖溶液的终浓度为5-10克/100毫升，所述非病毒载体的终浓度 为0-5μ g/ml，不包括0，得到非病毒载体稀释液；2)将步骤1)得到的非病毒载体稀释液与DNA稀释液等体积混勻，室温静置孵育后浓 缩，得到所述药物。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，任一所述葡萄糖溶液 的终浓度为5克/100毫升，所述治疗性的DNA的终浓度为20 μ g/mL ；所述非病毒载体的终 浓度为 0. 39 μ g/ml ；所述步骤2、中，孵育的时间为15-30分钟，优选15分钟；浓缩步骤是用超滤杯进行浓 缩的；所述超滤膜的截留分子量为30-90kDa。
全文摘要
本发明公开一种非病毒载体及其制备方法与应用。该非病毒载体，是聚乙烯亚胺与式V所示化合物共混而得的纳米颗粒。本发明提供的药物，其中，该药物的载体是上述本发明提供的非病毒载体。该药物包括上述本发明提供的非病毒载体和包裹在所述非病毒载体中的治疗性的DNA；所述药物的靶向肿瘤为叶酸受体FRα高表达的肿瘤；所述药物能被动靶向的肿瘤为叶酸受体FRα阴性表达的肿瘤和心脏。通过静脉注射接种有叶酸受体阳性细胞的肿瘤的荷瘤小鼠，本发明提供的非病毒载体能够携带基因特异到达肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内持续高效表达目的基因。
文档编号C07D475/04GK102030754SQ20091009308
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者张超, 高诗娟, 黄文林 申请人:中国科学院微生物研究所